祁子麟，陳詠琪，蔡延渠，3，4，李苑新，3，4，5，魯湘鄂，3，4，張萱萱，3，4

（1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部，湖北咸寧 437100；2.廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心，廣東廣州 510006；3.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑實(shí)驗(yàn)室（三級(jí)），廣東廣州 510006；4.廣東省教育廳現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006；5.廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510006）

創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）屬于革蘭陰性菌，是重要的海洋食源性病原菌之一，可引起原發(fā)性敗血癥、炎癥介導(dǎo)的感染性休克和壞死性傷口感染如壞死性筋膜炎，病情發(fā)展快、死亡率高[1]，目前美國(guó)、中國(guó)、澳大利亞、德國(guó)、韓國(guó)和日本等國(guó)均有創(chuàng)傷弧菌感染病例的報(bào)道。究其原因，與食用被創(chuàng)傷弧菌污染的生海鮮或暴露在含有創(chuàng)傷弧菌的溫暖海水中的開(kāi)放性傷口有關(guān)，即能夠通過(guò)傷口、腸道等途徑引起水產(chǎn)動(dòng)物和人體感染[2-3]。近年來(lái)，水產(chǎn)品中的創(chuàng)傷弧菌污染狀況及耐藥情況愈發(fā)嚴(yán)重[4-5]，其致病性與耐藥性可嚴(yán)重威脅到人類的生命健康。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)出新的抗菌劑或通過(guò)相關(guān)技術(shù)方法提升現(xiàn)有藥物的抗菌活性。

藤茶，又名顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata），是葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄[Ampelopsis megalo‐phylla（Hand.-Mazz）W.T.Wang]的嫩莖葉，為民間藥食兩用品種之一，具有清熱利濕、平肝降壓、活血通絡(luò)的功效。其不同部位提取物中均含有豐富的黃酮類成分（如二氫楊梅素、楊梅素、蛇葡萄素等）以及酚類化合物（如沒(méi)食子酸等），其中葉中總黃酮含量最高（41.2%～45.3%）[6]，具有抗菌[7]、抗炎[8]、抗氧化[9]、護(hù)肝[10]、免疫調(diào)節(jié)[11]等多種功能作用，但是目前尚無(wú)藤茶提取物及其有效成分對(duì)創(chuàng)傷弧菌的抗菌活性及作用機(jī)制研究報(bào)道。因此，本文擬采用KB 紙片法、微量肉湯二倍稀釋法測(cè)定藤茶提取物及二氫楊梅素、沒(méi)食子酸對(duì)創(chuàng)傷弧菌的體外抑殺活性，同時(shí)以酶標(biāo)儀法結(jié)合試劑盒法分析抗菌作用機(jī)制，為其作為抗菌劑的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）藥材：藤茶葉，采自湖北恩施來(lái)鳳，經(jīng)廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心李苑新副研究員鑒定為葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄[Ampelopsis megalophylla（Hand.-Mazz）W.T.Wang]的嫩莖葉。藥品：二氫楊梅素（批號(hào)：SXXZ20220403），陜西夏州生物科技有限公司；沒(méi)食子酸（批號(hào)：C17D10C105977），上海源葉生物科技有限公司。

（2）實(shí)驗(yàn)菌株：創(chuàng)傷弧菌，ATCC27562，來(lái)源于廣東省微生物研究所。

1.2 試劑與儀器

（1）主要試劑：2216E 液體培養(yǎng)基、2216E 瓊脂培養(yǎng)基，海博生物技術(shù)有限公司；0.5%無(wú)菌TTC 溶液，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；堿性磷酸酶（AKP）測(cè)試盒、BCA 試劑盒，南京建成生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

（2）主要儀器：SW-CJ-1FD 型潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；HPP110恒溫培養(yǎng)箱（德國(guó)美墨爾特有限公司）；YX-280D 手提式壓力蒸汽滅菌器（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司）；Synergy HTX酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；UV-1700紫外分光光度計(jì)（日本島津有限公司）。

1.3 藤茶提取物制備及溶液配制

參考文獻(xiàn)[12]操作。準(zhǔn)確稱取100 g 藤茶葉于圓底燒瓶中，按料液比1∶30（體積比）加入水（或70%乙醇），浸泡0.5 h，100 ℃（或80 ℃）加熱回流提取2 次，1.5 h/次，合并2 次提取液，75 ℃減壓濃縮至一定濃度，真空干燥。采用紫外分光光度法，測(cè)得藤茶水提物中二氫楊梅素的含量為610.39 mg/g、沒(méi)食子酸含量為200.64 mg/g，藤茶70%醇提物（以下簡(jiǎn)稱“藤茶醇提物”）中二氫楊梅素的含量為728.96 mg/g、沒(méi)食子酸含量為163.77 mg/g。

分別稱取適量的藤茶水提物、藤茶醇提物、二氫楊梅素、沒(méi)食子酸，以含2.0%吐溫-80、6.0% DMSO的水溶液為助溶劑配制質(zhì)量濃度為20 mg/mL的溶液。

1.4 菌懸液制備

將保存的創(chuàng)傷弧菌菌種取出復(fù)蘇20 h，挑取單菌落于2216E 液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)8 h，比對(duì)計(jì)數(shù)，稀釋成濃度為2.0×106CFU/mL的菌懸液[13]。

1.5 藤茶提取物的體外抗菌活性測(cè)定

1.5.1 抑菌環(huán)直徑測(cè)定 采用K-B紙片法[13]，分別吸取10 μL 濃度為20 mg/mL 的藤茶水提物溶液、藤茶醇提物溶液、二氫楊梅素溶液、沒(méi)食子酸溶液至無(wú)菌空白藥敏片上，60 ℃烘干，制備成藥敏片。吸取100 μL 濃度為2.0×106CFU/mL 的菌懸液至2216E 瓊脂板上，涂布均勻，貼放藥敏片，30 ℃培養(yǎng)20 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)直徑。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：直徑＞20 mm表示極敏感，15～20 mm 表示高度敏感，10～15 mm表示中度敏感，6～10 mm 表示低度敏感，≤6 mm 表示不敏感。

1.5.2 MIC及MBC測(cè)定 采用微量二倍稀釋法[13]，取96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在每排的第1～9 孔中加入100 μL菌懸液，再分別吸取濃度為20 mg/mL的藤茶水提物溶液、藤茶醇提物溶液、二氫楊梅素溶液、沒(méi)食子酸溶液100 μL 于細(xì)胞培養(yǎng)板橫排第1 孔中，混勻后吸取100 μL 于第2 孔中，依次進(jìn)行倍比稀釋至第8 孔，使得孔中混合液藥物終質(zhì)量濃度依次為10.00、5.00、2.50、1.25、0.63、0.31、0.16、0.078 mg/mL；第9孔加入100 μL 無(wú)菌助溶劑（含2.0%吐溫-80、6.0%DMSO的水溶液）作為空白對(duì)照。加樣后，于30 ℃孵育20 h，取出后每孔加入0.5%無(wú)菌TTC 溶液進(jìn)行顯色，以顏色不變紅者為MIC 值。同時(shí)選擇藥物濃度為MIC、2 MIC、4 MIC 的對(duì)應(yīng)孔，分別吸取50μL 培養(yǎng)液于2216E 瓊脂板上涂勻，30 ℃培養(yǎng)20 h，取出觀察計(jì)數(shù)，以無(wú)菌生長(zhǎng)者為MBC。

1.6 藤茶提取物的抗菌作用機(jī)制[13]

1.6.1 對(duì)創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)特性的影響（1）藤茶醇提物不同濃度組：分別加入500 μL 的20 mg/mL 藤茶醇提物溶液和2.0×106CFU/mL 的菌懸液于12 孔板中，使混合液終濃度為1/2 MIC、MIC、2 MIC；（2）創(chuàng)傷弧菌空白對(duì)照組：只加入同量的無(wú)菌助溶劑溶液和菌懸液。于30 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，每隔2 h 取出培養(yǎng)液，采用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)600 nm 處的吸光度（A）值，以t為橫坐標(biāo)、A600為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)抑制曲線，考察不同濃度藤茶醇提物在不同作用時(shí)間下對(duì)創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)的影響。

1.6.2 對(duì)創(chuàng)傷弧菌細(xì)胞壁通透性的影響（1）藤茶醇提物不同濃度組：分別加入500 μL 的20 mg/mL藤茶醇提物溶液和2.0×106CFU/mL 的菌懸液于12孔板中，使混合液終濃度為1/2 MIC、MIC、2 MIC；（2）創(chuàng)傷弧菌空白對(duì)照組：只加入同量的無(wú)菌助溶劑溶液和菌懸液。于30 ℃振蕩培養(yǎng)6 h，將培養(yǎng)液取出，4 000 r/min 低溫離心15 min，取上清液，按照AKP 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀中波長(zhǎng)520 nm 下測(cè)定吸光度（A）值，代入公式計(jì)算AKP 活力，分析不同濃度藤茶醇提物在一定作用時(shí)間內(nèi)對(duì)創(chuàng)傷弧菌細(xì)胞壁通透性的影響。

其中，C標(biāo)準(zhǔn)：酚標(biāo)準(zhǔn)液濃度，0.1 mg/mL；N：樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

1.6.3 對(duì)創(chuàng)傷弧菌細(xì)胞膜的影響（1）藤茶醇提物不同濃度組：分別加入1 000μL的20 mg/mL藤茶醇提物溶液和2.0×106CFU/mL的菌懸液于12孔板中，使混合液終濃度為1/2 MIC、MIC、2 MIC；（2）空白對(duì)照組：只加入同量的無(wú)菌助溶劑溶液和菌懸液。于30 ℃振蕩培養(yǎng)6 h，將培養(yǎng)液取出，4 000 r/min 低溫離心15 min，取上清液，①于酶標(biāo)儀中波長(zhǎng)260 nm處測(cè)定吸光度值，分析不同濃度藤茶醇提物在一定作用時(shí)間內(nèi)對(duì)創(chuàng)傷弧菌細(xì)胞內(nèi)核酸含量的影響。②按照BCA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，于酶標(biāo)儀中波長(zhǎng)562 nm 下測(cè)定吸光度值，計(jì)算可溶性蛋白質(zhì)濃度，分析不同濃度藤茶醇提物在一定作用時(shí)間內(nèi)對(duì)創(chuàng)傷弧菌細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量的影響。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，組間差異采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析及t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 藤茶提取物的抑菌活性評(píng)價(jià)

表1 結(jié)果顯示，藤茶水提物對(duì)創(chuàng)傷弧菌的抑菌環(huán)直徑為（18.28±0.71）mm，表現(xiàn)出高度敏感性，MIC、MBC 均為5.00 mg/mL。藤茶醇提物的抑菌環(huán)直徑為（21.45±0.63）mm，表現(xiàn)出極敏感性，MIC、MBC 均為0.63 mg/mL。二氫楊梅素的抑菌環(huán)直徑為（20.16±0.49）mm，表現(xiàn)出極敏感性，MIC、MBC為1.25、2.50 mg/mL。沒(méi)食子酸的抑菌環(huán)直徑為（19.59±0.67）mm，表現(xiàn)出高度敏感性，MIC、MBC為2.50、5.00 mg/mL。幾者相比，藤茶70%醇提物對(duì)創(chuàng)傷弧菌的體外抑菌活性最強(qiáng)。

表1 藤茶提取物對(duì)創(chuàng)傷弧菌的體外抑菌活性Table 1 In vitro antibacterial activity of Ampelopsis grossed‐entata extracts against Vibrio vulnificus(n=3)

2.2 藤茶醇提物的抗菌作用機(jī)制

2.2.1 對(duì)創(chuàng)傷弧菌的生長(zhǎng)抑制影響 分析圖1 不同作用時(shí)間下的A600值可知，創(chuàng)傷弧菌在正常培養(yǎng)0～12 h 內(nèi)的A600值不斷提高，而不同濃度藤茶醇提物組的變化如下：①1/2 MIC 組與創(chuàng)傷弧菌組的生長(zhǎng)趨勢(shì)類似，但菌體生長(zhǎng)數(shù)量稍有減少；②MIC 組的A600值在6～12 h 基本一致，表示菌體生長(zhǎng)受到顯著性的抑制影響；③2 MIC 組則在12 h 內(nèi)A600值基本不變，完全抑制菌體生長(zhǎng)。結(jié)果表明，藤茶醇提物在1/2 MIC 濃度時(shí)，略微影響創(chuàng)傷弧菌的正常生長(zhǎng)，而在MIC、2 MIC 時(shí)能夠顯著地抑制菌體生長(zhǎng)（P＜0.01），表明其抑菌能力隨藥物濃度的提高而增強(qiáng)。

圖1 不同濃度藤茶醇提物對(duì)創(chuàng)傷弧菌生長(zhǎng)繁殖的影響Figure 1 Effect of different concentrations of Ampelopsis grossedentata extracts on the growth and reproduction of Vibrio vulnificus（n=3）

2.2.2 對(duì)創(chuàng)傷弧菌細(xì)胞壁通透性的影響 分析圖2可知，創(chuàng)傷弧菌在正常生長(zhǎng)6 h后，由于受到細(xì)胞壁的保護(hù)，其胞外的AKP含量依然保持在低水平；當(dāng)藤茶醇提物濃度為1/2 MIC時(shí)，胞外的AKP含量稍有增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而當(dāng)藥物濃度提高至MIC、2 MIC 時(shí)，菌體細(xì)胞壁受到明顯破壞，引起胞內(nèi)AKP外泄，因此導(dǎo)致胞外AKP含量顯著性提高（P＜0.01）。結(jié)果表明，藤茶醇提物能夠有效破壞創(chuàng)傷弧菌細(xì)胞壁的完整性，且濃度越高，破壞能力越強(qiáng)。

圖2 不同濃度藤茶醇提物對(duì)創(chuàng)傷弧菌胞外AKP含量的影響Figure 2 Effect of different concentrations of Ampelopsis grossedentata extracts on extracellular AKP content of Vibrio vulnificus（n=3）

2.2.3 對(duì)創(chuàng)傷弧菌細(xì)胞膜的影響 分析圖3-4 可知，創(chuàng)傷弧菌在正常生長(zhǎng)6 h 后，由于受到細(xì)胞膜的保護(hù)，胞內(nèi)核酸（RNA/DNA）、可溶性蛋白質(zhì)等內(nèi)容物的外排量很少。當(dāng)藤茶醇提物濃度為1/2 MIC時(shí)，可能對(duì)個(gè)別菌體的細(xì)胞膜具有一定作用，因此內(nèi)容物略有外泄，但與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而隨著藥物濃度增加至MIC、2 MIC時(shí)，菌體細(xì)胞膜受破壞明顯，胞內(nèi)物質(zhì)大量外泄，使得胞外核酸、可溶性蛋白質(zhì)的含量顯著地提高（P＜0.01）。結(jié)果表明，藤茶醇提物具有破壞創(chuàng)傷弧菌細(xì)胞膜完整性的作用，并且作用強(qiáng)弱隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)。

圖3 不同濃度藤茶醇提物對(duì)創(chuàng)傷弧菌胞外核酸含量的影響Figure 3 Effect of different concentrations of Ampelopsis grossedentata extracts on extracellular nucleic acid content of Vibrio vulnificus（n=3）

圖4 不同濃度藤茶醇提物對(duì)創(chuàng)傷弧菌胞外可溶性蛋白質(zhì)含量的影響Figure 4 Effect of different concentrations of Ampelopsis grossedentata extracts on extracellular soluble protein content of Vibrio vulnificus（n=3）

3 討論

研究表明，藤茶中的黃酮類化合物（如二氫楊梅素、藤茶素、藤茶苷、槲皮素、山柰酚）、酚類化合物（如沒(méi)食子酸、兒茶素、表兒茶素等）是主要抗菌活性成分[14]，且以二氫楊梅素為代表，可對(duì)金黃色葡萄球菌、MRSA、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌、痢疾桿菌、糞腸球菌、陰溝腸桿菌、白色念珠菌、雞沙門氏桿菌、豬鏈球菌、根霉、黑曲霉等多種人、畜、植物致病菌具有廣譜高效的抑菌作用（MIC：0.31～10.00 mg/mL）[15]。與中草藥（芒果葉等）[16]、化學(xué)抗菌藥（頭孢吡肟、頭孢唑林、亞胺培南、司他丁鈉、苯唑西林、頭孢西?。17]聯(lián)用，可通過(guò)破壞細(xì)菌細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的完整性[18]，或干擾微生物糖代謝中的呼吸代謝途徑[19]，或影響蛋白質(zhì)及遺傳物質(zhì)[20]（DNA、RNA）等方面起到相加或協(xié)同增效作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，藤茶不同溶劑（水、70%乙醇）提取物及有效成分均能夠抑制食源性創(chuàng)傷弧菌的生長(zhǎng)，體外抗菌性能強(qiáng)弱依次為：藤茶醇提物＞二氫楊梅素＞沒(méi)食子酸＞藤茶水提物（MIC 依次為：0.63、1.25、2.50、5.00 mg/mL，MBC 依次為：0.63、2.50、5.00、5.00 mg/mL）；通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，藤茶醇提物較水提物的抗菌活性更強(qiáng)，主要是二氫楊梅素、沒(méi)食子酸、槲皮素、兒茶素等活性成分在醇-水體系中更容易溶出，因此含量更高、抗菌活性更強(qiáng)；比活性成分二氫楊梅素、沒(méi)食子酸的抗菌活性更強(qiáng)，雖然70%乙醇提取物中只含有72.9%二氫楊梅素、16.4%沒(méi)食子酸，但卻也含有其他黃酮類、多酚類的抗菌活性成分，因此不同成分間可能以某種方式起到相互協(xié)同或相加作用，從而使其表現(xiàn)出更優(yōu)的整體抗菌性能。在抗菌作用機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，藤茶醇提物達(dá)到MIC、2 MIC 時(shí)，能夠顯著地抑制菌體正常生長(zhǎng)；且在作用6 h 后，能夠顯著破壞創(chuàng)傷弧菌的細(xì)胞壁與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，促使細(xì)胞內(nèi)AKP、核酸、蛋白質(zhì)等內(nèi)容物的釋放和干擾菌體細(xì)胞內(nèi)酶系統(tǒng)及遺傳物質(zhì)的正常代謝，引起膜功能障礙，并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，從而有效抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。在下一步的工作中，將對(duì)藤茶提取物中不同成分的配伍比例與抗菌活性間的內(nèi)在關(guān)系進(jìn)行深入探討。

藤茶在廣西、貴州、湖北、湖南、重慶、江西、福建、廣東等多個(gè)省市均有種植或野生資源分布，年產(chǎn)量可達(dá)萬(wàn)噸以上[21]，同時(shí)目前文獻(xiàn)中尚無(wú)藤茶及其活性成分對(duì)致病菌產(chǎn)生耐藥性的報(bào)道，有望深入開(kāi)發(fā)為天然抗菌劑或抗菌增效劑。