劉 旭，吳宿慧，陳小菲，張宇航，李寒冰*，唐進(jìn)法*

基于vWF/GPIb-IX-V信號(hào)通路的丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠模型活血化瘀作用及機(jī)制研究

劉 旭1，吳宿慧1，陳小菲2，張宇航1，李寒冰1*，唐進(jìn)法2*

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué) 河南省中醫(yī)藥“治未病”健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 河南省中藥臨床應(yīng)用、評(píng)價(jià)與轉(zhuǎn)化工程研究中心，河南 鄭州 450000

觀察丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠模型的影響，探討丹紅注射液調(diào)控血瘀證血小板功能的作用機(jī)制。60只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、舒血寧注射液（1.8 mL/kg）組和丹紅注射液高、中、低劑量（1.4、0.7、0.35 mL/kg）組，尾iv給予藥物干預(yù)11 d后，采用sc腎上腺素聯(lián)合冰水浴制備急性血瘀證大鼠模型，再給予藥物干預(yù)1 d后，檢測(cè)血流變指標(biāo)、凝血功能指標(biāo)，血小板活化黏附、聚集、釋放相關(guān)指標(biāo)；觀察耳廓微循環(huán)、心電圖和心尖、腹主動(dòng)脈組織病理變化；采用qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)心肌組織蛋白激酶B1（protein kinase B1，Akt1）、p38、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases1/2，ERK1/2）的表達(dá)。與空白組比較，模型組大鼠血液流變學(xué)、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）、纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）、β-血栓環(huán)蛋白（β-thromboglobulin，β-TG）、血小板第四因子（platelet factor 4，PF4）指標(biāo)顯著升高（＜0.05、0.01），6-酮-前列腺素F1α（6-keto-prostaglandin F1α，6-keto-PGF1α）、耳廓微循環(huán)血流量顯著降低（＜0.01），心肌組織p-Akt1、p-ERK1/2、p-p38蛋白表達(dá)以及、、基因表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01）。與模型組比較，丹紅注射液能夠不同程度地降低血液流變學(xué)指標(biāo)、vWF、FN、TXB2、β-TG、PF4（＜0.05、0.01），升高6-keto-PGF1α（＜0.05、0.01），顯著提高凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）值（＜0.05、0.01），保護(hù)心臟，增加耳廓微循環(huán)血流量（＜0.05）。心尖、腹主動(dòng)脈組織HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠心肌、血管內(nèi)膜出現(xiàn)輕微損傷，彈力纖維破壞，由于斑塊脫落導(dǎo)致開(kāi)始出現(xiàn)空泡；丹紅注射液組大鼠心肌、血管內(nèi)膜和內(nèi)皮細(xì)胞以及彈力纖維顯著改善。丹紅注射液可以恢復(fù)血液流變學(xué)、凝血功能，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞功能，通過(guò)調(diào)控vWF/GPIb-IX-V介導(dǎo)的信號(hào)通路及血小板功能，對(duì)大鼠急性血瘀有較好的保護(hù)和治療作用。

丹紅注射液；急性血瘀；心血管疾病；血小板功能；血管性血友病因子；表面受體糖蛋白Ib-IX-V

血瘀證為中醫(yī)常見(jiàn)證候，是瘀血內(nèi)阻，以疼痛、腫塊、出血、瘀血為主要表現(xiàn)的病證，凡離開(kāi)經(jīng)脈之血不能及時(shí)消散和瘀滯于某一處，停留體內(nèi)使得血運(yùn)不暢，或血流循行遲緩不流暢，郁積于經(jīng)脈或器官之內(nèi)呈凝滯狀態(tài)均為瘀血[1]。微循環(huán)障礙是血瘀證的基本病理變化和客觀指標(biāo)[2]，當(dāng)凝血功能出現(xiàn)障礙時(shí)，會(huì)造成明顯的微循環(huán)障礙，血流緩慢[3]。血小板的活化、聚集和釋放是造成血瘀的重要生理和病理基礎(chǔ)，血液在組織器官中呈瘀滯狀態(tài)[4]，血小板的活化、聚集、釋放等功能增強(qiáng)，均會(huì)使血液處于高凝狀態(tài)，血行不暢，形成血栓。血小板功能活化和瘀血最終都會(huì)導(dǎo)致血瘀證。血瘀會(huì)阻礙氣血運(yùn)行，導(dǎo)致氣血運(yùn)行緩慢，如果血瘀長(zhǎng)期得不到有效的治療，會(huì)在局部形成腫塊。還會(huì)導(dǎo)致心臟供血不足，長(zhǎng)此以往，會(huì)逐漸發(fā)展為冠心病，引起胸悶、疼痛等癥狀?，F(xiàn)代研究表明血小板功能障礙是造成心血管疾病的重要因素之一，而且由于其調(diào)控機(jī)制復(fù)雜、藥物的作用靶點(diǎn)繁多等原因，目前關(guān)于血小板功能的相關(guān)研究已經(jīng)成為如何治療心血管疾病的關(guān)鍵。其中，中藥抗血小板的作用顯著[5]。

丹紅注射液是一種中藥注射劑，主要由丹參、紅花組成。丹參性苦、微寒，歸心、肝經(jīng)，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功效；紅花辛、溫，歸心、肝經(jīng)，具有活血通經(jīng)、散瘀止痛的功效[6-8]；二者合用，是近代醫(yī)家常用的經(jīng)典藥對(duì)，常用于治療“胸痹”等心血管疾病[9]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹紅注射液具有抗凝[10]、抗炎、抗氧化、調(diào)血脂、促血管新生的功效[11-12]，但其對(duì)治療血瘀和抗血小板功能的作用機(jī)制研究未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道，本課題組前期成功建立了基于抗凝血活性的丹紅注射液生物效價(jià)的測(cè)定方法，明確了丹紅注射液抗凝血活性可作為其質(zhì)量評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)[13]，在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)建立急性血瘀大鼠模型，在整體上探討丹紅注射液活血化瘀作用的特點(diǎn)，并圍繞抗凝和抗血小板功能，從分子水平上還原丹紅注射液治療血瘀及抗血小板功能的作用機(jī)制，為丹紅注射液臨床治療血瘀證及心血管疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，6周齡，體質(zhì)量170～200 g，由浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（浙）2019-0001，合格證號(hào)20211117Aazz0619000332。動(dòng)物于標(biāo)準(zhǔn)化室溫（22±2）℃、相對(duì)濕度（55±5）%、12 h晝夜交替的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)DWLLGZR202202018）。

1.2 藥品與試劑

丹紅注射液（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20026866，10 mL/支，批號(hào)21051006）購(gòu)自山東丹紅制藥有限公司；舒血寧注射液（國(guó)藥準(zhǔn)字Z14021871，批號(hào)21061911，10 mL/支）購(gòu)自朗致集團(tuán)萬(wàn)榮藥業(yè)有限公司；氯化鈉注射液（國(guó)藥準(zhǔn)字H41023828，批號(hào)A22040405A）購(gòu)自河南科倫藥業(yè)有限公司；鹽酸腎上腺素注射液（國(guó)藥準(zhǔn)字H31021062，批號(hào)10210406，1 mL/支）購(gòu)自上海禾豐制藥有限公司；戊巴比妥鈉（批號(hào)TP20160910）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；多聚甲醛（批號(hào)CR2103050）購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司；活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）測(cè)定試劑盒（批號(hào)STY50201-48-5）、凝血酶時(shí)間（thrombin time，TT）測(cè)定試劑盒（批號(hào)STY50301-39-4）、凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）測(cè)定試劑盒（批號(hào)STY50101-38-3）、纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)IB）測(cè)定試劑盒（批號(hào)STY50401-31-2）購(gòu)自泰州中勤世帝生物技術(shù)有限公司；纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）ELISA試劑盒（批號(hào)Jul 2022）、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）ELISA試劑盒（批號(hào)Jul 2022）、6-酮-前列腺素F1α（6-keto-prostaglandin F1α，6-keto-PGF1α）ELISA試劑盒（批號(hào)Jul 2022）、血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）ELISA試劑盒（批號(hào)Jul 2022）、β-血栓環(huán)蛋白（β-thromboglobulin，β-TG）ELISA試劑盒（批號(hào)Jul 2022）、血小板第四因子（platelet factor 4，PF4）ELISA試劑盒（批號(hào)Jul 2022）購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；山羊抗兔二抗（批號(hào)20000243）、蛋白激酶B1（protein kinase B1，Akt1）抗體（批號(hào)00107910）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases1/2，ERK1/2）抗體（批號(hào)00095149）；p-ERK1/2抗體（批號(hào)00106696）、p-Akt1抗體（批號(hào)00092705）、p-p38抗體（批號(hào)00105889）購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；p38抗體（批號(hào)26）購(gòu)自美國(guó)CST公司；β-actin抗體（批號(hào)AA0718B8088ZJ2）購(gòu)自Bioworld公司。

1.3 儀器

SW-CJ型超凈工作臺(tái)（蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司）；SC40型半自動(dòng)凝血分析儀（泰州中勤世帝生物技術(shù)有限公司）；SD-100型動(dòng)態(tài)血沉/壓積測(cè)試儀（北京賽科希德科技股份有限公司）；PeriFlux System 5000型激光多普勒微循環(huán)系統(tǒng)（瑞典百靈威Perimed公司）；BL420F型生理記錄儀（成都泰盟科技有限公司）；Fresco 17型高速冷凍離心機(jī)、QuantStudio 7 FleX實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；ChemiDocTM MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)、PowerPac Universal電泳儀電源（美國(guó)Bio-Rad公司）；LabCycler型PCR擴(kuò)增儀（SensoQuest公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥

動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為空白組、模型組、舒血寧注射液（1.8 mL/kg）組和丹紅注射液高、中、低劑量（1.4、0.7、0.35 mL/kg，分別相當(dāng)于臨床劑量的2、1、0.5倍）[14]組，每組10只。各給藥組每日9: 00時(shí)尾iv藥物，空白組和模型組尾iv等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥11 d后開(kāi)始造模，空白組sc生理鹽水，其余各組sc鹽酸腎上腺素（0.8 mg/kg），2 h后將各組大鼠置于0～4 ℃冰水中游泳5 min，擦干背毛，2 h后再次sc鹽酸腎上腺素（0.8 mg/kg），造模后各組禁食不禁水12 h以復(fù)制急性血瘀模型。第12天給藥30 min后，ip 2%戊巴比妥鈉（3 mL/kg）麻醉，觀察耳廓微循環(huán)、心電圖；腹主動(dòng)脈取血，檢測(cè)血液流變學(xué)指標(biāo)、凝血功能指標(biāo)，解剖后取心尖及以上1 cm組織、腹主動(dòng)脈組織。

2.2 大鼠一般狀態(tài)觀察

實(shí)驗(yàn)期間，每天給予充足飼料及飲水，使各組大鼠體質(zhì)量呈穩(wěn)態(tài)增長(zhǎng)，每日觀察各組大鼠體質(zhì)量變化。造模后對(duì)大鼠毛色、精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、排便情況、進(jìn)食飲水情況、邊緣耳廓瘀點(diǎn)情況等均進(jìn)行觀察。

2.3 血液流變學(xué)指標(biāo)測(cè)定

末次給藥30 min后，大鼠ip 2%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血，肝素鈉抗凝，室溫靜置20 min后，采用血液流變測(cè)試儀檢測(cè)1/s、5/s、50/s、100/s、200/s切變率下的全血黏度。使用一次性使用負(fù)壓采血管（枸櫞酸鈉1∶4）抗凝，動(dòng)態(tài)血沉/壓積測(cè)試儀測(cè)定血沉，血沉測(cè)定結(jié)束后，3000 r/min離心30 min，測(cè)定紅細(xì)胞壓積。

2.4 凝血功能指標(biāo)測(cè)定

大鼠麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，一次性使用負(fù)壓采血管（枸櫞酸鈉1∶9）抗凝，3500 r/min離心10 min，取上層血漿用于APTT、PT、TT、FIB的測(cè)定。

2.5 心電圖測(cè)定

將麻醉后的大鼠仰臥固定于大鼠固定板上，采用生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，記錄心電的5個(gè)電極一端與信號(hào)采集與處理系統(tǒng)硬件相連接，另一端夾子分別夾在穿過(guò)大鼠右前肢（紅）、左前肢（黃）、右后肢（黑）、左后肢（綠）及胸部（白）皮下的針式電極上，記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體導(dǎo)聯(lián)——II導(dǎo)聯(lián)心電圖，每只大鼠穩(wěn)定后記錄2 min。軟件參數(shù)設(shè)置為：采樣頻率1 kHz，量程2 mV，放大濾波器100 Hz。

2.6 耳廓血流量監(jiān)測(cè)

使用激光多普勒系統(tǒng)測(cè)定耳廓血流量，血流儀先進(jìn)行20 min預(yù)熱并用校準(zhǔn)液進(jìn)行校準(zhǔn)，選用多普勒血流探頭固定于俯臥大鼠右側(cè)距耳廓邊緣5 mm光滑平坦處雙面膠固定，血流儀將采集的信號(hào)轉(zhuǎn)換成灌注量單位（perfusion unit，PU），采用配套軟件進(jìn)行PU值曲線的輸出、記錄，取穩(wěn)定的1 min曲線值的平均值作為其耳廓血流量值。

2.7 腹主動(dòng)脈、心臟組織病理學(xué)觀察

取各組大鼠腹主動(dòng)脈、心臟，經(jīng)過(guò)4%多聚甲醛固定、脫水透明后石蠟包埋，切片（厚1 mm）后進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察并拍照，利用CaseViewer軟件進(jìn)行分析。

2.8 血清中FN、vWF、TXB2、6-keto-PGF1α、β-TG和PF4含量測(cè)定

各組大鼠腹主動(dòng)脈取血后，室溫自然凝固30 min，3000 r/min離心20 min，取上層血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定FN、vWF、TXB2、6-keto-PGF1α、β-TG和PF4含量。

2.9 心肌組織Akt1、p38和ERK mRNA表達(dá)檢測(cè)

取各組大鼠心肌組織，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列：上游引物5’-GAGCCACCAATCCA-CACAGA-3’，下游引物5’-AGACCTCTATGCCAA-CACAGT-3’；上游引物5’-CTGGAGGACAAC-GACTATGGC-3’，下游引物5’-AGCCTCTGTGTAG-GGTCCTTCTT-3’；上游引物5’-ACCTAAAGC-CCAGCAACCT-3’，下游引物5’-GTCATTTCGTC-ATCAGTGTGC-3’；上游引物5’-GGGCA-CCAACCATTGAGCA-3’，下游引物5’-CAAGAG-CTTGTAAAGGTCCGTC-3’。

2.10 心肌組織p-Akt1、Akt1、p-p38、p38、p-ERK和ERK蛋白表達(dá)檢測(cè)

取各組大鼠心肌組織，剪碎后按加入裂解液裂解30 min，加入小鋼珠勻漿，4 ℃、14 000×離心5 min，取上清，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，100 ℃水浴10 min使蛋白變性，于?20 ℃冰箱保存。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫封閉2.5 h，糞便加入β-actin抗體（1∶5000）、Akt1抗體（1∶1000）、p-Akt1抗體（1∶1000）、ERK1/2抗體（1∶500）、p-ERK1/2抗體（1∶1000）、p38抗體（1∶1000）和p-p38抗體（1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜；加入二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，顯影后進(jìn)行Image J分析。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠一般狀態(tài)的影響

如表1所示，給藥11 d后，各組間大鼠體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模后大鼠出現(xiàn)精神不振、蜷縮不動(dòng)或活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍，弓背、聳毛、皮毛無(wú)光澤，喜扎堆、畏寒喜暖、四肢發(fā)冷、寒戰(zhàn)，爪尾部、舌部紫暗，耳廓出現(xiàn)瘀點(diǎn)紫暗（圖1），飲水、進(jìn)食量減少，大便濕爛、肛門(mén)污穢等證候表現(xiàn)，上述證候符合中醫(yī)血瘀的辨證診斷。

表1 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠體質(zhì)量的影響(, n = 10)

3.2 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠血液流變學(xué)的影響

如表2所示，與空白組比較，模型組大鼠全血黏度在1/s、5/s、50/s、100/s、200/s切變率均顯著上升（＜0.05、0.01）；與模型組比較，丹紅注射液高劑量組大鼠在1/s、5/s、50/s、100/s、200/s切變率下的全血黏度均顯著降低（＜0.01），丹紅注射液中劑量組大鼠在200/s切變率下的全血黏度顯著降低（＜0.01），舒血寧注射液組大鼠在1/s、50/s、100/s、200/s切變率下的全血黏度均顯著降低（＜0.05、0.01）。

如表3所示，與空白組比較，模型組壓積、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、卡松黏度均顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，丹紅注射液高劑量組壓積、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、卡松黏度均顯著降低（＜0.05、0.01），舒血寧注射液組卡松黏度顯著降低（＜0.05）。

箭頭表示造模后耳廓形成的瘀點(diǎn)位置

表2 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)的影響(, n = 5)

與空白組比較：*＜0.05**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01，下表同

*< 0.05**< 0.01blank group;#< 0.05##< 0.01model group, same as below tables

表3 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠血沉、壓積及血液流變轉(zhuǎn)化的影響(, n = 5)

3.3 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠凝血功能的影響

如表4所示，與空白組比較，模型組APTT、PT顯著縮短（＜0.01），F(xiàn)IB顯著增加（＜0.01）；與模型組比較，丹紅注射液各劑量組TT均顯著延長(zhǎng)（＜0.05、0.01）。

3.4 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠心電圖ST段的影響

如圖2所示，模型組大鼠Q波異常，損傷型ST段明顯抬高，心率無(wú)改變，提示出現(xiàn)心肌缺血。如表5所示，與空白組比較，模型組ST段顯著抬高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組ST段均顯著降低（＜0.05、0.01）。

表4 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠凝血四項(xiàng)指標(biāo)的影響(, n = 5)

圖2 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠心電圖的影響

表5 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠心電圖ST段的影響(, n = 5)

3.5 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠耳廓血流量的影響

如表6所示，與空白組比較，模型組大鼠PU顯著降低（＜0.01），說(shuō)明急性血瘀證模型大鼠可以導(dǎo)致耳廓局部微循環(huán)障礙；與模型組比較，各給藥組PU均顯著升高（＜0.05、0.01），表明DHI可改善急性血瘀證微循環(huán)障礙。

3.6 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠腹主動(dòng)脈病理變化的影響

如圖3所示，空白組大鼠動(dòng)脈內(nèi)、中、外膜結(jié)構(gòu)完整，層次分明，彈性纖維層結(jié)構(gòu)基本清晰，走向基本一致，排列較整齊；模型組大鼠主動(dòng)脈各層結(jié)構(gòu)松散無(wú)序，內(nèi)膜出現(xiàn)輕微損傷，彈力纖維破壞，由于斑塊脫落導(dǎo)致開(kāi)始出現(xiàn)空泡；各給藥組大鼠內(nèi)皮結(jié)構(gòu)基本完整，丹紅注射液高劑量組大鼠主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)松散無(wú)序，丹紅注射液中劑量組大鼠主動(dòng)脈結(jié)構(gòu)彈力纖維被破壞，但結(jié)構(gòu)基本清晰，與模型組相比損傷程度較低。

表6 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠耳廓血流量的影響(, n = 5)

3.7 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠心尖組織病理變化的影響

如圖4所示，空白組心肌纖維結(jié)構(gòu)排列整齊緊密，心肌及內(nèi)膜細(xì)胞連續(xù)完整，心肌細(xì)胞染色均勻，細(xì)胞核致密，無(wú)水腫，未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組可見(jiàn)心肌細(xì)胞排列稍亂，心肌纖維間隔增寬、腫脹、斷裂，出現(xiàn)空泡變性，可見(jiàn)部分肌纖維壞死，心肌細(xì)胞加寬，細(xì)胞核增大變圓。各給藥組也出現(xiàn)心肌纖維增寬，但較模型組均有不同程度的改善，空泡變性也有所改善，均趨于空白組。與模型組比較，各給藥組表現(xiàn)出較好的心肌保護(hù)作用，心肌排列較整齊，空泡現(xiàn)象輕于模型組，舒血寧注射液組和丹紅注射液高劑量組細(xì)胞核形狀趨于空白組。

圖3 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠腹主動(dòng)脈病理變化的影響 (HE, ×400)

圖4 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠心尖組織病理變化的影響(HE, ×400)

3.8 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠血清中FN、vWF、TXB2、6-keto-PGF1α、β-TG和PF4含量的影響

3.8.1 血小板活化黏附相關(guān)指標(biāo) 如表7所示，與空白組比較，模型組FN、vWF含量顯著上升（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組FN、vWF含量顯著下降（＜0.01）。

3.8.2 血小板聚集性相關(guān)指標(biāo) 如表8所示，與空白組比較，模型組TXB2含量和TXB2/6-keto-PGF1α值顯著上升（＜0.01），6-keto-PGF1α含量顯著下降（＜0.01）；與模型組比較，舒血寧注射液組和丹紅注射液中劑量組TXB2含量顯著下降（＜0.05、0.01），各給藥組TXB2/6-keto-PGF1α值顯著降低（＜0.01），6-keto-PGF1α含量顯著升高（＜0.05、0.01）。

表7 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠血清中FN和vWF含量的影響(, n = 6)

表8 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠血清中TXB2、6-keto-PGF1α含量及TXB2/6-keto-PGF1α的影響(, n = 6)

3.8.3 血小板釋放相關(guān)指標(biāo) 如表9所示，與空白組比較，模型組β-TG、PF4含量顯著上升（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組PF4含量顯著降低（＜0.05、0.01），舒血寧注射液組和丹紅注射液高、中劑量組β-TG含量顯著下降（＜0.05、0.01）。

3.9 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠心肌組織Akt1、p38和ERK mRNA表達(dá)的影響

如表10所示，與空白組比較，模型組心肌組織內(nèi)、、的mRNA表達(dá)水平均顯著上升（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組、、的mRNA表達(dá)水平均顯著下降（＜0.01）。

表9 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠血清中β-TG和PF4含量的影響(, n = 6)

表10 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠心肌組織Akt1、p38和ERKmRNA表達(dá)的影響(, n = 3)

3.10 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠心肌組織p-Akt1/Akt1、p-p38/p38和p-ERK/ERK蛋白表達(dá)的影響

如圖5和表11所示，與空白組比較，模型組心肌組織p-Akt1/Akt1、p-p38/p38、p-ERK/ERK蛋白表達(dá)水平顯著上升（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組心肌組織p-Akt1/Akt1、p-p38/p38、p-ERK/ERK蛋白表達(dá)水平均顯著下降（＜0.05、0.01）。

圖5 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠心肌組織p-Akt1/Akt1、p-p38/p38和p-ERK/ERK蛋白表達(dá)的影響

表11 丹紅注射液對(duì)急性血瘀大鼠心肌組織p-Akt1/Akt1、p-p38/p38和p-ERK/ERK蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

本研究采用注射腎上腺素模擬人體暴怒時(shí)所引起的心率加快、體溫升高的狀態(tài)，再結(jié)合冰水浴，在刺激神經(jīng)和寒邪二者共同作用下復(fù)制寒凝血瘀的模型，可很好地印證中醫(yī)對(duì)于血瘀證“寒則凝，凝則成瘀”的認(rèn)識(shí)[15-17]。寒凝血瘀是導(dǎo)致多種疾病發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)，全血黏度增加、血液流動(dòng)性減弱、凝血時(shí)間縮短、微循環(huán)障礙、血管損傷與血小板活化、釋放和聚集等均與寒凝血瘀證相關(guān)[18]。微循環(huán)是心血管系統(tǒng)在組織內(nèi)真正發(fā)揮功能的部位，微循環(huán)障礙會(huì)造成血液理化性質(zhì)的改變，使管腔狹窄，血流減慢或血栓形成，使局部組織缺血缺氧甚至壞死，引起一系列的臨床癥狀。微循環(huán)與血瘀證息息相關(guān)，臨床上常運(yùn)用活血化瘀的藥物改善微循環(huán)以達(dá)到活血通絡(luò)化瘀的功效[19]。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠的行為狀態(tài)、瘀證表現(xiàn)、TT、耳廓微循環(huán)血流量顯著減少，血液全血黏度顯著上升，以上評(píng)價(jià)指標(biāo)符合在1982年經(jīng)中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)活血化瘀委員會(huì)批準(zhǔn)的血液流變學(xué)可作為判斷血瘀證和血瘀證治療效果的依據(jù)[20]，證明血瘀證大鼠模型造模成功。與模型組比較，丹紅注射液組大鼠耳廓瘀點(diǎn)減輕，TT、全血黏度與耳廓微循環(huán)均有明顯改善，可見(jiàn)丹紅注射液有活血化瘀、通脈活絡(luò)、改善微循環(huán)、降低血黏度的效果，能從整體上改善血瘀癥狀，該作用與陽(yáng)性對(duì)照藥物舒血寧注射液有所不同，舒血寧注射液雖能夠改善微循環(huán)和血液流變學(xué)指標(biāo)[21]，對(duì)心肌和血管內(nèi)皮具有一定程度的保護(hù)作用，對(duì)血小板功能具有不同程度的改善，但卻無(wú)明顯抗凝作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，寒凝血瘀會(huì)導(dǎo)致血管收縮、血管內(nèi)皮損傷，其特征之一是TXA2與前列環(huán)素（prostacyclin，PGI2）的失衡，TXA2與PGI2的平衡狀態(tài)可維持冠脈張力和血小板內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。正常條件下，血小板功能被PGI2等抗凝物質(zhì)抑制，而在炎癥條件下，vWF與其表面受體糖蛋白Ib-IX-V（platelet glycoprotein Ib-IX-V complex，GPIb-IX-V）復(fù)合物被激活，二者結(jié)合活化整合素αIIb/β3，使其與vWF或纖維蛋白原結(jié)合，促進(jìn)血小板聚集、活化以及血栓的形成[22]，vWF能夠使血小板黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)揮止血功能，還可作為判斷血管內(nèi)皮的損傷程度及血栓風(fēng)險(xiǎn)的重要指標(biāo)[23-24]，vWF與GPIb-IX-V的結(jié)合可以誘導(dǎo)其下游的重要信號(hào)通路磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt和依賴性蛋白激酶（cGMP-dependent protein kinase，PKG）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）分子的激活[25]，即Akt和P38以及ERK的活化[26]，同時(shí)PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路可以顯著增強(qiáng)凝血因子釋放和TXA2產(chǎn)生[27]，若TXA2等促凝物質(zhì)生成增加，PGI2等抗凝物質(zhì)生成減少，進(jìn)一步促進(jìn)血管收縮、血小板活化、聚集、血栓形成等病理表現(xiàn)[28]。該病理過(guò)程刺激血小板產(chǎn)生大量的PF4、β-TG，出現(xiàn)凝血、炎癥等生理反應(yīng)[29]，形成惡性循環(huán)。TXA2由血小板微粒體合成釋放，不穩(wěn)定，其水解產(chǎn)物為穩(wěn)定的TXB2；PGI2具有較強(qiáng)的抑制血小板功能的作用，半衰期很短，一般檢測(cè)指標(biāo)為其穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物6-keto-PGF1α[30]。PF4是血小板活化的特異性指標(biāo)，血小板活化后被大量釋放，黏附于受損的血管內(nèi)皮表面[31]，促進(jìn)炎性巨噬細(xì)胞分化，抑制血管再生[32]；β-TG是血小板α顆粒內(nèi)的糖蛋白，機(jī)體缺血后β-TG被釋放至血小板外[33]，二者能夠反映血小板活性。FN可以促進(jìn)細(xì)胞的黏連生長(zhǎng)，加強(qiáng)血小板的黏附過(guò)程，在損傷的局部形成血小板血栓，具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能[34]。本研究中，模型組大鼠心肌細(xì)胞纖維斷裂、出現(xiàn)空泡和凋亡現(xiàn)象，并且腹主動(dòng)脈血管內(nèi)皮出現(xiàn)損傷，心電圖顯示模型組ST段顯著抬高，提示心肌缺血嚴(yán)重；同時(shí)，TXB2/6-keto-PGF1α值升高，PF4、β-TG、FN、vWF水平升高，vWF/GPIb-IX-V信號(hào)通路激活，其下游分子Akt1、p38、ERK水平上調(diào)，表明模型組大鼠體內(nèi)有血小板聚集、活化等病理過(guò)程。給藥后，丹紅注射液組大鼠心肌細(xì)胞纖維排列較整齊、空泡凋亡現(xiàn)象減少，對(duì)腹主動(dòng)脈血管內(nèi)皮也有不同程度的改善，心電圖恢復(fù)正常，同時(shí)，TXB2降低，6-keto-PGF1α升高，表明丹紅注射液可以保護(hù)心肌和血管內(nèi)皮細(xì)胞，減少心臟損傷、血管內(nèi)皮損傷及炎癥狀態(tài)，化瘀血生新絡(luò)，調(diào)節(jié)TXB2/6-keto-PGF1α的平衡關(guān)系，降低PF4、β-TG、FN、vWF水平，顯著下調(diào)Akt1、p38和ERK的水平，抑制GPIb-IX-V信號(hào)通路介導(dǎo)的血小板活化、聚集和釋放，發(fā)揮抗凝和抗血小板功能的作用，增加微循環(huán)血流量，維持血流正常狀態(tài)，起到治療血瘀證的效果。

本研究成功復(fù)制急性血瘀證大鼠模型，丹紅注射液能夠從整體上改善寒凝血瘀證模型大鼠中醫(yī)證候，保護(hù)細(xì)胞內(nèi)膜和纖維完整，并通過(guò)調(diào)控vWF/GPIb-IX-V下游信號(hào)通路相關(guān)蛋白及基因表達(dá)，降低vWF、FN、TXB2/6-keto-PGF1α、PF4和β-TG水平，從而保護(hù)心肌、改善凝血和血小板功能，達(dá)到治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心絞痛、心肌缺血等臨床疾病[12]的作用，為其在中醫(yī)防治血瘀證及治療心血管疾病方面提供了參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of Danhong Injection on promoting blood circulation and removing blood stasis in rats with acute blood stasis based on vWF/GPIb-IX-V signal pathway

LIU Xu1, WU Su-hui1, CHEN Xiao-fei2, ZHANG Yu-hang1, LI Han-bing1, TANG Jin-fa2

1. Henan Provincial Key Laboratory of “Prevention of Disease” Health of Traditional Chinese Medicine, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. Henan Province Engineering Research Center for Clinical Application, Evaluation and Transformation of Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China

To observe the effect of Danhong Injection (丹紅注射液) on acute blood stasis rats model, and explore the mechanism of Danhong Injection on regulating platelet function of blood stasis syndrome.A total of 60 SD rats were randomly divided into blank group, model group, Shuxuening Injection (舒血寧注射液, 1.8 mL/kg) group and Danhong Injection high-, medium- and low-dose (1.4, 0.7, 0.35 mL/kg) groups. After 11 d of drug intervention, rat model of acute blood stasis syndrome was prepared with sc adrenaline combined with ice water bath. After 1 d of drug intervention, hemorheology index, coagulation function index, platelet activation, adhesion, aggregation and release related indexes were measured; The auricle microcirculation, ECG and histopathological changes of cardiac apex and abdominal aorta were observed; The expressions of protein kinase B1 (Akt1), p38 and extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) in myocardium was detected by qRT-PCR and Western blotting.Compared with blank group, hemorheology, von Willebrand factor (vWF), fibronectin (FN), thromboxane B2(TXB2), β- thrombocyclin (β-TG), platelet factor 4 (PF4) were significantly increased in model group (< 0.05, 0.01), 6-keto-prostaglandin F1α (6-keto-PGF1α) and auricle microcirculation blood flow were significantly decreased (< 0.01), p-AKT1, p-ERK1/2 and p-p38 protein expressions and,, andgene expressions in myocardial tissue were significantly increased (< 0.01). Compared with model group, Danhong Injection decreased the hemorheological indexes, vWF, FN, TXB2, β-TG, PF4 in different degrees (< 0.05, 0.01), increased 6-keto-PGF1α and thrombin time (TT) (< 0.05, 0.01), protected heart, increased auricle microcirculation blood flow (< 0.05). HE staining results of cardiac apex and abdominal aorta showed that myocardial and vascular intima of rats in model group were slightly damaged, elastic fibers were damaged, and vacuoles began to appear due to the plaque shedding; The myocardial, vascular intima, endothelial cells and elastic fibers of rats in Danhong Injection group were significantly improved.Danhong Injection can restore hemorheology and coagulation function, improve the function of vascular endothelial cells and cardiac myocytes, and has better protective and therapeutic effects on acute blood stasis in rats by regulating platelet function mediated by vWF/GPIb-IX-V signal pathway.

Danhong Injection; acute blood stasis; cardiovascular disease; platelet function; von Willebrand factor; platelet glycoprotein Ib-IX-V complex

R285.5

A

0253 - 2670(2023)04 - 1173 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.04.017

2022-09-29

河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專(zhuān)項(xiàng)（20-21ZY1001）；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)（23IRTSTHN026）

劉 旭，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺?shí)驗(yàn)技術(shù)。E-mail: 2695350081@qq.com

李寒冰，男，博士生導(dǎo)師，教授，主要從事中藥學(xué)研究。E-mail: lhb8899@163.com

唐進(jìn)法，男，主任藥師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量評(píng)價(jià)及合理應(yīng)用。E-mail: a0519@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]