方梓鵬，盧曉晴，李志豪，羅偉浩，石現(xiàn)麗

（廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東廣州 510006）

CRISPR/Cas 系統(tǒng)是一種最新的由RNA 指導Cas 核酸酶對靶向基因進行特定編輯的技術。該系統(tǒng)最早發(fā)現(xiàn)于細菌中，是細菌對抗噬菌體的一種適應性免疫防御機制。CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，規(guī)律間隔成簇短回文重復序列），是存在于細菌和古菌基因組內(nèi)的一段重復序列。Cas 蛋白是一種CRISPR 關聯(lián)蛋白，是一種核酸內(nèi)切酶，能與CRISPR基因轉錄編輯產(chǎn)生的RNA形成蛋白-RNA復合體。該復合體通過RNA 特異識別DNA，產(chǎn)生靶向定位和切割，進而實現(xiàn)靶向基因的敲除或者編輯。在噬菌體感染細菌的過程中，細菌會提取噬菌體的一部分DNA 片段，將其整合儲存在CRISPR 位點。之后，細菌會將CRISPR 位點轉錄加工后的RNA 與Cas 蛋白形成復合物。該復合物可以通過RNA上的特異序列（來自于噬菌體DNA的轉錄產(chǎn)物）識別再次感染細菌的噬菌體DNA，啟動Cas 蛋白對噬菌體DNA 的切割，進而阻止噬菌體在細菌中的增殖[1]。通過張鋒團隊[2]的改造，目前CRISPR/Cas 系統(tǒng)已經(jīng)成為非常成熟的基因編輯或基因敲除的工具。本研究所使用的plenti-Crispr V2 系統(tǒng)（Addgene #52961）也是張鋒團隊在2014 年開發(fā)。該質(zhì)粒包含Crispr sgRNA 和Cas9蛋白等元件，只需根據(jù)靶基因的PAM（位點）設計sgRNA 的靶序列，再根據(jù)sgRNA 靶序列設計并合成sgRNA 引物，構建plenti-Crispr V2 sgRNA 重組質(zhì)粒，即可實現(xiàn)基因敲除的目的；或者在轉染plenti-Crispr V2 sgRNA 重組質(zhì)粒的同時再轉染靶基因編碼位點對應的同源序列即可實現(xiàn)基因的編輯[2]。

ZNF703 是鋅指蛋白家族的成員之一，通過參與組蛋白去乙?；种妻D錄，屬于轉錄抑制因子；該蛋白由590 個氨基酸組成，具有1 個C2H2 型鋅指結構。ZNF703 位于人類8 號染色體上，而該染色體上的多個基因都與許多腫瘤的發(fā)生進展密切相關[3]。ZNF703 已被報道高表達于乳腺癌、頭頸癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、結腸癌等多種腫瘤中，是一種促癌因子[2，4-8]。但是，目前關于其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的功能還不明確。因此，本研究構建plenti-Crispr V2ZNF703 sgRNA 質(zhì)粒，并在HCT-116 細胞系中驗證其敲除效果，將有望為在腫瘤細胞中敲除ZNF703基因、探究ZNF703的功能打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

DL500 DNA Marker（TaKaRa，貨號：3590A）；DL15000 DNA Marker（TaKaRa，貨號3582A）；rTaq酶（TaKaRa，貨號DR100A）；10×NEB Buffer 3.1（NEB#B7203S）；10×Loading Buffer（TaKaRa，貨號9157）；核酸染色劑（Biosharp，BS356A）。

1.2 方法

1.2.1ZNF703 sgRNA 雙鏈寡核苷酸片段的制備根據(jù)GFP Web Portal-Home（broadinstitute.org）網(wǎng)頁中的CRISPpick 工具設計ZNF703 的靶序列，加上黏性末端合成ZNF703 sgRNA 的前引物和后引物（Forward primer 和Reverse primer，詳細設計過程參見結果2.1 部分）。在1.5 mL 的離心管中加入2 μLZNF703 sgRNA 前引物、2 μLZNF703 sgRNA后引物、2 μL 10×T4 Ligation Buffer、14 μL dd H2O，混勻后置于裝有1 L 95 ℃熱水的燒杯，待自然冷卻至室溫，完成退火，得到ZNF703 sgRNA雙鏈寡核苷酸片段。

1.2.2 plenti-CrisprV2 質(zhì)粒酶切回收在1.5 mL離心管中加入2.5 μL 10×NEB Buffer（r 3.1）、1 μL 1×BsmBI酶、21.5 μL plenti-Crispr V2 質(zhì)粒配制酶切體系，混勻后放置55 ℃水浴過夜。用1%瓊脂糖凝膠分離酶切產(chǎn)物，取6 μL DL15000 Marker、25 μL 酶切體系分別加入1 μL 和2.5 μL 核酸染料（SYBR Gold，Thermo Fisher，貨號：S11494），混勻上樣，電泳至適當位置后，紫外凝膠成像儀（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司創(chuàng)，SmartGel 6000）照膠，切取目的片段（12 988 bp），使用DNA 純化試劑盒（天根試劑盒DNA 純化膠回收試劑盒DP214）回收目的片段（12 988 bp）。

1.2.3 連接、轉化和克隆鑒定 在1.5 mL 離心管中配制連接體系：2 μL plenti-Crispr V2 酶切回收片段（12 988 bp）、4 μLZNF703 sgRNA 雙鏈寡核苷酸片段、1 μL T4 Buffer、0.8 μL T4 DNA Ligase、2.2 μL dd H2O，混勻放置室溫2 h。連接體系中加入100 μL DH5α感受態(tài)細胞，冰浴15 min，42 ℃水浴熱擊90 s，再冰浴10 min；加入200 μL LB 培養(yǎng)基，37 ℃220 r/min 搖床中培養(yǎng)1 h；4 000 r/min，3 min，收集菌液，將菌液均勻涂布在氨芐LB 瓊脂平板上，37 ℃，培養(yǎng)過夜。

1.2.4 單克隆鑒定 挑取單克隆，加入500 μL LB 培養(yǎng)基，37 ℃220 r/min 搖床中培養(yǎng)1 h，進行PCR鑒定，PCR 體系如下：12.5 μL rTaq 聚合酶、3 μL Template（單克隆培養(yǎng)得到的菌液）、1 μL 上游引物（Crisp-F）、1 μL 下游引物（Crisp-R）、7.5 μL dd H2O，PCR 條件：95 ℃2 min，95 ℃10 s，60 ℃30 s，72 ℃1 min，30個循環(huán)，4 ℃存放；用2%瓊脂糖凝膠鑒定，在25 μL 的PCR 體系和6 μL 的DNA marker 中分別加入2.5 μL 和1 μL 核酸染料，上樣，電泳，紫外凝膠成像儀照膠拍照。

1.2.5 測序鑒定 將上述單克隆鑒定陽性的菌種接種到5 mL含有氨芐的LB培養(yǎng)基中，37 ℃220 r/min搖床中培養(yǎng)過夜，利用天根（貨號：DP103）質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，送去生工生物工程公司進行雙向測序。測序上游引物是hU6F，測序的下游引物是Crisp-R引物。

1.2.6 細胞培養(yǎng) 利用含有10%（φ）胎牛血清（Invitrogen，10270106）和100 u/mL 青霉素/鏈霉素（Invitrogen，15140122）的DMEM（Invitrogen，12800017）培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293T，HCT-116 細胞，置于細胞培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃）中生長。

1.2.7 構建ZNF703 敲除HCT-116 細胞系 利用脂質(zhì)體2000（Invitrogen 公司，11668）將構建成功的plenti-Crispr V2ZNF703 sgRNA 質(zhì)粒和psPAX2、PMD2.G 質(zhì)粒同時轉染HEK293T 細胞，包裝病毒，分別收取質(zhì)粒轉染后48 h和72 h的病毒。提前1天將HCT-116 細胞按5×106接種到10 cm 細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜。病毒、終質(zhì)量濃度為8 μg/mL 的聚凝胺和新鮮培養(yǎng)基一起加到HCT-116 細胞中，進行感染。感染2 d 后，利用含有5 μg/mL 嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基進行篩選，篩選2～3 d后，存活下來的陽性細胞系可用于后續(xù)的鑒定。

1.2.8 利用q-PCR 驗證ZNF703 敲除效果 提前1 d將以上篩選得到的嘌呤霉素陽性的細胞和HCT-116對照細胞按3×105分別種到2 個3 cm 細胞培養(yǎng)皿中。用1×PBS 洗2 次后，分別加入300 μL Trizol（Invitrogen，15596-018），用刮子將細胞刮下來收集到1.5 mL的離心管中，充分裂解后，加入60 μL三氯甲烷，振蕩混勻，靜置分層，4 ℃條件下12 000g離心20 min ；取上清，加入等體積異丙醇，室溫靜置10 min，4 ℃條件下12 000g離心10 min；棄上清，得到RNA 沉淀。用70%（φ）酒精清洗沉淀2 次，用30 μL DEPC 處理水溶解RNA。使用nanodrop 測定RNA的濃度，使用SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒進行反轉，取400 ng 總RNA 用于反轉錄反應用（10 μL 反應體系），同時使用隨機引物（Random 6 mers）和oligo dT 引物，反應條件為：37 ℃15 min，85 ℃5 s。使用擎科生物公司的熒光定量PCR試劑2×TSINGKE?Master qPCR Mix（TSE201）進行定量PCR，mRNA 的表達量以GAPDH 作為內(nèi)參進行相對定量。引物序列如下：

ZNF703 前引物：5′-TTGGGCCTAAGCCGG TAC CAC-3′；后引物：5′-AGGCTGAAGCTAGTCTCTGT CCA-3′；GAPDH 前引物：5′-CCATGTTTGTGATGGG TGT GAA CCA-3′；后引物：5′-ACCAGTGGATGCA GGG ATG ATG TTC-3′

使用ΔΔCt法計算ZNF503 mRNA 的相對表達量，不同組之間或不同基因之間的相對表達量用公式2-ΔΔCt計算。

2 結果

2.1 ZNF703 sgRNA靶向序列的設計

利用GFP Web Portal-Home（broadinstitute.org）網(wǎng)頁中的CRISPpick 工具分別設計靶向人源ZNF703 和鼠源ZNF703 的sgRNA，得到的靶向人源ZNF703和靶向鼠源ZNF703的sgRNA 靶序列列表，取交集部分，再從中選取特異性（specificity）最高、有效性（efficiency）最好的sgRNA 靶序列。人源ZNF703 基因組序列中有2 個外顯子，鼠源zfp703（ZNF703 在鼠中的命名）基因組序列中含有3 個外顯子，所選取的特異性最高、有效性最好的一條sgRNA 靶序列能靶向人源ZNF703 或鼠源zfp703 基因組中的第一外顯子的共同序列，序列如圖1B 所示：5′-CCAAGGACACCCGAAAGCAG-3′。再根據(jù)plenti-CrisprV2 質(zhì)粒的操作說明（如圖1A），在靶序列的兩端分別加上黏性末端（如圖1B），得到ZNF703 sgRNA 的引物：前引物（F）：5′-CACCGC CAAGGACACCCGAAAGCAG-3′；后引物（R）：5′-AAACCTGCTTTCGGGTGTCCTTGGC-3′。將引物送去生工生物公司合成，并進行退火，得到可以直接用于連接的ZNF703 sgRNA 雙鏈寡核苷酸片段。

圖1 ZNF703 sgRNA引物設計Figure 1 ZNF703 sgRNA primer design

2.2 plenti-Crispr V2 質(zhì)粒酶切回收

plenti-Crispr V2質(zhì)粒的構建需要使用BsmBI限制性內(nèi)切酶，BsmBI 屬于IIs 類的限制性核酸內(nèi)切酶，會在離它的不對稱識別位點（CGTCTC）一側的下游N1 和N5 切割DNA 雙鏈，產(chǎn)生黏性末端（如圖2A）。雖然BsmBI 有特定的識別位點，但是切割位點可以不同，進而可以產(chǎn)生不同的黏性末端。在plenti-Crispr V2 質(zhì)粒中有2 個不同的BsmBI 酶切位點（如圖2B、2C），分別在2 234 bp 和4 119 bp 處，所以用BsmBI 酶切plenti-Crispr V2 可得到2 個條帶：12 988 bp 和1 885 bp；在plenti-Crispr V2 的質(zhì)粒骨架（12 988 bp）上會產(chǎn)生2 個不同的黏性末端。而與這2 個黏性末端對應的序列，在ZNF703 sgRNA 引物設計的時候已經(jīng)加到ZNF703 sgRNA靶序列的兩端，所以回收的plenti-Crispr V2 的質(zhì)粒骨架（12 988 bp）可以直接用于構建plenti-Crispr V2ZNF703 sgRNA質(zhì)粒。圖2D顯示，BsmBI酶切plenti-Crispr V2 質(zhì)粒后的1%瓊脂糖凝膠電泳圖顯示得到2 個條帶：12 988 bp 和1885 bp，符合預期。本實驗切膠回收了12 988 bp的條帶。

圖2 用BsmB I 酶切回收plenti-Crispr V2質(zhì)粒Figure 2 Purification of plenti-Crispr V2 backbone after BsmB I digestion

2.3 連接轉化得到的陽性克隆

將上述回收的plenti-Crispr V2骨架（12 988 bp）與ZNF703 sgRNA 雙鏈寡核苷酸片段通過T4 DNA連接酶連接，轉化DH5α感受態(tài)細胞，并涂于氨芐LB 瓊脂平板上，培養(yǎng)過夜后，得到氨芐篩選陽性單克隆菌落。見圖3。

圖3 plenti-Crispr V2（12 988 bp）骨架和ZNF703 sgRNA雙鏈寡核苷酸片段連接、轉化后得到的大腸桿菌陽性克隆Figure 3 Positive clone of E.coli obtained by connecting and transforming the plenti-Crispr V2 (12 988 bp) skeleton and ZNF703 sgRNA double stranded oligonucleotide fragment

2.4 菌落PCR鑒定和酶切鑒定

在重組質(zhì)粒plenti-Crispr V2ZNF703 sgRNA 質(zhì)粒的sgRNA 序列的上、下游設計菌落PCR 的引物（Crisp-F：5′-GTGGAAAGGACGAAACACCG-3′；Crisp-R：5′-CTAGGCACCGGATCAATTGC-3′（如圖4A））；用Crisp-F 和Crisp-R引物來擴增含 有ZNF703 sgRNA靶序列的DNA片段（248 bp）。并用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在上述得到的7個陽性克隆中，只有7號在248 bp處有明顯的條帶出現(xiàn)（如圖4B），初步確認7 號陽性克隆的大腸桿菌中有plenti-Crispr V2ZNF703 sgRNA 重組質(zhì)粒。取7 號大腸桿菌進行培養(yǎng)過夜、提取質(zhì)粒。為了保證結果的準確性，用提取的plenti-Crispr V2ZNF703 sgRNA 質(zhì)粒再次進行了EcoRⅠ酶切鑒定。在plenti-Crispr V2中只有1個EcoRI酶切位點，且該位點在plenti-Crispr V2ZNF703 sgRNA 重組質(zhì)粒被保存了下來，所以酶切會產(chǎn)生和質(zhì)粒大小相同的一條帶（13 013 bp）（如圖4C）。經(jīng)過以上實驗，初步得到了plenti-Crispr V2ZNF703 sgRNA重組質(zhì)粒。

圖4 plenti-Crispr V2 ZNF703 sgRNA菌落鑒定Figure 4 Colony identification of plenti-Crispr V2 ZNF703 sgRNA by colony-PCR and EcoR I digestion

2.5 質(zhì)粒測序結果

選擇重組質(zhì)粒plenti-Crispr V2ZNF703 sgRNA質(zhì)粒的sgRNA序列上游的通用引物hU6F和sgRNA序列下游的Crisp-R引物進行雙向測序（引物位置如圖5A），測序結果顯示ZNF703 sgRNA 靶序列已經(jīng)成功插入plenti-Crispr V2質(zhì)粒中。見圖5B。

圖5 plenti-Crispr V2 ZNF703 sgRNA質(zhì)粒測序Figure 5 Sequencing of the plenti-Crispr V2 ZNF703 sgRNA plasmid

2.6 在HCT-116 細胞系中，驗證plenti-Crispr V2 ZNF703 sgRNA靶向敲除ZNF703的效果

利用慢病毒包裝體系構建ZNF703 敲除的HCT-116 細胞系，利用熒光定量PCR 檢測敲除效果。q-PCR 結果顯示（圖6）和對照HCT-116 細胞相比，在ZNF703 敲除HCT-116 細胞系中，ZNF703 的敲除效果在60%以上。結果表明，所構建的plenti-Crispr V2ZNF703 sgRNA 可以特異有效地敲除ZNF703。

圖6 plenti-Crispr V2 ZNF703 sgRNA 靶向敲除ZNF703 的效果Figure 6 Effect of targeted knockout of ZNF703 by plenti-Crispr V2 ZNF703 sgRNA

3 討論

腫瘤已經(jīng)成為全世界最主要的人類致死原因之一，也是中國居民最主要的死亡原因之一。目前對于腫瘤的治療方法包括手術切除、化療、放療、靶向藥物、免疫治療等，但是由于缺乏有效的早期篩查方法，腫瘤具有復發(fā)、轉移及對化療、放療、靶向藥物產(chǎn)生抗藥性，以及對免疫治療臨床有效反應率低等，目前腫瘤仍舊是人類亟待攻克的醫(yī)學難題。因此深入探索腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中的分子機制將為腫瘤治療提供支持。

鋅指703（ZNF703）屬于NocA/Nlz、Elbow、Tlp-1（NET）家族，是一種高度保守的轉錄抑制因子。研究表明，ZNF703 和許多種癌癥的腫瘤發(fā)生和不良預后有關，并且在乳腺癌等多種腫瘤中高表達，能顯著提高腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲活性。因此，為了探究ZNF703 在腫瘤中發(fā)生、發(fā)展、轉移、惡化過程中的分子生物功能，本研究利用GPP Web Portal-Home（broadinstitute.org）中的CRISPpick 工具，根據(jù)人源ZNF703 或鼠源zfp703 基因序列中的相同部分序列設計ZNF703 sgRNA 靶向序列，該序列可以同時高效靶向人源ZNF703 和鼠源zfp703。并構建plenti-Crispr V2 sgZNF703 重組質(zhì)粒，利用CRISPR/Cas9 基因編輯工具敲除ZNF703 基因。利用慢病毒包裝體系，在HCT-116 細胞中通過構建ZNF703敲除細胞系，并利用熒光定量PCR 技術驗證ZNF703的敲除效果。

CRISPR/Cas9 技術是繼“鋅指核酸內(nèi)切酶”（ZFN）和“類轉錄激活因子效應物核酸酶”（TALEN）后的第3代，最新的基因編輯技術，能通過guide-RNA 靶向定位產(chǎn)生DNA 雙鏈切割，DNA 雙鏈切割損傷可以通過非同源性末端相連修復（NHEJ）或同源修復（HDR）。NHEJ 的結果就是從基因組水平的基因敲除效果。HDR 的結果就是可以實現(xiàn)基因特定位點的精確編輯。雖然CRISPR/Cas9 技術更多是應用在基因編輯上，但是其應用在基因敲除上也比以往的基因敲除工具更具優(yōu)勢：該技術可以實現(xiàn)基因組水平的基因敲除，所以敲除效果更加穩(wěn)定?，F(xiàn)有的siRNA、shRNA 等基因敲除技術都是mRNA 水平的降低，所以不如CRISPR/Cas9技術的敲除效果穩(wěn)定。

綜上所述，本研究成功構建了plenti-Crisp V2ZNF703 sgRNA 重組質(zhì)粒，并通過構建ZNF703敲除HCT-116 細胞系以及利用熒光定量PCR 驗證。所構建plenti-Crisp V2ZNF703 sgRNA 可以有效地敲除ZNF703 基因，為進一步探索ZNF703 在腫瘤中的分子生物學功能打下了基礎。