李曉琳，劉舒靜，陳子愷，孔琬，黃善情，倪曉佳，張孜，楊燁，溫預(yù)關(guān)，2，尚德為，2

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院，廣東廣州 510370；2.廣東省精神疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510000）

2018 年世界衛(wèi)生組織報(bào)告指出，中國是酒精消費(fèi)增長(zhǎng)速度最快的國家，酒精消費(fèi)增幅為76%[1]。2019 年對(duì)中國精神障礙患者的調(diào)查顯示酒精依賴患者的終身患病率為1.3%[2]。短暫適量飲酒對(duì)身體健康沒有造成明顯威脅，但長(zhǎng)期慢性飲酒容易引起記憶力衰退、運(yùn)動(dòng)功能受損、冠心病等，并誘發(fā)成癮[3]。飲酒導(dǎo)致的一系列相關(guān)疾病，在嚴(yán)重?fù)p害身心健康的同時(shí)也給社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。研究表明，酒精可以影響多種受體及相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)的異常[4]。長(zhǎng)期慢性飲酒會(huì)導(dǎo)致酒精依賴，甚至成癮，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p傷。但其相關(guān)機(jī)制尚未完全明確，有研究發(fā)現(xiàn)，色氨酸作為生物體內(nèi)多種神經(jīng)活性物質(zhì)的前體，在調(diào)節(jié)神經(jīng)精神疾病中起重要作用，關(guān)于酒精暴露與色氨酸代謝的相關(guān)性被廣泛研究[5]。代謝組學(xué)是一種用于定量分析小分子代謝物的高通量分析工具，可對(duì)生物樣本如血液、尿液、組織等進(jìn)行檢測(cè)。因此，本研究從代謝組學(xué)出發(fā)，考察異常高酒精消耗中多種氨基酸代謝及神經(jīng)遞質(zhì)的差異變化，為酒精依賴機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇、乙酸胺和氨水均為高效液相色譜級(jí)，購自美國Thermo Fisher Scientfifc公司。LC30A超高效液相（日本Shimadzu 公司）；QTRAP 4500 質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher Scientfifc公司）；5425高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；ZLS-1 真空離心濃縮儀（湖南赫西儀器裝備有限公司）；BT25S 電子分析天平（德國Sartorius 公司）；BSA124S-CW 電子分析天平（德國Sartorius 公司）；XW-80A 渦旋混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～7 周齡雄性SD 大鼠20 只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量150～180 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0002。

1.3 高酒精消耗大鼠模型的建立

使用單瓶強(qiáng)迫飲酒模型（20%酒精溶液）誘導(dǎo)高酒精消耗大鼠8周[6]。誘導(dǎo)過程中，每天需測(cè)量剩余酒精的質(zhì)量，并計(jì)算大鼠的酒精消耗水平。每周稱大鼠體質(zhì)量1 次。接著使用雙瓶自愿飲酒模型（20%酒精）篩選酒精高消耗大鼠持續(xù)1周，流程為：大鼠可以自由選擇酒精或者純水溶液，為避免位置偏好，每次重新放置酒瓶和純水溶液需要更換瓶子位置。每天稱量剩余酒精和純水質(zhì)量，并計(jì)算大鼠的酒精消耗水平[酒精占比=酒精消耗量/（純水消耗量+酒精消耗量）]。

由于在動(dòng)物模型中，酒精成癮并沒有統(tǒng)一的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，為了簡(jiǎn)化模型的評(píng)價(jià)方法，參考現(xiàn)有的研究模型的建立方法，在本研究中將大鼠日酒精消耗量作為評(píng)價(jià)模型的終點(diǎn)指標(biāo)。高酒精消耗大鼠標(biāo)準(zhǔn)[7]：酒精誘導(dǎo)結(jié)束后，根據(jù)大鼠在篩選期內(nèi)1 周的酒精消費(fèi)水平，酒精占比≥45%且1 周內(nèi)超過3 d 的被歸為高酒精消耗大鼠。

1.4 樣本提取及制備

在酒精誘導(dǎo)開始前及8 周后分別進(jìn)行眼眶取血。采集大鼠眼眶血約1 mL 于含抗凝管中離心處理（2 000g，25 ℃，10 min），收集上清液至0.5 mL 離心管中，并儲(chǔ)存于-80 ℃中進(jìn)行后續(xù)處理。

大鼠樣本血清處理：600 L冰甲醇（-80 ℃預(yù)冷）加到100 μL 血漿樣本中，渦旋混勻15 s，置于-80 ℃孵化約1 h，然后離心10 min（14 000g，4 ℃）。取500 μL 上清液真空干燥濃縮2.5 h（35 ℃）。再加入100 μL 50%乙腈復(fù)溶，渦旋靜置0.5 h。再次進(jìn)行離心10 min（14 000g，4 ℃），最后取100 μL 上清移至進(jìn)樣瓶。

1.5 代謝組學(xué)檢測(cè)方法

LC30A質(zhì)譜用于多種氨基酸及神經(jīng)遞質(zhì)。色譜柱：waters XBrige amide column（4.6 mm×100 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相：（A）乙腈；（B）5%乙腈/95%水（含20 mmol乙酸銨+20mmol/L氨水，pH=9）。進(jìn)樣量5 μL，流速：0.5 mL/min。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.6 代謝組學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理是使用MS 定量軟件MultiQuantTM（AB SCIEX，美國）用于色譜峰的識(shí)別以及積分。StatTarget 是基于R 語言開發(fā)的組學(xué)統(tǒng)計(jì)分析工具，具有簡(jiǎn)單易用的界面，提供基于質(zhì)控（QC）的組學(xué)數(shù)據(jù)校正和廣泛全面的統(tǒng)計(jì)分析。校正后的數(shù)據(jù)用于結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析。

采用Metaboanalyst 平臺(tái)進(jìn)行代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)經(jīng)均值中心化及標(biāo)度化處理。多元統(tǒng)計(jì)分析包括主成分分析法（PCA）以及偏最小二乘判別分析法（PLS-DA）及正交偏最小二乘判別分析方法（OPLS-DA）進(jìn)行置換檢驗(yàn)，兩組之間的代謝物相對(duì)水平的比較顯示在熱圖層次聚類中。變量投影重要性（variable important on projection,VIP）值表示PLS-DA 中每個(gè)變量x變量對(duì)y變量的總體影響。VIP＞1 且校正后P＜0.05 的代謝物被認(rèn)為組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將識(shí)別出的獨(dú)特代謝物輸入Metaboanalyst 平臺(tái)，參考P＜0.05 及影響值（impact value,IV）＞0.1 以獲得與酒精依賴相關(guān)的顯著差異代謝途徑。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)或方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)

根據(jù)高酒精消耗模型篩選標(biāo)準(zhǔn)[7]，篩選出10 只高酒精消耗大鼠。實(shí)驗(yàn)選取第0 周（AA，對(duì)照組）和第8 周（FF，實(shí)驗(yàn)組）的大鼠血清作為自身對(duì)照進(jìn)行代謝物差異分析。

QC 樣本被用以評(píng)價(jià)分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量。本研究中所有代謝物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于30%，此外PCA 模型（圖1）顯示經(jīng)過較正后的QC 樣本具有較好的聚集性，證明代謝組學(xué)檢測(cè)方法穩(wěn)定重復(fù)性良好，數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，數(shù)據(jù)滿足于下一步的統(tǒng)計(jì)分析。

圖1 校正后樣本質(zhì)控PCA圖Figure 1 PCA diagram of sample quality control after correction

2.2 長(zhǎng)期慢性高酒精消耗大鼠血漿差異氨基酸及神經(jīng)遞質(zhì)篩選

通過考察代謝物信號(hào)校正后的RSD，最終對(duì)RSD小于15%的代謝物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。PLS-DA 模型用于比較AA 組和FF 組之間的代謝物差異（圖2A）。從OPLS-DA 的置換排列顯示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間存在明顯差異，其模型預(yù)測(cè)能力的指標(biāo)值Q2為0.935（P＜0.01）和解釋能力的指標(biāo)值R2Y為0.995（P＜0.01），結(jié)果表明模型擬合準(zhǔn)確性好。

VIP 反映了代謝物對(duì)模型的貢獻(xiàn)。根據(jù)VIP＞1，鑒定出30 個(gè)潛在差異代謝物（圖2B）。在長(zhǎng)期慢性飲酒過程中13個(gè)差異代謝物顯著上調(diào)，包括犬尿喹啉酸、色氨酸、血清素等；其余的顯著下調(diào)，包括谷氨酸、天冬氨酸等。另外繪制了Pearson相關(guān)的層次聚類熱圖分析顯示差異代謝物之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩組之間存在明顯的代謝物差異（圖2C）。

圖2 實(shí)驗(yàn)組（FF）及對(duì)照組（AA）之間的差異代謝物Figure 2 Distinctive metabolites between the experimental group（FF）and the control group（AA）

2.3 差異代謝物通路富集分析

基于30 種潛在顯著差異代謝物（表2），導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路富集分析（pathway analysis），涉及的通路如表3 所示。根據(jù)P＜0.05 及影響值IV＞0.1 的通路，篩選出4 條差異顯著的代謝途徑，其中具有較高通路影響值的通路為色氨酸代謝（P=3.56×10-2，IV=0.299 55），丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝（P=1.28×10-2，IV=0.420 68）。

表2 校正后兩組差異代謝物峰面積的比較Table 2 Comparison of peak areas of differential metabolites between the two groups after correction()

表2 校正后兩組差異代謝物峰面積的比較Table 2 Comparison of peak areas of differential metabolites between the two groups after correction()

表3 基于觀察到的代謝物差異顯著的通路途徑Table 3 Pathways with significant differences in metabolites observed

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期慢性高酒精消耗大鼠血清多種氨基酸及神經(jīng)遞質(zhì)等存在顯著差異。差異代謝物涉及多條代謝途徑，其中色氨酸代謝涉及的3 條代謝途徑（吲哚、犬尿氨酸、血清素）以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝變化較顯著。

鑒于犬尿氨酸通路代謝物的神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)毒性失衡與神經(jīng)精神疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，色氨酸代謝紊亂可能導(dǎo)致成癮的發(fā)生。血清素、犬尿喹啉酸、吲哚-3-丙酸是色氨酸代謝途徑的下游產(chǎn)物。色氨酸對(duì)谷氨酸受體具有拮抗作用，參與多種精神疾病的生物機(jī)制[8]。血清素屬于中樞興奮性遞質(zhì)，長(zhǎng)期酒精暴露使體內(nèi)血清素水平上調(diào)，導(dǎo)致機(jī)體持續(xù)處于亢奮狀態(tài)。犬尿喹啉酸作為神經(jīng)系統(tǒng)有效的保護(hù)因子，與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生存在潛在相關(guān)性[9]。有研究通過抑制酒精依賴大鼠的犬尿氨酸-3-單加氧酶的活性，提高犬尿喹啉酸的合成[10]。結(jié)合本研究結(jié)果，作為犬尿氨酸代謝途徑下游產(chǎn)物之一的3-OH-鄰氨基苯甲酸是顯著下調(diào)的，推測(cè)在長(zhǎng)期酒精暴露中大鼠可能通過抑制該酶的活性，引起犬尿喹啉酸水平上調(diào)，起到神經(jīng)保護(hù)作用。本研究結(jié)果（圖3A）顯示，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物血液中色氨酸和血清素上調(diào)，這也與朱秀清[11]研究得到的結(jié)論相似，表明在酒精依賴患者中色氨酸代謝可能依賴于色氨酸/血清素途徑。同時(shí)，研究結(jié)果顯示差異代謝物主要富集在色氨酸代謝途徑上，提示色氨酸代謝可能參與長(zhǎng)期慢性酒精消耗誘發(fā)的相關(guān)疾病機(jī)制。

圖3 顯著通路的差異代謝物變化：色氨酸代謝（A）以及谷氨酸、天冬氨酸和N-氨基甲酰基-L-天冬氨酸代謝（B）通路Figure 3 Differential metabolite changes in significant pathways: tryptophan metabolism (A) and alanine,aspartate and glutamate metabolism(B)pathways

丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝在過去研究被認(rèn)為是與酒精依賴相關(guān)的主要異常富集代謝途徑。有研究報(bào)道，酒精使用障礙患者的多個(gè)代謝途徑發(fā)生顯著改變，其中包括谷氨酸代謝、色氨酸代謝和組氨酸代謝等[12]。值得注意的是，本研究結(jié)果中，慢性高酒精消耗大鼠谷氨酸水平是顯著降低的（圖3B）。谷氨酸神經(jīng)傳遞系統(tǒng)異常涉及多種精神疾病的發(fā)病機(jī)制，對(duì)于酒精依賴患者，神經(jīng)傳遞系統(tǒng)中的谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)、相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體及代謝酶的異?？赡軈⑴c酒精依賴的潛在機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性酒精暴露會(huì)增加伏隔核細(xì)胞外谷氨酸水平[13]，推測(cè)原因之一是酒精下調(diào)了谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，突觸間隙的谷氨酸清除率降低，導(dǎo)致谷氨酸水平升高。雖然大多數(shù)研究表明，在一段時(shí)間的酒精暴露后，基礎(chǔ)谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)出現(xiàn)上調(diào)[14-16]。然而，并非所有研究都觀察到這種增加[17]。Moghaddam 等[18]研究指出，高劑量酒精暴露會(huì)抑制細(xì)胞外谷氨酸水平。在Mostofa 等[19]的研究中也得出了類似結(jié)論：高水平的酒精可以通過減弱海馬體的谷氨酸受體表達(dá)來降低谷氨酸水平。在高劑量酒精的誘導(dǎo)下，潛在解釋了在本研究中谷氨酸水平下調(diào)的部分原因。在γ-氨基丁酸（GABA）和N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDA）受體是參與酒精依賴的兩個(gè)主要受體，被認(rèn)為是異常酒精消耗的重要目標(biāo)[20-21]。結(jié)合本研究結(jié)果中，對(duì)于谷氨酸水平的下調(diào)，推測(cè)原因之一是在長(zhǎng)期且高劑量酒精消耗時(shí)，GABA 對(duì)谷氨酸能神經(jīng)傳遞的抑制作用占主導(dǎo)，從而抑制了谷氨酸的釋放。另外，雖然有研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期慢性酒精暴露小鼠在戒斷時(shí)期細(xì)胞外谷氨酸水平是增加[22]，但考慮本研究大鼠血清樣本采集時(shí)，大鼠仍處于持續(xù)的酒精消耗狀態(tài)，故大鼠沒有表現(xiàn)出明顯戒斷癥狀，這也可能是沒有引起谷氨酸水平上調(diào)的另一原因。此外，在谷氨酸與谷氨酰胺代謝途徑中，谷氨酰胺合成酶參與催化谷氨酸和銨離子合成谷氨酰胺，因此本研究還考察了谷氨酰胺的變化趨勢(shì)。雖然谷氨酰胺水平在統(tǒng)計(jì)中沒有表現(xiàn)出顯著趨勢(shì)，但根據(jù)其變化趨勢(shì)，在長(zhǎng)期慢性酒精消耗大鼠中谷氨酰胺水平是升高的，故谷氨酸的下調(diào)與該通路可能有潛在相關(guān)性[23，24]，但該通路在長(zhǎng)期慢性高酒精消耗發(fā)揮的作用需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

同時(shí)，天冬氨酸也作為腦內(nèi)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一，本研究中實(shí)驗(yàn)組大鼠血液中天冬氨酸水平是顯著降低，與張紹輝等[25]在酒精依賴大鼠的結(jié)論相似。另外，Hinton 等[26]研究指出，天冬氨酸可以作為治療酒精依賴疾病的潛在生物標(biāo)記物。鑒于本研究檢測(cè)的是血液樣品，這兩種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)在腦組織內(nèi)的變化水平尚未可知。

總的來說，本研究結(jié)果從外周血清水平證實(shí)了長(zhǎng)期慢性高酒精消耗可以顯著影響某些氨基酸代謝物及神經(jīng)遞質(zhì)的水平，其顯著的代謝物特征有利于闡明異常酒精消耗的潛在分子機(jī)制。從代謝通路分析來看，色氨酸代謝途徑上代謝物的變化是顯著的，提示色氨酸代謝與異常酒精消耗存在相關(guān)性。另外，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，組氨酸代謝，精氨酸生物合成均涉及谷氨酸與天冬氨酸，這兩個(gè)指標(biāo)可能是誘發(fā)異常酒精消耗的敏感指標(biāo)[27]。由于分組間統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)可能存在偏倚，未來的研究將集中在更多的亞組分析，以盡量減少混雜效應(yīng)因素的影響。