曾文如，王東偉，邵曉奇

（廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院，廣東廣州 510006）

心力衰竭是臨床發(fā)病率和病死率較高的常見疾病之一，流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，由心肌肥厚導(dǎo)致的慢性心力衰竭（chronic heart failure,CHF）是多種心血管疾病的共同結(jié)局，也是心血管疾病死亡的主要原因，并且其發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重危害人類生命健康[1-2]。由于慢性心力衰竭的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，且不同動(dòng)物模型的心臟功能變化和觸發(fā)的信號(hào)通路也不盡相同。因而，CHF 動(dòng)物造模限制了抗心衰藥物的研發(fā)進(jìn)展[3-4]。小鼠是最常用的模擬人類疾病模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，小鼠心衰模型的建立有多種方法[5-6]，目前主要采用兩種方法：化學(xué)藥物誘導(dǎo)和物理手術(shù)。異丙腎上腺素（isoproterenol,ISO）是一種非選擇性β 受體激動(dòng)劑，通過激動(dòng)心臟β 受體，使心率加快，心肌耗氧量增強(qiáng)，引起心肌損傷，其發(fā)病機(jī)制主要與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和凋亡有關(guān)，可直接或間接作用于心肌組織，造成心肌輕度損傷，引起心肌肥厚，引起心力衰竭[7-8]。ISO 誘導(dǎo)心衰模型，具有簡(jiǎn)單、易操作、無創(chuàng)傷、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，但其缺點(diǎn)是建模時(shí)間不一致，因個(gè)體反應(yīng)性而存在差異。主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)（transverse aortic constriction,TAC）是通過定量縮窄主動(dòng)脈，模擬心臟在長(zhǎng)時(shí)間壓力和容量負(fù)荷下，轉(zhuǎn)變?yōu)樾牧λソ咚碌男募》屎馵9-10]。TAC 手術(shù)能模擬由于后負(fù)荷增加而導(dǎo)致的心肌肥厚，以及失代償轉(zhuǎn)變的慢性心衰過程，具有重復(fù)性高的優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求嚴(yán)格、學(xué)習(xí)周期長(zhǎng)、手術(shù)后死亡率高[11]。本研究采用C57BL/6 小鼠TAC 或IS O 制備小鼠CHF 模型，旨在研究?jī)煞N小鼠模型在超聲心動(dòng)圖、炎癥肥大指標(biāo)和病理等方面的差異，以及不同方法制備的CHF 動(dòng)物模型進(jìn)行心功能改變和特點(diǎn)的探討，更好地模擬臨床上不同發(fā)病原因的心衰患者，為慢性心衰的治療策略提供新的角度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6 小鼠40 只，SPF 級(jí)，雄性，8 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2020-0051。小鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物房，倫理委員會(huì)批準(zhǔn)號(hào)：gdpulacspf2017277。

1.2 藥物、主要試劑、儀器

鹽酸異丙腎上腺素（規(guī)格：5 g，貨號(hào)SIGMAI5627，Sighna 公司）；異氟烷麻醉劑（規(guī)格：100 mL，貨號(hào)R510-22-10，瑞沃德公司）；叔戊醇（規(guī)格：100 mL，貨號(hào)S140673-100 mL，上海阿拉丁）；醫(yī)用超聲耦合劑（規(guī)格：250 mL，貨號(hào)TM-100 型，天津津亞）；脫毛膏（規(guī)格：2 5 g，貨號(hào)X S-0 0 6 1，廣州科榮生物有限公司-薇婷）；氯化鈉注射液（規(guī)格：500 mL，貨號(hào)LS-366966-1，廣州源滿生物科技有限公司）；3M 醫(yī)用膠帶（規(guī)格：1.2 cm 寬3 卷/組，貨號(hào)ZJ2652，江西奧斐特商貿(mào)有限公司）；Vevo2100 小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)（Canada Visual Sonics）；3R210-06氣體麻醉機(jī)（Midmark）；SI-0256渦旋混勻器（VORTEX-GENIE）；FA2204 十萬分之一分析天平（上海市安亭電子儀器廠）。

1.3 動(dòng)物模型的建立

1.3.1 TAC 模型 隨機(jī)將小鼠分為假手術(shù)組和TAC手術(shù)組，每組各10只，小鼠進(jìn)行異氟烷氣體麻醉后，置于水平固定鼠板上，將27G 墊針置于右頭臂動(dòng)脈與左頸總動(dòng)脈之間，并將主動(dòng)脈弓結(jié)扎，隨后抽出縮窄針，用碘伏擦拭創(chuàng)面，逐層關(guān)閉胸腔，縫好皮膚，并置于暖光燈旁[6]。

1.3.2 ISO 誘導(dǎo)模型 隨機(jī)將小鼠分為正常對(duì)照組、ISO 組，每組各10 只。小鼠皮下注射劑量8 mg/mL ISO（0.1 mL/20 g），連續(xù)注射14 d，對(duì)照組小鼠給予等劑量的生理鹽水，不作其他處理[7]。

1.4 超聲心動(dòng)圖及相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

通過超聲檢查B型、M型切面，定量分析心臟功能指標(biāo)。觀察舒張期和收縮期的室間隔厚度（IVSd、IVSs）、左心室內(nèi)徑（LVIDd、LVIDs）、左心室壁厚度（LVPWd、LVPWs）、射血分?jǐn)?shù)（EF%）、短軸縮短分?jǐn)?shù)（FS%）和E/A（E 峰：左室舒張?jiān)缙诳焖俪溆某溆?，A 峰：舒張晚期心房收縮充盈的充盈峰）的變化。

1.5 炎癥因子的檢測(cè)

小鼠TAC 術(shù)后12 周和ISO 給藥14 d 后，通過qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠心臟組織中IL-1β、IL-18、TNF-α等炎癥因子的表達(dá)水平。

1.6 標(biāo)本采集與處理

TAC術(shù)后12周，連續(xù)注射ISO 2周后，收集小鼠心臟，將其中一部分冷凍于-80 ℃，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，其余心臟組織浸于4%（φ）多聚甲醛中，用于后續(xù)病理組織學(xué)分析。

1.7 病理組織學(xué)檢測(cè)

通過HE 和Masson 實(shí)驗(yàn)觀察TAC 手術(shù)和ISO給藥小鼠心臟組織中的心肌細(xì)胞的排列、炎癥浸潤(rùn)和纖維化情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPadPrism7 軟件進(jìn)行分析，兩組之間的差異比較采用非配對(duì)T檢驗(yàn)，多組間采用單向方差分析（ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲觀察

2.1.1 TAC小鼠超聲心動(dòng)圖觀測(cè) 在TAC術(shù)后第0、2、4、6、8、10、12 周，通過超聲心動(dòng)圖驗(yàn)證TAC 造模手術(shù)成功，并進(jìn)行心臟功能檢測(cè)。超聲心動(dòng)圖顯示，TAC 手術(shù)12 周心臟出現(xiàn)收縮和舒張功能障礙（圖1）。

圖1 Sham組和TAC小鼠組超聲結(jié)果圖Figure 1 Ultrasound findings in sham and TAC mice groups(n=10)

2.1.2 TAC 小鼠超聲心動(dòng)圖觀察不同時(shí)間點(diǎn)心臟的結(jié)構(gòu)和功能變化情況 結(jié)果顯示，小鼠心室壁厚度和心腔寬度隨著時(shí)間不斷變化，心室壁由薄變厚再變薄，心室腔由寬變窄再變寬，說明小鼠心臟功能從代償期向失代償期轉(zhuǎn)變，逐漸發(fā)展為心力衰竭。EF%結(jié)果顯示心臟收縮功能先升高后降低（圖2）。

圖2 TAC小鼠0～12周M-Mode胸骨旁長(zhǎng)軸切面超聲圖及EF%隨時(shí)間變化情況Figure 2 Changes of M-Mode parasternal long axis ultrasound and EF% with time in mice at 0-12 weeks(,n=10)

2.1.3 ISO 小鼠超聲心動(dòng)圖觀測(cè) 小鼠腹腔注射ISO 后第0、14 天，通過超聲心動(dòng)圖對(duì)小鼠進(jìn)行心臟功能檢測(cè)，ISO 小鼠在造模后發(fā)生了明顯的心室擴(kuò)張，心室壁變薄，并且E/A 峰比值下降，結(jié)果表明模型組小鼠心臟發(fā)生了結(jié)構(gòu)變化和功能障礙（圖3）。

圖3 Sham組和ISO小鼠超聲結(jié)果圖Figure 3 Ultrasound results of sham mice and ISO mice(n=10)

2.2 TAC模型與ISO模型小鼠一般指標(biāo)比較

2.2.1 兩種模型肥大指標(biāo)比較 與假手術(shù)組和正常對(duì)照組小鼠相比，TAC 手術(shù)組和ISO 給藥組小鼠的心臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值（HW/BW）和心臟質(zhì)量與脛骨長(zhǎng)度比值（HW/TL）明顯升高。通過觀察HE 局部放大圖發(fā)現(xiàn)ISO 和TAC 小鼠心臟肌肉長(zhǎng)度較Sham組顯著增加，表明小鼠的心臟發(fā)生肥大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HW/TL 和HW/BW 在兩種模型中變化基本一致，說明兩種造模方法都具有比較好的重復(fù)性和可靠性（圖4）。

圖4 兩組模型小鼠的HW/BW、HW/TL及HE染色、乳頭肌放大圖Figure 4 HW/BW,HW/TL and HE staining,enlarged papillary muscle of two groups of model mice(,n=10)

2.2.2 兩種模型心臟功能指標(biāo)比較

與假手術(shù)組小鼠相比，TAC 術(shù)后12 周或ISO 給藥14 d 后EF%、FS%下降，E/A 峰比值下降；左心室壁變薄同時(shí)心腔容積明顯增大，心臟發(fā)生明顯的舒張功能障礙。兩種手術(shù)后的降低程度基本一致，說明兩種造模方法都能誘導(dǎo)心衰（圖5）。

圖5 兩組模型小鼠EF%、FS%和E/A峰比值Figure 5 EF%,FS%and E/A peak ratio of two groups of model mice(,n=10)

2.2.3 兩種模型心臟室壁變化比較

假手術(shù)組小鼠心腔無明顯擴(kuò)張，室間隔厚度（IVS）和LVPW、LVID均在正常范圍內(nèi)；與假手術(shù)組小鼠相比，TAC 手術(shù)后其心臟收縮能力、室間隔厚度、左心室室壁厚度均有明顯上升，心腔微幅擴(kuò)張，表現(xiàn)出典型的向心性肥厚。并且TAC 手術(shù)12 周后左心室壁變薄，心腔容積明顯增大。而ISO給藥小鼠的心臟功能與對(duì)照組小鼠相比，存在明顯的功能紊亂并顯示出心室容積增加，室間隔厚度和左心室壁厚度有小幅下降的趨勢(shì)，這說明ISO組的小鼠存在心臟舒張功能障礙。TAC 小鼠與ISO 小鼠相比，IVS、LVPW 在收縮舒張變化不大，LVID 在舒張收縮時(shí)有顯著差異性（P＜0.01），這說明兩種不同模型誘導(dǎo)肥厚或纖維化的起始部位可能存在差異性（圖6）。

圖6 兩組模型小鼠IVS、LVPW、LVIDFigure 6 IVS,LVPW and LVID of two groups of model mice(,n=10)

2.3 兩組模型小鼠心臟組織病理學(xué)觀察

HE 染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組和正常對(duì)照組小鼠的心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核無明顯皺縮現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)正常；而TAC 組和ISO 組小鼠的心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核變大，細(xì)胞體積明顯增大，并伴隨明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。Masson染色結(jié)果表明，假手術(shù)組和正常對(duì)照組小鼠的肌纖維呈鮮紅色，而TAC組小鼠的心臟組織出現(xiàn)大面積的藍(lán)色陽性信號(hào)，發(fā)生明顯的膠原纖維沉積，ISO 模型小鼠心臟組織中也觀察到類似的現(xiàn)象。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)ISO誘導(dǎo)小鼠發(fā)病部位為心室內(nèi)壁以及右心室，而TAC 誘導(dǎo)的模型小鼠發(fā)病部位主要為乳頭肌及左心室，盡管最終計(jì)算出相同的心功能參數(shù)，兩種模型的致病機(jī)理和分子機(jī)制可能不同（圖7）。

圖7 兩組模型小鼠HE染色和Masson染色結(jié)果圖Figure 7 HE and Masson staining results of two groups of model mice(n=3)

2.4 兩組模型小鼠心臟組織中炎癥反應(yīng)的變化

與假手術(shù)組小鼠相比，TAC IL-1β、IL-18、TNF-α的mRNA表達(dá)水平升高。ISO組小鼠心臟中也觀察到類似的IL-1β升高情況，但I(xiàn)L-18、TNF-α趨勢(shì)表達(dá)相反（圖8）。

圖8 兩組模型小鼠炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-18、TNF-α的表達(dá)Figure 8 Expression of inflammatory related factors IL-1β,IL-18 and TNF-α in two groups of model mice(n=10)

3 討論

小鼠動(dòng)物模型是模擬研究臨床疾病發(fā)病機(jī)理、開展藥物研制的重要依據(jù)。由于人口老齡化加劇，心血管發(fā)病率和病死率逐年上升，嚴(yán)重危害人類的生命健康。心血管疾病引起的心力衰竭往往是患者死亡的主要原因。心力衰竭是指心臟的收縮或舒張功能障礙，使心臟輸出量減少，從而導(dǎo)致心臟血液循環(huán)障礙[12]。目前，慢性心力衰竭及其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，建立和評(píng)價(jià)小鼠心衰模型意義重大。本研究通過TAC 和皮下注射ISO 建立慢性心衰模型，通過超聲心動(dòng)圖對(duì)不同造模條件下小鼠心臟功能的變化進(jìn)行評(píng)估，并通過HE染色、Masson染色和qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)對(duì)炎癥和纖維化相關(guān)標(biāo)志物的變化進(jìn)行檢測(cè)。

超聲心動(dòng)圖檢測(cè)是評(píng)價(jià)心臟功能的指標(biāo)之一。本研究連續(xù)12 周對(duì)TAC 誘導(dǎo)的小鼠進(jìn)行心功能檢測(cè)，反映小鼠心室壁厚度、心腔寬度隨時(shí)間變化等特點(diǎn)。常用HW/BW、HW/TL 的變化來評(píng)價(jià)心臟肥大的程度[13-14]，TAC 和ISO 的造模方式都對(duì)小鼠心肌肥大有明顯的誘導(dǎo)作用。但根據(jù)Masson 染色的結(jié)果，TAC 誘導(dǎo)心肌纖維化的好發(fā)部位是乳頭肌，ISO 則是心室內(nèi)壁。由于TAC 是模擬心臟后負(fù)荷增加，還原高血壓引起的心力衰竭，所以這種方法比較符合臨床上充血性心力衰竭的病理變化過程。而ISO 腹腔注射引起的心臟衰竭，盡管操作簡(jiǎn)單，但其發(fā)病機(jī)理復(fù)雜，尚需深入研究。研究表明心臟逐漸積累的炎癥是導(dǎo)致心臟衰竭的關(guān)鍵因素之一，PCR 結(jié)果顯示，炎癥因子IL-1β在兩個(gè)模型中的表達(dá)明顯增加，而ISO 誘導(dǎo)的模型中IL-18、TNF-α的表達(dá)明顯減少，考慮到兩個(gè)模型誘導(dǎo)的時(shí)間不同，纖維化部位不一致可能是炎癥信號(hào)通路不同所致。推測(cè)在心肌肥厚模型中起主導(dǎo)作用的致病因子為IL-1β，但其具體的分子機(jī)理仍需進(jìn)一步探究。炎癥是心臟多種急慢性疾病的共同致病因素。本研究表明，不同誘因引起的炎癥類型和炎癥因子不同，需要密切結(jié)合研究?jī)?nèi)容進(jìn)行課題設(shè)計(jì)。