程玉鵬，李忠蒙，劉廣杰，高寧，2

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合博士后科研流動(dòng)站，黑龍江哈爾濱 150040）

柴胡為我國傳統(tǒng)中藥，具有疏散退熱、疏肝解郁、升陽舉氣的功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，柴胡具有解熱、抗感染、保肝護(hù)肝、抗抑郁、降血脂等功能[2-3]。由于柴胡對高脂血癥具有較好療效，因此以柴胡為主要組成的中藥降脂方劑越來越受到關(guān)注，如大柴胡湯、柴胡加龍骨牡蠣湯、柴胡疏肝散等均在臨床上得到了廣泛應(yīng)用[4-5]。然而，目前關(guān)于柴胡降脂的研究主要集中于藥效的確證，而其主要有效成分并不清晰、作用靶點(diǎn)尚不明確、作用機(jī)制研究較少，也使得相關(guān)藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)難以確定，影響了柴胡及其類方的進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用[5]。課題組對現(xiàn)有研究結(jié)果[5-7]分析推定，柴胡中的皂苷類成分柴胡皂苷A 極有可能是柴胡治療高脂血癥的關(guān)鍵藥效分子。柴胡皂苷A（saikosaponin A）是五環(huán)三萜類齊墩果烷型衍生物，是柴胡藥材質(zhì)量的指標(biāo)成分之一?，F(xiàn)有研究表明，柴胡皂苷A 對于腫瘤、炎癥性疾病、癲癇、肝損傷等均表現(xiàn)出較好的治療效果[8]，亦有部分研究顯示，柴胡皂苷A 能夠影響細(xì)胞對脂類分子的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)[7]，可能是柴胡降血脂的活性成分之一。為深入探討柴胡皂苷A 的降血脂作用及其可能的分子機(jī)制，本研究采用生物信息學(xué)手段，建立“藥效分子-靶點(diǎn)-信號通路-疾病”的關(guān)聯(lián)性并利用qPCR 對分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，以期為開發(fā)柴胡皂苷A 新的治療應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，也為揭示柴胡及其類方治療高脂血癥的分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑及細(xì)胞株

人體肝癌細(xì)胞（HepG2）由中科院細(xì)胞庫提供，由本實(shí)驗(yàn)室繼代保存。

SV Total RNA Isolation System，GoScriptTMReverse Tanscription System，GoTaq?qPCR Master Mix 均購自普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；胎牛血清購自賽澳美細(xì)胞技術(shù)（北京）有限公司；總膽固醇（TC/TCH）測定試劑盒，甘油三脂（TG）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所有限公司；柴胡皂苷A 購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 靶點(diǎn)預(yù)測

在PubChem 中搜索柴胡皂苷A（saikosaponin A）的結(jié)構(gòu)信息，下載得到其簡化分子線性輸入規(guī)范（Simplified molecular input line entry specification，SMILES）文件，將SMILES 信息導(dǎo)入小分子靶點(diǎn)在線預(yù)測分析系統(tǒng)SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/index.php），SwissTargetPre‐diction 可基于“相似性原理（similarity principle）”對柴胡皂苷A 與其數(shù)據(jù)庫中超過370 000 個(gè)活性靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，進(jìn)而分析預(yù)測其可能的靶蛋白。

1.3 靶點(diǎn)蛋白生物學(xué)功能及信號通路富集分析

將分析得到的靶點(diǎn)導(dǎo)入基因本體論數(shù)據(jù)庫（gene oncology，GO）得到靶點(diǎn)蛋白參與的生物過程（biological process），同時(shí)將靶點(diǎn)信息導(dǎo)入京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG），得到各靶點(diǎn)所參與的信號通路及代謝通路，全面了解靶點(diǎn)蛋白的生物學(xué)功能。隨后，利用STRING 11（http：//string-db.org）富集分析功能對靶蛋白的生物學(xué)過程及信號通路進(jìn)行富集分析，篩選得到柴胡皂苷A 顯著調(diào)節(jié)的生物功能，探討其對高脂血癥的影響。

1.4 靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

將分析得到的靶點(diǎn)列表導(dǎo)入STRING 11，得到蛋白質(zhì)間相互作用關(guān)系，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction networks，PPI networks），隨后導(dǎo)入Cytoscape 軟件，利用復(fù)合分子檢測法（MCODE）分析PPI 網(wǎng)絡(luò)，篩選相互作用關(guān)系模塊（Module），明確各模塊生物學(xué)功能，探討柴胡皂苷A治療高脂血癥的分子機(jī)制。

1.5 HepG2細(xì)胞中TC、TG含量的測定

取處于對數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞，胰酶消化后用PBS 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，接種于六孔板，每孔2 mL，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h，棄上清。將細(xì)胞隨機(jī)分為藥物處理組與對照組，藥物處理組每孔加入2 mL 含有10 μg/mL 柴胡皂苷A 的無血清培養(yǎng)基，對照組加入2 mL 無血清培養(yǎng)基，37 ℃孵育24 h，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。隨后棄上清，PBS 清洗2 次，加入含30%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基孵育24 h。孵育結(jié)束后，按照試劑盒說明書操作，檢測各組HepG2細(xì)胞中總膽固醇（TC）及甘油三酯（TG）含量。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證關(guān)鍵靶點(diǎn)基因表達(dá)變化

1.6.1 樣品處理

取處于對數(shù)生長期的HepG2 細(xì)胞，胰酶消化后用PBS 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，接種于六孔板，每孔2 mL，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)24 h，棄上清。將細(xì)胞隨機(jī)分為藥物處理組與對照組，藥物處理組每孔加入2 mL 含有10 μg/mL 柴胡皂苷A 的無血清培養(yǎng)基，對照組加入2 mL 無血清培養(yǎng)基，37 ℃孵育24 h。每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。孵育結(jié)束后，用PBS 清洗細(xì) 胞2 次，按照SV Total RNA Isolation System 總RNA 提取試劑盒說明書操作，提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)電泳及NanoDrop 8000 檢測合格后（電泳條帶清晰，A260/A280 在1.9～2.2 之間），通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒GoScriptTMReverse Tanscription System 合成cDNA。-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 qPCR驗(yàn)證基因表達(dá)

取cDNA 樣本，利用GoTaq?qPCR Master Mix試劑盒，按如下參數(shù)進(jìn)行qPCR。預(yù)變性階段：95 ℃，2 min；循環(huán)階段：95 ℃變性15 s，60 ℃退火及延伸1min，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線階段：65 ℃→95 ℃，臺階時(shí)間15 s，臺階溫度1 ℃。

以GAPDH為內(nèi)參，利用2-△△Ct比較靶點(diǎn)基因在給藥組與對照組間表達(dá)差異（n=6）。所用引物經(jīng)Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，見表1。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primers of target genes

2 結(jié)果

2.1 柴胡皂苷A靶點(diǎn)信息

將柴胡皂苷A 的結(jié)構(gòu)信息輸入SwissTargetPre‐diction 后，共篩選得到100 個(gè)靶點(diǎn)蛋白結(jié)果，對其中打分前50 位的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析表明，G 蛋白偶聯(lián)受體家族A（20%）、激酶（16%）、磷酸酶（10%）以及蛋白酶（10%）是所占比例最多的類別，見圖1。而在預(yù)測打分中排名最前的10 個(gè)靶點(diǎn)蛋白依次為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、蛋白酪氨酸磷酸酶1b（PTPN1）、血小板活化因子受體（PTAFR）、腎素（REN）、己糖激酶4型（GCK）、白三烯B4受體1（LTB4R）、T細(xì)胞蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPN2）、受體型酪氨酸蛋白磷酸酶α（PTPRA）、酰胺A1 受體（ADORA1）。預(yù)測打分中，可能性排名前20的靶點(diǎn)蛋白見表2。

表2 柴胡皂苷A作用可能性排名前20的靶點(diǎn)蛋白Table 2 The top 20 proteins for the possibility of targeting by saikosaponin A

圖1 靶點(diǎn)蛋白各類別比例Figure 1 Piechart of target proteins categories

2.2 靶點(diǎn)蛋白生物學(xué)功能與信號通路富集分析結(jié)果

利用GO對得分前50名的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行生物學(xué)功能注釋并對其進(jìn)行富集分析，結(jié)果表明，柴胡皂苷A 靶點(diǎn)蛋白主要涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（GO：0023056，GO：1902533）、磷酸化（GO：0042325）、細(xì)胞增殖調(diào)控（GO：0042127）、對刺激的應(yīng)答（GO：0009605）等多種生物學(xué)過程，其中富集顯著性排名前10位的生物學(xué)過程如圖2所示。對柴胡皂苷A 靶點(diǎn)蛋白參與的通路進(jìn)行富集分析結(jié)果表明，靶點(diǎn)蛋白主要參與的信號通路包括PI3K-Akt 信號通路（hsa04151）、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性（hsa01521）、神經(jīng)活性配體-受體相互作用（hsa04080）、Jak-STAT 信號通路（hsa04630）、鞘磷脂信號通路（hsa04071）等，其中富集顯著性排名前10位的代謝及信號通路見表3。

表3 柴胡皂苷A靶點(diǎn)蛋白富集顯著性前10位的代謝及信號通路Table 3 Top 10 KEGG pathways of target proteins effected by saikosaponin A

圖2 柴胡皂苷A靶點(diǎn)蛋白富集顯著性前10位的生物學(xué)過程Figure 2 Top 10 biological processes of target proteins effected by saikosaponin A

2.3 靶點(diǎn)蛋白相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

STRING 11 收集整理了超過5 000 個(gè)物種的近百萬對蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，通過STRING 11 構(gòu)建柴胡皂苷A 靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)PPI，見圖3。將PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.7，利用network analysis分析表明，連通度排在前5 位的蛋白分別為VEGFA、EGFR、GRB2、STAT3、PIK3CA，由MCODE分析得到3 個(gè)蛋白相互作用模塊，見圖4，基于GO、KEGG、REACTOME等對各模塊生物學(xué)功能進(jìn)行總結(jié)，結(jié)果見表4。

表4 模塊相關(guān)生物學(xué)功能Table 4 Biological functions of the modules

圖3 柴胡皂苷A靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Figure 3 PPI network of target proteins effected by saikosaponin A

圖4 柴胡皂苷A靶點(diǎn)相互作用模塊Figure 4 Modules in the PPI network

2.4 柴胡皂苷A 處理后HepG2 細(xì)胞內(nèi)TC 與TG 含量變化結(jié)果

以HepG2 細(xì)胞作為模型，檢驗(yàn)柴胡皂苷A 對細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的影響。結(jié)果表明，柴胡皂苷處理后，HepG2 細(xì)胞中總膽固醇及甘油三酯的含量均有所下降（P＜0.05），見圖5，提示柴胡皂苷A 能夠抑制HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)代謝及吸收。

圖5 HepG2細(xì)胞中TC與TG的含量Figure 5 The contents of TC and TG in HepG2 cells（n=6）

2.5 靶點(diǎn)基因表達(dá)差異分析結(jié)果

選取了JAK-STAT 信號通路中的關(guān)鍵基因STAT3、GRB2、EGFR、SOCS1以及PI3K-Akt 信號通路中的PIK3CA、GRB2、EGFR基因?qū)ι镄畔⒎治鼋Y(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。qPCR 結(jié)果顯示，柴胡皂苷A 能夠促進(jìn)HepG2細(xì)胞中STAT3、GRB2、PIK3CA、EGFR的表達(dá)，并抑制SOCS1基因表達(dá)，見圖6。

圖6 目的基因qPCR 的相對表達(dá)值Figure 6 Relative expressionvalues of target gene qPCR(n=6)

3 討論與結(jié)論

高脂血癥是以血清膽固醇及甘油三酯水平升高為主要特征的病變狀態(tài)，是動(dòng)脈粥樣硬化等多種心血管類疾病的重要誘因，其發(fā)病率高、危害大，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康[9]。近年來，生活水平的不斷提高，以及不健康的飲食及生活習(xí)慣等，使得我國高脂血癥患者數(shù)量逐年攀升，有效防治高脂血癥也成為現(xiàn)代醫(yī)藥研究的重要方向之一?，F(xiàn)階段對于高脂血癥的治療仍以藥物干預(yù)為主，主要包括他汀類、貝特類、膽固醇吸收抑制劑等多種類型，但各化學(xué)合成類降脂藥物均存在較多的不良反應(yīng)[10]，因此，在實(shí)踐中療效確切的中藥及方劑，成為篩選新的高效低毒的降血脂藥物首選來源[9]。作為我國常用的傳統(tǒng)中藥，柴胡及大柴胡湯、小柴胡湯、柴胡疏肝散等方劑均能夠顯著調(diào)節(jié)高脂血癥患者的脂代謝紊亂，恢復(fù)血脂水平，展現(xiàn)出良好的臨床應(yīng)用效果[6]。其中柴胡所含的柴胡皂苷A在體外實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出對膽固醇代謝的調(diào)節(jié)作用[7]，可能是柴胡及其類方降血脂的重要有效成分之一，有望開發(fā)成為新的降血脂藥物以及相關(guān)方藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要參考指標(biāo)。

本研究基于生物信息學(xué)技術(shù)對柴胡皂苷A 潛在靶點(diǎn)及其涉及的生物學(xué)過程、信號與代謝通路、蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了分析，并基于脂代謝異常與肝癌的密切關(guān)系[11]，選擇人肝癌細(xì)胞HepG2 作為體外檢測模型，對分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)柴胡皂苷A 能夠影響高脂血癥多個(gè)相關(guān)的基因及信號通路。

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activators of transcription,STAT）是最為保守且高效的蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族之一，目前共發(fā)現(xiàn)7 個(gè)成員（STAT1、2、3、4、5a、5b 和6）。由其介導(dǎo)的JAKSTAT 信號通路是少數(shù)幾種多效性級聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，也是哺乳動(dòng)物中多種細(xì)胞因子與生長因子的主要信號傳遞機(jī)制。細(xì)胞因子/生長因子與細(xì)胞表面受體結(jié)合后，引起受體構(gòu)象改變并激活受體相關(guān)的Janus 激酶（receptor-associated Janus kinase,JAK），隨后JAK 互磷酸化并催化受體胞內(nèi)部分酪氨酸殘基磷酸化，磷酸化的受體通過SH2 結(jié)構(gòu)域與STAT結(jié)合，JAK 則通過磷酸化作用激活STAT，活化后的STAT 形成二聚體并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，進(jìn)入細(xì)胞核的STAT能夠與特異性DNA原件相結(jié)合進(jìn)而調(diào)控上千種基因的轉(zhuǎn)錄。整個(gè)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受多水平調(diào)控，其中細(xì)胞因子信號抑制蛋白（SCOCS）與蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）是2類比較重要的STAT負(fù)調(diào)控因素[12]。研究證明，在漢族人群中，STAT3的常見變異與高甘油三酯血癥及肥胖的患病風(fēng)險(xiǎn)有密切關(guān)系[13]。JAK2/STAT3 信號通路能夠被瘦素受體激活，在脂代謝過程中發(fā)揮重要作用，JAK2/STAT3 信號通路異常能夠?qū)е赂咧Y、動(dòng)脈粥樣硬化、脂肪肝等多種疾病[12]。許多中藥及方劑也通過調(diào)節(jié)STAT3實(shí)現(xiàn)降脂功能[14-15]。對柴胡皂苷A 潛在靶點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，得分最高的靶點(diǎn)蛋白為STAT3，表明柴胡皂苷A 對其作用最為明顯，通路分析則發(fā)現(xiàn)JAK-STAT 信號通路得到顯著性富集，蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析也表明STAT3 在柴胡皂苷A 藥理作用網(wǎng)絡(luò)中處于重要的節(jié)點(diǎn)位置，網(wǎng)絡(luò)作用模塊1 的關(guān)鍵功能即為JAK-STAT 信號通路。此外，qPCR 也證實(shí)通路中STAT3、GRB2、EGFR基因在柴胡皂苷A 的作用下，表達(dá)量呈上升狀態(tài)；而其抑制基因SOCS1的表達(dá)則呈下降狀態(tài)。綜上可知，以STAT3 為核心作用靶點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)節(jié)JAK-STAT 信號通路、改善機(jī)體脂質(zhì)代謝可能是柴胡皂苷A 治療高脂血癥的主要分子機(jī)制，見圖7。

圖7 柴胡皂苷A調(diào)節(jié)JAK-STAT信號通路的靶點(diǎn)Figure 7 Targets of saikosaponin A in JAK-STAT signaling pathway

另一條富集顯著性較高的通路是磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway），在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)連通度前5 位的靶點(diǎn)蛋白中的PIK3CA、EGFR、GRB2 均屬于此通路。PI3K-Akt 信號途徑對多種細(xì)胞刺激及毒性刺激均能產(chǎn)生應(yīng)答，調(diào)控轉(zhuǎn)錄、翻譯、增殖等生理功能。生長因子與受體型磷酸激酶或G 蛋白偶聯(lián)受體相結(jié)合，分別激活I(lǐng)a 型與Ib 型PI3K，活化后的PI3K 催化PIP2 生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3），后者作為胞內(nèi)第二信使協(xié)助PDK 與mTORC2 催化激活A(yù)KT，隨后AKT通過磷酸化作用進(jìn)一步激活下游蛋白進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞細(xì)胞凋亡、蛋白合成、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程[16]。qPCR 結(jié)果也表明PIK3CA、GRB2、EGFR基因在柴胡皂苷A 的作用表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)狀態(tài)，客觀反映出柴胡皂苷A 能夠激活PI3K-Akt信號通路。研究顯示，PI3K-Akt信號通路能夠參與高脂血癥[17]、非酒精性脂肪肝[17]、代謝綜合征[18]等疾病的發(fā)生發(fā)展過程，青錢柳[19]、吳茱萸[20]等中藥的降脂作用也與PI3K-Akt 信號通路密切相關(guān)。由此可知，PI3K-Akt 信號通路在柴胡皂苷A 降血脂過程中也發(fā)揮了重要作用，見圖8。

圖8 柴胡皂苷A調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路的靶點(diǎn)Figure 8 Targets of saikosaponin A in PI3K-Akt signaling pathway

此外，生物信息分析結(jié)果表明，靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）與高脂血癥引起的血管內(nèi)皮損傷密切相關(guān)[21]；而Ca2+信號、鞘磷脂信號以及溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid,LPA）異常也被證明與高脂血癥及其并發(fā)癥存在關(guān)聯(lián)[22-24]。

其他顯著性富集通路及其關(guān)鍵蛋白如神經(jīng)活性配體-受體相互作用（hsa04080）、癌癥相關(guān)通路（hsa05200）、破骨細(xì)胞分化（hsa04380）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）等則涉及柴胡皂苷A 的抗癲癇、抗腫瘤、抗感染、抑制破骨細(xì)胞分化等作用，并已有較多相關(guān)研究報(bào)道[1，25]。其結(jié)果也間接證明了基于生物信息學(xué)分析柴胡皂苷A藥效作用分子機(jī)理的可行性。

綜上可知，柴胡皂苷A 能夠以STAT3、PIK3CA、VEGFA等為其主要調(diào)節(jié)位點(diǎn)，通過影響JAK-STAT信號通路、PI3K-Akt 信號通路，輔以鈣離子信號通路、溶血磷脂與LPA 受體、鞘磷脂信號通路等，最終發(fā)揮改善機(jī)體脂質(zhì)代謝、治療高脂血癥的作用。

中藥及其方劑具有多成分、多靶點(diǎn)的特征，各味藥君臣佐使亦有其各自功能。因此，以方藥所含全部成分進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，往往會(huì)得到各成分及其靶點(diǎn)極為復(fù)雜的相互作用關(guān)系。對于前期研究較充分的方藥，能夠?qū)φ找延薪Y(jié)果很快發(fā)現(xiàn)新的突破點(diǎn)；而對于前期研究基礎(chǔ)薄弱的方藥，在眾多調(diào)節(jié)途徑中抽絲剝繭尋找核心機(jī)制則顯得力不從心。因此，為聚焦核心機(jī)制，本研究以降脂方劑中君藥柴胡的關(guān)鍵藥效分子柴胡皂苷A 為研究對象，分析其治療高脂血癥的分子機(jī)理，為柴胡皂苷A 的新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步分析柴胡及其類方配伍機(jī)制提供理論依據(jù)，同時(shí)為將柴胡皂苷A 納入柴胡降脂類方藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。