張 犇， 郭 悅， 劉麗文， 郝冬冬， 王小霞， 楊 埔， 張麗珍

(1)山西大學生命科學學院， 太原 030006；2)山西農(nóng)業(yè)大學省部共建有機旱作農(nóng)業(yè)國家重點實驗室(籌)， 太原 030006)

谷子(SeteriaitalicL.)起源于中國，是亞洲干旱和半干旱地區(qū)的一種重要糧食和飼料作物。谷子是二倍體禾本科C4作物，優(yōu)良的耐旱性、較小的基因組(約515 Mb)、自花授粉和較短的生命周期，使谷子成為研究抗逆性的新型C4模式作物[1]。谷子耐旱性和水分利用效率明顯高于大多數(shù)禾本科作物，例如玉米、小麥和高粱[2, 3]，針對谷子耐旱性開展研究，揭示其分子機制，將為作物生物育種提高脅迫抗性提供潛在位點及理論支持。

土壤控水干旱脅迫與聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)處理帶來的滲透壓脅迫模擬干旱脅迫，是植物學研究中施加干旱脅迫的常見手段[4-7]。然而，PEG處理在實施過程中通常以短期處理形式存在，對植物帶來的脅迫影響迅速而強烈，與相對長期的土壤控水干旱脅迫存在區(qū)別。Kautz等[8]研究發(fā)現(xiàn)，PEG處理與缺水干旱對蘋果苗含水率及葉綠素含量等指標影響相似，但對于葉片厚度及脯氨酸含量的影響存在區(qū)別。本實驗室前期工作中，比較了隴谷16、晉谷21和冀谷39對土壤缺水脅迫的耐受區(qū)別，并開展了脅迫下，3個品種轉(zhuǎn)錄組差異分析[9]。不同品種谷子間對土壤控水干旱脅迫及PEG脅迫耐受區(qū)別是否一致，尚未見報道。谷子中短期PEG處理是否可以模擬長期缺水干旱脅迫，是谷子抗旱優(yōu)勢抗性機制研究實驗開展的基礎，尚有待進一步研究。

植物對干旱脅迫的響應是一個復雜的過程。干旱脅迫下，植物調(diào)整脫落酸(abscisic acid，ABA)及ROS(reactive oxygen species)信號通路，調(diào)控脅迫響應基因表達，通過積累滲透物質(zhì)、調(diào)整氣孔運動與光合作用水平、調(diào)整水分吸收及生長發(fā)育等生理活動對脅迫作出響應[10, 11]。在分子水平，參與植物干旱脅迫響應的基因較多。真核生物細胞中存在一類蛋白質(zhì)可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(soluble-N-ethylmaleimide-sensitive-factor accessory-protein receptor，SNARE)，它的主要功能為在膜泡運輸過程中介導轉(zhuǎn)運泡膜與靶膜融合，并參與調(diào)控植物細胞板的形成、向重力性和離子運輸?shù)然顒覽12]。根據(jù)SNARE基序的氨基酸序列特征，把SNARE復合體核心結(jié)構(gòu)中含有谷氨酰胺的蛋白質(zhì)稱為Q-SNARE，含有精氨酸的稱為R-SNARE[13]。在不同植物中大量存在的SNARE基因，提示這一家族基因在植物適應陸生生活，應對脅迫響應中的重要作用[14]。在擬南芥中，Q-SNARE蛋白質(zhì)SYP121參與ABA處理下的離子通道調(diào)控，影響植物氣孔運動及干旱脅迫響應[15, 16]。進一步機制研究揭示，SYP121從影響亞細胞定位及通過直接相互作用提高活性2個角度調(diào)控鉀離子通道，并進而影響植物脅迫響應[17-20]。SYP41-SYP61蛋白質(zhì)復合體參與植物對鹽及滲透壓脅迫耐受，后者直接參與調(diào)控細胞質(zhì)膜水孔通道轉(zhuǎn)運及活性[21, 22]。R-SNARE又稱囊泡相關膜蛋白(vesicle associated membrane proteins，VAMP)，可進一步分為Sec22、YKT6和VAMP7三組[23]。其中，對于VAMP7蛋白的研究較深入。在擬南芥中，抑制Vamp71基因表達影響氣孔關閉，提高植物對鹽脅迫耐受[24, 25]。Zhang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，VAMP721與鉀離子通道具有直接相互作用，并抑制通道活性，提示VAMP7蛋白參與鉀平衡并極有可能進一步影響植物氣孔運動及干旱響應。結(jié)合上述對Q-SNARE的研究，SYP121-SYP41/SYP61-VAMP711/721所形成的SNARE復合體，對離子通道及水孔通道的調(diào)控在植物對干旱、鹽等非生物脅迫響應中發(fā)揮關鍵作用。在作物中，VAMP7蛋白在非生物脅迫中的作用也有報道。在大豆中，Sun等[27]研究發(fā)現(xiàn)，GsVAMP72高度參與調(diào)節(jié)植物對鹽和ABA脅迫的響應。在小麥中，干旱和鹽脅迫都能誘導TaVamp714上調(diào)表達[28]。在花生中，AdVamp18、AdVamp21、AdVamp14和AdVamp5被預測在花及種子形成過程中可能發(fā)揮著重要作用[29]。在本實驗組前期工作中，基于水稻及擬南芥基因信息，篩選鑒定了谷子中SNARE家族基因，并初步分析了它們對于非生物脅迫的響應[30]。在苗期缺水干旱下，谷子中SiVamp711、SiVamp721、SiVamp722和SiVamp726表達上調(diào)，SiVamp713與SiVamp727表達下調(diào)[30]。PEG處理下，SiVamp7基因是否具有類似響應尚不清楚。本研究將進一步測定PEG處理下，SiVamp7基因水平變化，通過與缺水干旱結(jié)果比較，從SiVamp7基因響應角度分析2種干旱處理的區(qū)別。

本研究選取山西、甘肅、河北、山東等省的代表性谷子品種隴谷16、晉谷21、冀谷39、大同40和濟谷22，采用土壤控水干旱脅迫和PEG模擬干旱脅迫對谷子幼苗進行處理，研究谷子苗期在2種干旱脅迫下的 生理響應與抗旱表現(xiàn)的異同。晉谷21是山西省谷子的主栽品種，在山西省谷子生產(chǎn)上占主導地位，其干旱脅迫抗性在測試品種中居中[31]。本研究進一步測定晉谷21中SiVamp7家族基因?qū)Σ煌珊得{迫的響應，及其與谷子鉀離子通道的選擇性互作，為谷子干旱脅迫機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 谷子培養(yǎng)及脅迫處理手段

本研究的5種供試種子品種分別為隴谷16、晉谷21、冀谷39、大同40和濟谷22，所有材料均為山西大學生命科學學院張麗珍教授課題組提供并且僅用于研究使用。

將種子播撒于營養(yǎng)土與蛭石1∶1的固體混合物中，置于23～26 ℃，50 000 Lux光照，16 /8 h光周期，30%～50%相對濕度的溫室條件下生長4 d，將長勢一致的雙葉期幼苗移至新的育苗盆，每盆3株。幼苗繼續(xù)生長14 d，一組停止?jié)菜?4 d進行土壤控水干旱處理。另一組轉(zhuǎn)至 1/2 MS 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，加入10% PEG6000以模擬干旱，并分別在2組中設立相應的對照組。分別取14 d后土壤控水干旱和10%PEG6000處理0 h、12 h、24 h的實驗組和對照組樣品，使用液氮速凍并存于- 80 ℃用于后續(xù)研究。

1.2 谷子生理指標檢測

谷子葉片離體失水率測定參照文獻[30, 32, 33]報道的方法。選取14 d齡谷子幼嫩葉片，平鋪在鋁箔紙上，在24～26oC室溫，30%相對空氣濕度下干燥，在標注時間點測定葉片重量。失水率按照與0 h比葉片殘留重量百分比計算。

所有谷子樣品中葉綠素，丙二醛(malondialdehyde，MDA)，谷胱甘肽(glutathione，GSH)，過氧化氫(H2O2)含量以及過氧化氫酶(catalase，CAT)和過氧化物酶(peroxidase，POD)活性均使用蘇州科銘生物科技有限公司的生化檢測試劑盒，并根據(jù)其說明書進行測定(CPL-1-G，MDA-1-Y，GSH-1-W，H2O2-1-Y，CAT-1-Y，POD-1-Y)?？扇苄缘鞍踪|(zhì)含量使用上海生工生物工程股份有限公司生產(chǎn)的試劑盒(No.C503041)，根據(jù)使用說明進行檢測。

1.3 谷子實時熒光定量PCR檢測

取脅迫下的晉谷21樣品，通過TransZolTMUP Plus RNA Kit試劑盒提取樣品總RNA，使用Easy-Script?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并以此為模板使用TransStart?Tip Green qPCR SuperMix試劑盒進行RT-qPCR檢測SiVamp7的轉(zhuǎn)錄水平。以上試劑盒均購于北京全式金生物技術有限公司。以SiAct2(Seita.8G043100)及RNA POL II(Seita.2G142700)為內(nèi)參基因[34]。本研究所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，并通過溶解曲線有無單峰來驗證其特異性(Table S1)。RT-qPCR的結(jié)果使用2-ΔΔCT方法進行分析。為減少生物學和技術差異的影響，RT-qPCR中每個樣本均使用3次生物學和3次技術重復。

1.4 酵母基于雜交的分裂泛素化系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)相互作用

酵母基于雜交的分裂泛素化系統(tǒng)(mating based Split-ubiquitin System, mbSUS)檢測蛋白相互作用參照Horaruang與Zhang論文[35]進行。SiKAT3(Seita.1G020100)與泛素化標記C-端連接作為誘餌蛋白(SiKAT3-Cub)，SiVAMP7與泛素化標記N-端連接作為獵物蛋白(NubG-SiVAMP7)。NubG與NubI作為獵物蛋白質(zhì)分別是本實驗陰性與陽性對照。誘餌蛋白與獵物蛋白分別轉(zhuǎn)入THY.AP4與THY.AP5酵母，在選擇性培養(yǎng)基上(CSM-LM用于THY.AP4，CSM-MTU用于THY.AP5)挑取菌落，經(jīng)培養(yǎng)雜交后在YPD培養(yǎng)基中生長，28 ℃培養(yǎng)過夜。接下來將YPD培養(yǎng)基上的菌落用牙簽挑取至CSM-LMTU培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)2～3 d。二倍體菌落挑取并在CSM-LMTU液體培養(yǎng)基中28 ℃，180 rpm培養(yǎng)過夜。菌液經(jīng)離心及無菌水重懸，調(diào)整濃度至OD600為1.0及0.1，分別點于CSM-LMTU培養(yǎng)基與CSM-AHLMTU培養(yǎng)基。前者經(jīng)28 ℃培養(yǎng)24 h后取出拍照，酵母生長情況表明，誘餌蛋白與獵物蛋白均成功轉(zhuǎn)入酵母中表達。后者中添加不同濃度甲硫氨酸，抑制pmet25啟動子控制下誘餌蛋白表達，以便更明顯看到生長區(qū)別，經(jīng)28 ℃培養(yǎng)48～72 h后取出拍照。為驗證蛋白質(zhì)表達，二倍體酵母CSM-LMTU液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后收獲，誘餌蛋白利用商品化VP16抗體免疫印跡試驗檢測，獵物蛋白利用HA抗體檢測。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個實驗至少有3個生物學重復，并進行隨機采樣，以確保實驗結(jié)果的準確性。采用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析，各實驗結(jié)果均以平均數(shù)±標準誤表示。利用SigmaPlot作圖。P<0.05說明差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 5種不同品種谷子在土壤控水干旱脅迫和聚乙二醇脅迫下的抗旱性表現(xiàn)一致

隴谷16、晉谷21、大同40、冀谷39及濟谷22為我國不同省份選育5種品種。為避免不同品種谷子生長周期差異對本研究帶來的干擾，本研究首先在土壤培養(yǎng)條件下培育谷子,檢測在實驗周期內(nèi)不同品種是否具有生長差異。結(jié)果正如Fig.S1所示，在實驗條件下，5個品種谷子在發(fā)芽后30 d內(nèi)生長趨勢基本一致?；谶@一結(jié)果，5個品種谷子播種在土壤中或移栽在1/2 MS液體培養(yǎng)基中，接受14 d土壤控水干旱或PEG6000模擬干旱處理24 h。結(jié)果正如Fig.1A所示，正常澆水的對照組植株直立，不萎蔫，葉片翠綠；而實驗組谷子經(jīng)過14 d干旱脅迫，各品種谷子葉片有不同程度的卷曲、干枯現(xiàn)象。干枯程度最高為隴谷16，受干旱脅迫影響最弱為大同40與濟谷22。選取這5種谷子葉片，進行離體失水率測定。結(jié)果如Fig.2所示，葉片保水能力由強到弱分別為濟谷22、大同40、冀谷39、晉谷21與隴谷16。其中，冀谷39、晉谷21與隴谷16，實驗結(jié)果與前期研究一致[30]。由以上結(jié)果可以得出，谷子抗旱能力由弱到強分別為隴谷16、晉谷21、冀谷39、大同40、濟谷22。

Fig.1 Effects of water-limiting drought and PEG6000-simulate drought stress on the growth of foxtail millet Two-week-old seedlings of five cultivars of foxtail millet were treated with stop-watering drought stress for 14 days or 10% PEG6000 simulated drought stress for 24 hours, respectively. (A) The phenotype of stop-watering drought stress; (B) Phenotypes of PEG-simulated drought stress

Fig.2 Determination of the water loss rate in detached leaves of foxtail millet Leaves of 14-day-old foxtail millet of five cultivars were dried at room temperature of 24-26 ℃ and 30% relative air humidity, and the leaf weight was measured at the marked time point (n=3). The water loss rate is calculated as a percentage of the residual weight of the blade compared to 0 hour. The results showed that the strong to weak water retention capacity of leaves was Jigu 22, Datong 40, Jigu 39, Jingu 21, and Longgu 16, respectively

選擇長勢基本一致的幼苗進行10% PEG-6000處理，以0 h為對照，脅迫處理12 h、24 h后觀察幼苗生長狀態(tài)。結(jié)果明顯看出，12 h時，隴谷16、晉谷21葉片明顯卷曲，其余品種葉片無明顯變化。脅迫24 h時，冀谷39出現(xiàn)輕微卷曲，隴谷16卷曲程度最為嚴重，大同40、濟谷22葉片變化不明顯(Fig.1B)。說明抗旱能力由弱到強分別為隴谷16、晉谷21、冀谷39、大同40、濟谷22，與土壤控水干旱脅迫下抗旱表現(xiàn)一致。

2.2 控水及聚乙二醇模擬干旱脅迫下部分谷子葉綠素含量的變化不同

干旱脅迫下植物葉綠素合成受到抑制，分解加快，光合作用受到影響[36]。在干旱脅迫條件下，能夠保持較高葉綠素含量的植物被認為具有更強的抗性。Fig.3顯示了控水及PEG模擬干旱脅迫下，5種谷子品種的葉綠素含量變化。經(jīng)過14 d的長期土壤控水干旱脅迫，隴谷16、晉谷21、冀谷39的葉綠素含量分別降低了64.3%、51.7%、39.9%；而大同40、濟谷22的葉綠素含量分別升高了63.6%、76.4%，說明大同40、濟谷22在脅迫條件下可以保持較高的光合作用速率，再一次驗證了前文中參試谷子的抗旱性。

Fig.3 Effects of water-limiting drought and PEG stress on chlorophyll contents of foxtail millet The two-week-old seedlings of five cultivars of foxtail millet were treated with water-controlling drought treatment in the soil after 14 days and simulated drought treatment with 10% PEG6000 for 24 hours. The chlorophyll contents in the leaves under the water-controlling drought treatment 0 day and 14 days (left panel) and PEG stress at 0 hour, 12 hours, and 24 hours (right panel) were measured, respectively. Each data value is expressed as mean ± standard error (n=9). The asterisk indicated that the chlorophyll content after stress significantly differed from that of the control at 0 h. *P<0.05

PEG短期脅迫12 h，除隴谷16的葉綠素維持不變，其他品種均顯著上升；脅迫24 h，各品種葉綠素含量較12 h又有所上升，顯著高于對照(0 h)。與0 h相比，脅迫24 h后，隴谷16、晉谷21、冀谷39、大同40、濟谷22的葉綠素含量分別上升36.0%、153.3%、82.8%、167.0%、74.4%。與敏感品種相比較，抗旱品種的葉綠素含量上升速度更為迅速。

2.3 控水及聚乙二醇模擬干旱脅迫下晉谷21和濟谷22的可溶性蛋白質(zhì)含量變化趨勢不同

植物對干旱脅迫的響應是一個復雜的過程，涉及眾多相關基因和信號通路的調(diào)控。作為植物內(nèi)的重要代謝副產(chǎn)物與信號物質(zhì)，活性氧與植物抗旱性強弱密切相關[10, 37]。

丙二醛作為膜脂過氧化的終產(chǎn)物，其含量高低反映了脅迫下膜脂的氧化損傷程度。正如Fig.4A所示，在不同干旱脅迫下，除濟谷22外，其余谷子葉片的MDA含量顯著提高(P<0.05)。土壤控水長期干旱下，隴谷16膜脂受損程度相對最高，其MDA含量升高201.5%，而大同40(49.2%)、濟谷22(25.4%)的膜脂受損程度相對較低。在PEG短期脅迫下，5個品種谷子幼苗的MDA含量均隨著脅迫時間延長而持續(xù)升高。與對照0 h相比，脅迫12 h時，隴谷16、晉谷21、冀谷39、大同40、濟谷22葉片中MDA含量分別上升了16.5%、44.2%、23.2%、32.4%、23.0%，此時隴谷16的膜脂過氧化程度相對較低。但24 h脅迫處理后，隴谷16葉片MDA含量急劇上升，達到83.2%，表明PEG處理24 h后隴谷16應對膜脂氧化損傷能力開始下降，這可能是造成隴谷16干旱脅迫下生長狀態(tài)最差的原因之一。

Fig.4 Effects of water control drought and PEG stress on the MDA level (A), GSH level (B), and soluble protein content (C) in foxtail millet The two-week-old seedlings of five cultivars of foxtail millet were treated with water-controlling drought treatment in the soil after 14 days and simulated drought treatment with 10% PEG6000 for 24 hours. The contents of the MDA, GSH, and soluble protein in the leaves under the water-controlling drought 0 day, 14 days, and PEG stresses at 0 hour, 12 hours, and 24 hours, respectively. Each data value is expressed as mean ± standard error (n=9). The asterisk indicated a significant difference compared with the control after stress. *P<0.05

谷胱甘肽參與抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)，可以減輕ROS對細胞的損害。前人的研究已經(jīng)證明，SO2能夠通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽穩(wěn)態(tài)來提高谷子幼苗的抗旱性[38]。在干旱脅迫下，各品種GSH含量均顯著上升(P<0.05)。其中，大同40的上升幅度最大，脅迫后GSH含量上升了3.8倍。在PEG脅迫下，各品種谷子葉片GSH含量隨脅迫時間延長而上升(P<0.05)。脅迫24 h時，與0 h相比，隴谷16、冀谷39、大同40上升幅度較大，分別上升2.5、2.8、2.7倍。

植物可以通過細胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的增加，降低滲透勢以維持水分平衡?？扇苄缘鞍踪|(zhì)水平是反應植物脅迫下滲透物質(zhì)積累的指標之一[39, 40]。癥如Fig.4C所示，土壤控水干旱脅迫下，隴谷16的可溶性蛋白質(zhì)含量無顯著變化，晉谷21、冀谷39的可溶性蛋白質(zhì)含量顯著升高，分別升高108.0%、55.3%；大同40、濟谷22的可溶性蛋白質(zhì)含量顯著降低，分別降低了48.4%、20.7%。PEG短期脅迫下，濟谷22的可溶性蛋白質(zhì)含量持續(xù)顯著上升，與0 h相比，脅迫24 h后上升了15.7%；隴谷16、晉谷21、大同40則顯著降低，與0 h相比，脅迫24 h后分別降低了36.1%、20.3%、45.3%。冀谷39的可溶性蛋白質(zhì)含量呈先上升后下降趨勢，且脅迫24 h(3.1 mg/g)后的平均含量顯著高于0 h(2.7 mg/g)。

以上結(jié)果表明，2種脅迫處理下，5種谷子干旱脅迫相關生理指標測定結(jié)果趨勢相似。但在濟谷22的MDA水平及隴谷16可溶性蛋白質(zhì)水平上，2種處理導致變化不同，表明2種處理不能簡單替換。

2.4 聚乙二醇模擬干旱脅迫下谷子抗氧化酶活性升高

活性氧的產(chǎn)生與積累，是植物在非生物脅迫下最早最快速的反應之一[41, 42]。一方面，活性氧作為第二信使參與一系列生理反應；另一方面，過度積累的活性氧也帶來對植物生長發(fā)育的不利影響。上述結(jié)果顯示，干旱脅迫下，谷子受到氧化損傷。為進一步探索干旱脅迫下不同谷子活性氧積累及清除情況，本文選擇檢測了PEG短期脅迫下樣品的H2O2積累及過氧化氫酶、過氧化物酶活性變化情況。H2O2的檢測結(jié)果顯示(Fig.5A)，隴谷16、晉谷21、大同40葉片中H2O2含量隨脅迫時間延長呈先升高后降低再升高的趨勢。植物抗氧化酶活性的高低可以反映抗旱性的強弱。PEG處理下，參試品種葉片過氧化氫酶及過氧化物酶活性均隨脅迫時間的延長呈先升高后降低的變化趨勢。其中，隴谷16、晉谷21、冀谷39、濟谷22和大同40參試谷子過氧化氫酶活性均在脅迫4 h時達到最高，分別為69.8、73.6、85.4、89.5和105 U/mg蛋白質(zhì)。對于過氧化物酶(POD)，隴谷16(158.8 U/mg蛋白質(zhì))、晉谷21(134.0 U/mg蛋白質(zhì))的POD活性在脅迫2 h時達到最高，冀谷39(181.2 U/mg蛋白質(zhì))、濟谷22(177.6 U/mg蛋白質(zhì))的POD活性在脅迫4 h時達到最高，大同40(193.3 U/mg蛋白質(zhì))的POD活性在脅迫12 h時達到最高。在整個脅迫過程中，冀谷39、大同40、濟谷22可以保持較高水平的抗氧化酶活性，不斷清除活性氧降低脅迫造成的傷害，因此，具有更強的抗旱性。

Fig.5 H2O2 accumulation and active oxygen scavenging enzyme activity changes in foxtail millet under simulated drought stress with PEG 6000 Two-week-old seedlings of five cultivars of millet were treated with 10% PEG6000 simulated drought, and the changes of H2O2 contents (A), CAT (B), and POD (C) in leaves were observed within 24 hours at intervals of 4 hours. Each data value is expressed as mean ± standard error (n=9)

2.5 控水干旱與聚乙二醇模擬干旱脅迫對谷子SiVamp7家族基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控不同

上述研究表明，長期控水干旱及短期PEG脅迫下，不同谷子耐受水平相似。但2種脅迫下，不同谷子活性氧迸發(fā)、清除及受到活性氧脅迫的生理指標變化不同。VAMP7是SNARE蛋白質(zhì)家族成員，主要表達在轉(zhuǎn)運泡膜上，參與介導SNARE復合體的形成并最終完成膜融合過程。在擬南芥中，Vamp71基因參與ABA及干旱脅迫下植物活性氧代謝及脅迫耐受過程[25, 43]。為進一步從分子生物學水平比較2種脅迫處理的區(qū)別，本文選擇在晉谷21中測定并比較2種脅迫方式下SiVamp7基因轉(zhuǎn)錄水平變化。

VAMP7蛋白在植物中普遍存在，其中小麥、水稻、擬南芥中該家族分別有23、8、12個成員[44, 45]。在前期工作中，我們發(fā)現(xiàn)谷子中存在10個SiVAMP7成員[30]。基于水稻、谷子、小麥以及模式植物擬南芥的VAMP7家族蛋白質(zhì)序列進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建與比對，谷子VAMP7蛋白質(zhì)家族可以被分成VAMP71以及VAMP72共2個亞家族，谷子SiVAMP7蛋白質(zhì)家族與水稻、小麥的親緣關系較近，而與擬南芥的親緣關系較遠(Fig.6)。

Fig.6 Protein evolution comparison of the VAMP7 family in different plants The yellow circle represents millet, the red circle represents Arabidopsis, the green triangle represents rice, and the blue diamond represents wheat. The evolution tree is divided into two branches, the red label represents the VAMP72 family, and the blue label represents the VAMP71 family

我們前期工作中，測定了14 d控水干旱脅迫下谷子晉谷21SiVamp7家族基因轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，控水干旱脅迫上調(diào)SiVamp711、SiVamp721、SiVamp722、SiVamp725與SiVamp726水平，下調(diào)SiVamp713與SiVamp727水平[30]。本研究PEG6000模擬干旱處理時間為0 h，12 h與24 h，考慮到部分基因可能受時間節(jié)律影響，本文在對照組中同樣時間點取樣對SiVamp7轉(zhuǎn)錄水平進行了實時熒光定量PCR測定。結(jié)果正如Fig.7所示，除SiVamp725受時間節(jié)律影響上調(diào)以外，其它SiVamp7基因轉(zhuǎn)錄水平在24 h內(nèi)不變。

Fig.7 Transcription levels of the SiVamp7 genes of Jingu 21 under simulated drought stress with PEG 6000 Two-week-old Jingu 21 seedlings were treated with 10% PEG6000+1/2MS (experimental group) and 1/2MS (control group), respectively, and RT-qPCR identified the transcription levels of the SiVamp7 genes in leaves at 0 hour, 12 hours and 24 hours. Each data value is expressed as mean ± standard error (n=3). The asterisk indicates that the transcription level of this gene under different treatments is significantly different from that at 0 h. *P<0.05

正如Fig.7所示，在PEG6000模擬干旱脅迫(0 h，12 h和24 h)下，SiVamp7基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化。在2種脅迫下，SiVamp721轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，而SiVamp723與SiVamp724轉(zhuǎn)錄水平均保持不變。對于其它SiVamp7基因，2種脅迫帶來的轉(zhuǎn)錄水平變化不同。短期PEG脅迫誘導SiVamp712與SiVamp713表達，而在長期控水干旱下，SiVamp713水平下降。SiVamp711僅在控水干旱下上調(diào)。SiVamp722轉(zhuǎn)錄水平在長期控水干旱脅迫下上調(diào)，在PEG處理下下調(diào)。SiVamp726在控水干旱脅迫下上調(diào)，但在PEG處理下，于12 h后誘導表達，在24 h表達水平恢復。SiVamp727僅在長期控水脅迫時下調(diào)。值得注意的是，PEG6000處理下調(diào)SiVamp725水平，提示對照組中所顯示的SiVamp725受時間節(jié)律上調(diào)在PEG模擬干旱脅迫下消失。以上結(jié)果表明，控水干旱與PEG脅迫對部分SiVamp7家族基因表達影響不同。

2.6 SiVAMP7蛋白與鉀離子通道SiKAT3間存在選擇性相互作用

在擬南芥中的研究表明，SNARE蛋白特別是VAMP7蛋白通過與鉀離子通道的相互作用影響后者活性，并進一步參與調(diào)控植物非生物脅迫響應[26, 46]。我們前期工作中，篩選鑒定了谷子細胞質(zhì)膜電壓門控鉀離子通道[47]，其中SiKAT3在谷子中不同組織不同時期，特別是葉片中表達，提示這一蛋白質(zhì)可能和擬南芥KAT1(Potassium Channel inArabidopsisThaliana1，AT5G46240)類似，參與保衛(wèi)細胞鉀吸收，并影響氣孔運動。為了進一步探索不同干旱脅迫下SiVamp7基因轉(zhuǎn)錄水平變化的意義，本文利用mbSUS法研究了SiKAT3與SiVAMP7蛋白質(zhì)的互作情況。在mbSUS法中，誘餌與獵物蛋白分別連接泛素化標記片段，蛋白質(zhì)相互作用恢復泛素化標記功能，切割獵物蛋白上連接的報告基團。該基團進入細胞核啟動報告基因表達，使得酵母可以在選擇性培養(yǎng)基上生長。該方法適用于膜蛋白互作研究，用于揭示擬南芥SNARE蛋白與鉀離子通道蛋白間的互作規(guī)律[20, 26]。結(jié)果如Fig.8所示，酵母表達SiKAT3與SiVAMP711、SiVAMP723、SiVAMP724、SiVAMP725或SiVAMP727蛋白質(zhì)在選擇性培養(yǎng)基上生長，提示存在蛋白質(zhì)相互作用，右側(cè)免疫印跡結(jié)果表明，誘餌與獵物蛋白質(zhì)在酵母中表達。結(jié)合Fig.7所示結(jié)果，脅迫下部分互作SiVamp7基因(例如SiVamp711、SiVamp724、SiVamp725、SiVamp727)表達水平變化，很可能通過影響鉀通道活性，進而參與調(diào)控谷子干旱脅迫耐受。

Fig.8 Selective interaction of SiKAT3 with SiVAMP7 proteins The mbSUS method was used to detect the interaction of SiKAT3 with SiVAMP7 proteins. SiKAT3 was connected with the ubiquitination-labelled C-terminal as the bait protein (SiKAT3-Cub), and SiVAMP7 was connected with the ubiquitination-labelled N-terminal as the prey protein (NubG-SiVAMP7). NubG and NubI were used as negative and positive controls for prey protein, respectively. Yeast results indicated that SiKAT3 grew on selective media with protein interactions with SiVAMP711, SiVAMP723, SiVAMP724, SiVAMP725, and SiVAMP727 proteins. Western blotting results are shown on the right. Bait proteins were detected using commercial VP16 antibodies, and prey proteins were detected using HA antibodies. The results showed that both bait and prey proteins were expressed in yeasts

3 討論

干旱脅迫限制植物生長，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有嚴重影響。谷子作為一種耐旱耐貧瘠的C4作物，揭示其干旱分子機制，將為作物抗旱為目的的分子育種提供理論基礎。在植物干旱脅迫相關研究中，利用PEG6000處理模擬脅迫是一種常見手段[4-7]。PEG6000帶來的根系滲透壓脅迫是植物在干旱條件下承受的脅迫之一，但實際生長環(huán)境中土壤缺水對植物生長帶來的影響要復雜得多[8]。因此，是否可以利用PEG滲透壓脅迫替代土壤缺水干旱脅迫，準確反映出植物抗旱性強弱并開展相關研究，將是加速植物干旱脅迫響應分子機制研究的關鍵。在揭示谷子抗旱分子機制過程中也極有意義。因此，本文選擇5種不同谷子品種，比較它們在控水干旱及PEG脅迫下響應，從活性氧相關生理水平指標及SiVamp7基因轉(zhuǎn)錄水平指標出發(fā)，評估了谷子對2種脅迫方式響應的異同。并進一步從與鉀離子通道互作出發(fā)，探索SiVAMP7與鉀離子通道互作，探索導致2種脅迫響應不同的潛在機制。

研究結(jié)果表明，5種谷子對2種脅迫的耐受水平一致，由弱到強分別為隴谷16、晉谷21、冀谷39、大同40、濟谷22，表明在初步評估品種抗旱性過程中可以選擇PEG模擬干旱脅迫。隴谷16在脅迫下緩解氧化損傷能力較差，葉綠素水平下降，生長受到抑制。而抗性較強的品種在維持高抗氧化能力的同時，積累可溶性物質(zhì)，有效抵消了脅迫對植物水分平衡的影響。此外，生理指標檢測也顯示，短期PEG脅迫與長期控水干旱的結(jié)果有顯著差異。結(jié)果正如Fig.3所示，與光合密切相關的葉綠素含量指標測定表明，短期脅迫下，5個品種葉綠素含量都有所上升，而在長期控水干旱下，僅有抗性較好的濟谷22、大同40葉綠素含量上升(P<0.05)。這一方面表明，由于缺水或主動應對水分缺乏環(huán)境，隴谷16、晉谷21、冀谷39在脅迫下的葉綠素水平下降(P<0.05)，表明不同品種谷子應對脅迫策略不同；另一方面，上調(diào)的葉綠素含量也進一步證明，濟谷22、大同40適應干旱環(huán)境，抗性較好。此外，正如Fig.4所示，短期脅迫導致5個品種MDA水平上升，說明細胞受到氧化損傷；而在長期控水干旱下，抗旱性較好的濟谷22中，MDA水平與對照組無顯著差異，表明在長期干旱下，濟谷22保持正常氧化平衡，適應了缺水環(huán)境。以上結(jié)果與楊娟等在PEG處理對不同品種玉米影響的研究結(jié)論相似[6]。不同脅迫下，差異生理結(jié)果表明，谷子可能通過不同的途徑響應2種處理，因此在生理水平機制研究中，2種處理不能簡單替代。

在分子生物學水平，本文比較了2種脅迫下晉谷21中SiVamp7基因轉(zhuǎn)錄水平變化。SiVAMP7是谷子SNARE蛋白家族的成員。SNARE蛋白在植物中保守，主要參與膜泡轉(zhuǎn)運過程，并在植物激素信號轉(zhuǎn)導、生物及非生物脅迫響應、向重力性形成及細胞板形成等生理和活動中發(fā)揮作用[23]。近年來研究表明，一些SNARE蛋白質(zhì)通過與離子通道直接互作，參與調(diào)控植物水分及離子平衡[20, 22]。對擬南芥Vamp7基因的研究表明，抑制Vamp71基因表達影響含H2O2膜轉(zhuǎn)運泡的運輸，導致ABA處理造成的氣孔運動受到抑制，植物對干旱脅迫敏感[24, 25]，表明這一基因家族在干旱脅迫下依賴ROS的植物響應中發(fā)揮關鍵作用。我們前期工作中，已經(jīng)初步確定谷子中存在10個SiVamp7基因，同時發(fā)現(xiàn)經(jīng)過14 d控水干旱脅迫，部分谷子SiVamp7基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化[30]。本研究探索24 h內(nèi)PEG6000模擬干旱處理對SiVamp7基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。由于植物中約30%基因轉(zhuǎn)錄水平受到晝夜時間節(jié)律影響[48]，SiVamp7基因是否在24 h內(nèi)受晝夜節(jié)律調(diào)控將影響PEG6000模擬干旱處理實驗結(jié)果。在對照無處理谷子中，0 h，12 h和24 hSiVamp7基因轉(zhuǎn)錄水平得到測定。結(jié)果如Fig.7所示，多數(shù)SiVamp7基因轉(zhuǎn)錄水平未受晝夜節(jié)律影響，只有SiVamp725水平在24 h內(nèi)上調(diào)。

正如Fig.7所示，對SiVamp7基因轉(zhuǎn)錄水平檢測表明，該基因家族對2種不同脅迫的響應不同，說明在分子生物學研究水平 不能簡單將PEG滲透壓脅迫直接視為控水干旱脅迫。谷子SiVamp712、SiVamp713基因在短期PEG滲透壓脅迫下轉(zhuǎn)錄水平上升。擬南芥中該家族同源基因主要分布在向液泡轉(zhuǎn)運的膜泡上[44]，且參與調(diào)整干旱脅迫下ROS分布[24, 25]。谷子中SiVamp71介導的向液泡ROS運輸及分布很可能在滲透壓脅迫響應過程中發(fā)揮關鍵作用。而SiVamp711僅在控水干旱下上調(diào)，SiVamp713在長期控水干旱下轉(zhuǎn)錄水平下降，提示SiVamp71基因在維持長期植物干旱脅迫下穩(wěn)態(tài)過程中具體作用不同。SiVamp722、SiVamp725、SiVamp726及SiVamp727在2種脅迫下轉(zhuǎn)錄水平變化不同，表明這些基因也可能在滲透壓脅迫及干旱脅迫中發(fā)揮不同作用。SiVamp725在對照實驗中展示出對晝夜時間節(jié)律的響應，而在PEG6000模擬滲透壓脅迫下其隨晝夜節(jié)律變化消失，提示滲透壓脅迫打破SiVamp725晝夜節(jié)律可能是影響并抑制谷子生長機制之一。綜上所述，2種脅迫處理對于植物SiVamp7基因轉(zhuǎn)錄水平影響不同，在分子生物學水平機制研究中，2種處理不能簡單替代。

值得注意的是，PEG模擬脅迫實驗采集點為0，12，24 h，而控水干旱檢測了脅迫14 d后各植物指標變化。是否PEG處理與控水干旱脅迫植物反應趨勢一致，增加PEG處理時間將獲得類似控水干旱脅迫的結(jié)果？在文獻報道PEG模擬干旱實驗中，在常見處理濃度(本文10%)下，處理時間通常在24 h以內(nèi)[4-7]，這與PEG處理帶來的滲透壓變化迅速而強烈有關。延長PEG處理時間對植物生長甚至存活影響極大。在預實驗中，本文嘗試延長PEG處理時間，結(jié)果在第3～5 d谷子葉片明顯變黃萎蔫，部分植物在轉(zhuǎn)回無PEG處理培養(yǎng)液中后也未恢復生長。因此，在現(xiàn)有實驗設置下無法獲得PEG長期處理樣品。是否調(diào)整合適的PEG6000處理濃度可以更好地模擬控水干旱過程，值得進一步研究。

植物對干旱脅迫響應是一個復雜的過程，涉及不同的生理過程。為了進一步揭示SiVamp7基因轉(zhuǎn)錄水平變化在干旱脅迫響應中的意義，本文選擇mbSUS法研究了谷子中廣泛表達的鉀離子通道SiKAT3與不同SiVAMP7互作情況。在擬南芥中的研究表明，VAMP7蛋白與鉀離子通道互作抑制后者活性，影響植物鉀吸收及氣孔運動[26]。SiKAT3在谷子葉片中表達[47]，與SiKAT3互作的SiVAMP7蛋白很可能通過擬南芥中類似機制影響鉀通道功能及氣孔運動。結(jié)果正如Fig.8所示，SiKAT3與不同SiVAMP7之間存在選擇性互作，表明VAMP7-鉀通道互作在谷子中也存在。對這一結(jié)論的探索，仍需要進一步電生理實驗，確認SiKAT3-SiVAMP7蛋白質(zhì)互作對鉀離子通道的活性影響。控水干旱與PEG模擬干旱對SiVamp7基因轉(zhuǎn)錄水平影響不同(例如與SiKAT3互作的SiVAMP725及SiVAMP727)，很可能通過影響對鉀通道的調(diào)控，最終導致植物鉀平衡及相關生長及脅迫響應指標區(qū)別。特別值得注意的是，在互作蛋白質(zhì)中，SiVAMP725在PEG處理下時間節(jié)律變化被打破，很可能通過進一步改變植物細胞鉀吸收時間節(jié)律，影響鉀平衡，抑制氣孔運動及植物生長。

綜上所述，針對5個品種谷子對長期控水干旱脅迫及短期PEG滲透壓脅迫的響應研究表明，PEG模擬干旱脅迫雖然可以用于初步篩選谷子干旱抗性，但在針對生理水平及分子生物學水平的機制研究中，2種脅迫手段不能簡單替換。