李征，蔡曉航，李鋼，趙爽

（1.南陽市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，河南南陽 473000；2.河南省腫瘤醫(yī)院頭頸甲狀腺外科，河南鄭州 450000）

鼻咽癌是一種起源于鼻咽上皮細胞的高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性癌癥，在東南亞和華南地區(qū)高發(fā)[1]，發(fā)病機制尚不完全清楚，化療和放療為其主要治療策略，然而鼻咽癌患者的5 年總生存率仍然很低[2]，積極探索潛在的新型鼻咽癌治療靶點具有重要意義。自噬是細胞在自噬相關(guān)基因控制下利用溶酶體降解受損細胞器和大分子物質(zhì)的過程，與癌細胞增殖、侵襲和耐藥相關(guān)[3]。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycinm,mTOR）信號通路與調(diào)節(jié)多種癌癥中的自噬、凋亡、化療耐藥性及轉(zhuǎn)移相關(guān)[4]，有研究表明抑制該信號通路可增加癌細胞自噬通量，并誘導(dǎo)癌細胞凋亡[5]。去氫木香內(nèi)酯（dehydrocostuslactone,DCL）為木香主要活性成分，具有抗炎、抗菌、改善胃腸功能以及抗腫瘤等廣泛生物學作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)，其可誘導(dǎo)胃癌細胞自噬和凋亡[7]，但關(guān)于其是否可介導(dǎo)PI3K/Akt/mTOR 通路誘導(dǎo)鼻咽癌細胞自噬和凋亡尚待探究。故本研究擬體外培養(yǎng)鼻咽癌細胞系CNE1，經(jīng)不同濃度DCL培養(yǎng)，觀察其對CNE1細胞自噬、凋亡及通路相關(guān)蛋白表達的影響，以期為鼻咽癌進展分子機制及臨床用藥選擇提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人鼻咽癌細胞株CNE1 購自ATCC細胞庫。

1.1.2 主要試劑 DCL（質(zhì)量分數(shù)≥98%，YRQ002）購自成都儀睿生物科技有限公司；Matrigel 基質(zhì)膠（356234）購自美國BD 公司；Hoechst 33258 染色液（B8030）、AnnexinV-FITC/PI 流式細胞凋亡檢測試劑盒（CA1020）購自北京索萊寶生物科技公司；微管相關(guān)蛋白1A/1B 輕鏈3（microtubule associated protein 1A/1B light chain 3，LC3）（ab63817）、p62（ab264313）、B 細胞淋巴瘤/白血病-2 基因（B-cell leukcmia/lymphoma 2，Bcl2）（ab196495）、Bcl2 相關(guān)X 蛋白（Bcl2 associated X protein，Bax）（ab53154）、cleaved caspase-3（ab49822）抗體購自美國Abcam 公司；PI3K（bs-10657R）、p-PI3K（bs-6417R）、p-Akt（bs-2720R）、mTOR（bs-1992R）、p-mTOR（bs-3494R）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Akt（AA326）購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.1.3 主要儀器 550 型全自動酶標儀購自美國Bio-Rad 公司；CytoFLEX 流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；FluorChem HD2 化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自美國ProteinSimple公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) CNE1 細胞接種于含有10%（φ）胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中（100 u/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素），于37 ℃在體積分數(shù)為5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至70%～80%匯合時，以1∶3比例進行消化傳代。

1.2.2 CCK8法檢測CNE1細胞存活率 于對數(shù)生長期收集CNE1細胞，以每孔2×103個細胞接種100 μL單細胞懸液至96 孔板，不同濃度DCL（0、5、10、20、40 μmol/L）培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，于孔內(nèi)直接加入10 μL CCK8 試劑并孵育2 h。全自動酶標儀測定450 nm處的吸光度值（A），細胞存活率（%）=實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100%（實驗組指DCL 培養(yǎng)組，對照組不含DCL），重復(fù)3次。

1.2.3 Hoechst 33258 熒光染色法觀察細胞凋亡形態(tài) CNE1 細胞以1×104個細胞/mL 密度接種至6 孔板，不同濃度DCL（0、5、10、20、40 μmol/L）培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌并收集細胞沉淀，4%（φ）甲醛固定10 min，PBS 洗滌，0.5 mL Hoechst 33258 溶液避光染色15 min。倒置熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡，凋亡細胞的細胞核呈碎片狀固縮，顯示為強熒光。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 CNE1 細胞以5×104個細胞/mL 密度接種至6 孔板，不同濃度DCL（0、5、10、20、40 μmol/L）培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，收集細胞，PBS 洗滌并收集細胞沉淀，重懸于200 μL 含有10 μL Annexin V FITC 和5 μL PI 的結(jié)合緩沖液中，室溫下避光孵育30 min 后，進行流式細胞術(shù)分析以評估細胞凋亡率。

1.2.5 透射電子顯微鏡觀察細胞自噬體形成 CNE1細胞以5×104個細胞/mL 密度接種至6 孔板，不同濃度DCL（0、5、10、20、40 μmol/L）培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，收集細胞沉淀，2.5%戊二醛中固定2 h，2%四氧化鋨在0.1 mol/L 碳酸鈣酸鈉緩沖液中處理，梯度丙酮脫水，后嵌入Epon 812 環(huán)氧樹脂，Leica EM UC7 超薄切片機上制備65 nm 超薄切片并進行透射電子顯微鏡分析。

1.2.6 Western blotting 技術(shù)檢測相關(guān)蛋白表達情況收集經(jīng)不同濃度DCL（0、5、10、20、40 μmoL/L）培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后的細胞沉淀，RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量的蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后與一抗（均1∶1 000 稀釋）孵育過夜，后與辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶10 000稀釋）室溫孵育2 h，增強的化學發(fā)光試劑顯影，化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)曝光，Image J 分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin 灰度值比值表示蛋白相對表達量，以磷酸化蛋白相對表達量與全蛋白相對表達量比值表示蛋白活性水平。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 26.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學處理，計量資料比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗，計量資料以表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 DCL對CNE1細胞存活率的影響

CCK8檢測結(jié)果顯示，CNE1細胞存活率隨DCL作用濃度增大而降低（P＜0.05）。見表1。

表1 不同濃度DCL培養(yǎng)下CNE1細胞存活率Table 1 Survival rate of CNE1 cells under different concentra‐tions of DCL(,n=5) %

表1 不同濃度DCL培養(yǎng)下CNE1細胞存活率Table 1 Survival rate of CNE1 cells under different concentra‐tions of DCL(,n=5) %

與0 μmol/L DCL 比較：*P＜0.05；與5 μmol/L DCL 比較：#P＜0.05；與10 μmol/L DCL 比較：@P＜0.05；與20 μmol/L DCL 比較：&P＜0.05。

2.2 DCL對CNE1細胞凋亡形態(tài)的影響

Hoechst 33258染色結(jié)果顯示，未添加DCL培養(yǎng)組細胞生長良好，細胞核完整，染色質(zhì)分布均勻；DCL 作用48 h 后，細胞核質(zhì)凝聚呈碎片狀固縮，形成凋亡小體，隨著DCL 濃度的增加，細胞染色和熒光增強，凋亡細胞逐漸增多。見圖1。

圖1 不同DCL作用濃度下CNE1細胞核Hoechst 33258染色結(jié)果（200×）Figure 1 Hoechst 33258 staining of CNE1 nuclei at different DCL concentrations（200×）

2.3 DCL對CNE1細胞凋亡率的影響

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，CNE1 細胞凋亡率隨DCL濃度增大而升高（P＜0.05）。見圖2，表2。

表2 不同濃度DCL培養(yǎng)下CNE1細胞凋亡率Table 2 Apoptosis rate of CNE1 cells under different concen‐trations of DCL(,n=3) %

表2 不同濃度DCL培養(yǎng)下CNE1細胞凋亡率Table 2 Apoptosis rate of CNE1 cells under different concen‐trations of DCL(,n=3) %

與0 μmol/L DCL 比較：*P＜0.05；與5 μmol/L DCL 比較：#P＜0.05；與10 μmol/L DCL 比較：@P＜0.05；與20 μmol/L DCL比較：&P＜0.05。

圖2 不同DCL作用濃度下CNE1細胞凋亡情況Figure 2 CNE1 cell apoptosis under different DCL concentrations

2.4 DCL對CNE1細胞自噬體形成的影響

透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，自噬體隨DCL作用濃度增大而逐漸積累。見圖3。

圖3 不同濃度DCL培養(yǎng)下CNE1細胞自噬體形成情況Figure 3 Autophage formation of CNE1 cells under different concentrations of DCL(30 000×)

2.5 DCL 對PI3K/Akt/mTOR 信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

Western blotting 檢測結(jié)果顯示，PI3K、Akt 和mTOR 蛋白活性水平均隨DCL 作用濃度增大而降低（P＜0.05）。見圖4，表3。

表3 不同濃度DCL培養(yǎng)下CNE1細胞通路相關(guān)蛋白活性水平Table 3 Activity levels of CNE1 cell pathway related proteins under different concentrations of DCL(,n=3)

表3 不同濃度DCL培養(yǎng)下CNE1細胞通路相關(guān)蛋白活性水平Table 3 Activity levels of CNE1 cell pathway related proteins under different concentrations of DCL(,n=3)

與0 μmol/L DCL 比較：*P＜0.05；與5 μmol/L DCL 比較：#P＜0.05；與10 μmol/L DCL 比較：@P＜0.05；與20 μmol/L DCL比較：&P＜0.05。

圖4 不同濃度DCL培養(yǎng)下CNE1細胞通路相關(guān)蛋白條帶Figure 4 Protein bands related to CNE1 cell pathway under different concentrations of DCL

2.6 DCL對自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

Western blotting 檢測結(jié)果顯示，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Bax 和cleaved caspase-3 蛋白相對表達水平隨DCL 作用濃度增大而升高，p62、Bcl2 蛋白相對表達水平隨DCL 作用濃度增大而降低（P＜0.05）。見圖5，表4。

表4 不同濃度DCL培養(yǎng)下CNE1細胞通路自噬和凋亡蛋白相對表達水平Table 4 Relative expression levels of autophagy and apoptosis proteins in CNE1 cells under different concentrations of DCL(,n=3)

表4 不同濃度DCL培養(yǎng)下CNE1細胞通路自噬和凋亡蛋白相對表達水平Table 4 Relative expression levels of autophagy and apoptosis proteins in CNE1 cells under different concentrations of DCL(,n=3)

與0 μmol/L DCL 比較：*P＜0.05；與5 μmol/L DCL 比較：#P＜0.05；與10 μmol/L DCL 比較：@P＜0.05；與20 μmol/L DCL 比較：&P＜0.05。

圖5 不同濃度DCL培養(yǎng)下CNE1細胞自噬和凋亡相關(guān)蛋白條帶Figure 5 Autophagy and apoptosis related protein bands of CNE1 cells cultured with DCL at different concentrations

3 討論

以順鉑或5-氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的同步放化療被認為是局部晚期鼻咽癌的標準治療方案，然而耐藥性的發(fā)生嚴重制約其有效性[8]。近年來，中草藥因其在癌癥治療中高效、低毒的作用而備受研究者關(guān)注。DCL 藥理活性廣泛。在本研究中，DCL 作用鼻咽癌CNE1細胞后，細胞存活率呈劑量依賴性降低，表明其對CNE1 細胞增殖具有積極抑制作用，提示DCL 可能是一種有效且可靠的抗鼻咽癌進展藥物，對鼻咽癌臨床治療具有重要的參考價值。

一般來說，自噬可啟動多個雙膜液泡的形成，這些液泡與溶酶體融合形成稱為“自噬體”的細胞內(nèi)體，可用于消除多余或受損的細胞器，以維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[9]，但研究發(fā)現(xiàn)，自噬還可以通過降解細胞存活因子和抗凋亡蛋白來促進細胞凋亡[10]。自噬和細胞凋亡分別控制細胞內(nèi)細胞器和蛋白質(zhì)的更新，以及生物體內(nèi)細胞的更新，許多應(yīng)激途徑依次引發(fā)同一細胞內(nèi)的自噬和細胞凋亡，特殊情況下，自噬或自噬相關(guān)蛋白可能有助于誘導(dǎo)細胞凋亡或壞死，而自噬已被證明會過度降解細胞質(zhì)，導(dǎo)致“自噬性細胞死亡”[11]，因此，自噬介導(dǎo)的細胞凋亡可能是一種很有前景的鼻咽癌治療策略，故在探究DCL 抗鼻咽癌作用機制時，本研究側(cè)重檢測并觀察細胞自噬和凋亡相關(guān)變化。在自噬過程中，自噬體吞噬細胞質(zhì)成分，導(dǎo)致胞質(zhì)形式的LC3I與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3Ⅱ，LC3Ⅱ/LC3I 比值與自噬體數(shù)量呈正相關(guān)[12]；p62 是一種泛素結(jié)合蛋白，當自噬被誘導(dǎo)時，p62 蛋白水平會降低[13]，另可作為細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)開關(guān)，通過募集和與細胞分子寡聚化來控制細胞存活、凋亡和自噬過程[14]。細胞凋亡通常通過可見的形態(tài)特征和生化標志物來證實，通常，細胞凋亡過程涉及核膜破裂和DNA 片段化，染色質(zhì)凝聚、固縮是細胞凋亡的最突出特征[15]；Bcl-2 是調(diào)節(jié)細胞死亡途徑執(zhí)行的抗凋亡蛋白，Bax 通過誘導(dǎo)細胞色素C 從線粒體易位到胞質(zhì)而發(fā)揮促凋亡功能；凋亡過程激活涉及的死亡受體途徑或線粒體凋亡途徑均會導(dǎo)致下游主要效應(yīng)蛋白酶caspase-3 的裂解和激活[16]。在本研究中，DCL 作用CNE1 細胞后，經(jīng)Hoechst 33258 熒光染色可見細胞核染色質(zhì)凝聚呈碎片狀固縮，且經(jīng)流式細胞術(shù)檢測后發(fā)現(xiàn)，CNE1 細胞凋亡率隨DCL 作用濃度增大而升高，提示DCL可呈劑量依賴性促進細胞凋亡發(fā)生；經(jīng)透射電子顯微鏡觀察后，細胞內(nèi)自噬體形成數(shù)量增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及Bax、cleaved caspase-3蛋白較無DCL作用時表達明顯升高，提示DCL可增強細胞自噬。結(jié)合上述討論，提示DCL可能通過促進鼻咽癌細胞自噬激活并誘導(dǎo)凋亡從而發(fā)揮抗癌活性。

PI3K/Akt/mTOR 通路是癌癥中最頻繁激活的信號通路之一，負責腫瘤發(fā)展、細胞轉(zhuǎn)移和增殖[17]。據(jù)報道，該通路也可調(diào)節(jié)癌細胞自噬和凋亡，在致瘤細胞中，PI3K 被激素、生長因子和其他刺激物激活，激活的PI3K 產(chǎn)生信使PIP3，使非活性Akt 發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變，后Ser124/Thr450 和Thr308/Ser473 位點依次磷酸化，導(dǎo)致Akt 信號激活，激活的Akt 進一步觸發(fā)mTOR 的磷酸化激活，進而調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)展中的細胞生長、凋亡和自噬[18]。Lin 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，通過下調(diào)PI3K/Akt/mTOR 通路可誘導(dǎo)人鼻咽癌細胞自噬和凋亡，Yang[20]等研究結(jié)果同樣表明，抑制PI3K/Akt/mTOR 通路激活可體外誘導(dǎo)鼻咽癌細胞自噬性細胞死亡。本研究中，經(jīng)Western blotting檢測，可見DCL 可明顯抑制CNE1 細胞中PI3K、Akt 和mTOR活性水平，這些結(jié)果表明，DCL 可能通過抑制PI3K/Akt/mTOR通路激活促進CNE1細胞自噬發(fā)生，進而介導(dǎo)細胞凋亡并抑制增殖的抗腫瘤活性。

綜上所述，DCL 可促進鼻咽癌細胞自噬和凋亡，其作用機制可能與抑制PI3K/Akt/mTOR 通路激活有關(guān)，為鼻咽癌臨床治療分子機制及用藥選擇提供了一定的參考。