范倩，吳曉純，蔡盛康，陶晨璐，朱德全，陳向東，沈斌斌，孫冬梅

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東佛山 528244）

麥門冬湯出自漢代張仲景《金匱要略》一書，由麥冬、法半夏、人參、甘草、粳米和大棗6 味中藥組成，具滋養(yǎng)肺胃、降逆下氣的功效，臨床主要應(yīng)用于慢性萎縮性胃炎、慢性咽炎、慢性支氣管炎、慢性肺纖維化和糖尿病等疾病的治療[1-2]。慢性萎縮性胃炎是常見、多發(fā)的、長時間治療難以痊愈的消化系統(tǒng)多發(fā)疾病之一，以反酸、餐后飽脹、食欲不佳、腹痛等為主要癥狀，且癥狀常反復發(fā)作[3]。麥門冬湯療效確切，臨床應(yīng)用廣泛，是國家發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》中所載方劑之一。目前，關(guān)于麥門冬湯在治療慢性萎縮性胃炎的臨床報道較多，然而對其中藥化學物質(zhì)基礎(chǔ)卻缺乏系統(tǒng)性的研究。

《金匱要略》（漢·張仲景）中記載麥門冬湯的煎煮及服用方法“麥門冬七升，半夏一升，人參二兩，甘草二兩，粳米三合，大棗十二枚。上六味，以水一斗二升，煮取六升，溫服一升，日三夜一服。”[1]參照《經(jīng)方本原劑量問題研究》中東漢時期度量衡換算標準，所得用量明顯大于現(xiàn)代臨床用量。后世對該方用量進行了調(diào)整，在基本保留原方各藥味用量比例關(guān)系的基礎(chǔ)上，用量進行了下調(diào)，如《張氏醫(yī)通》等[4-5]。根據(jù)明朝李時珍漢唐“一兩”約合明代“一錢為3.73 g”的標準，換算結(jié)果為：人參用量3.73 g/錢×2 錢=7.46 g。以人參用量為基準，等比例換算出其他藥味劑量，確定了麥門冬湯處方組成為麥冬130.55 g、法半夏18.65 g、人參7.46 g、甘草7.46 g、粳米5.60 g、大棗9.70 g[4-5]。超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法（UPLC-Q-Orbitrap -MS）具有高分辨率、高掃描速率、精確的結(jié)構(gòu)表征等優(yōu)勢，可實現(xiàn)多種成分同時快速地鑒定和指認，已被廣泛應(yīng)用于中藥單體及復方化學成分的快速篩查和定性分析[6]。因此，本研究擬采用UPLC-QExactive Orbitrap-MS 技術(shù)快速分析麥門冬湯化學成分組成，對全方中6味藥同時實現(xiàn)了鑒別，為麥門冬湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及其未來現(xiàn)代制劑質(zhì)量標準制定提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、Ultimate 3000 超高效液相色譜系統(tǒng)（美國賽默飛世爾科技公司）；數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為Xcalibar 4.1 工作站（美國賽默飛世爾科技公司）；ME204E 十萬分之一天平（梅特勒-托利多公司）；KQ-3000E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Direct-Q5型超純水機（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

甲基麥冬二氫高異黃酮A 對照品、甲基麥冬二氫高異黃酮B 對照品、異甘草苷對照品和甘草素對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號分別為wkq19011510、wkq19011510、wkq18042008、wkq18030505，純度均大于98.00%）；人參皂苷Rg1對照品、人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Re 對照品、人參皂苷Rb2對照品、人參皂苷Rd 對照品、人參皂苷Rf 對照品、甘草苷對照品和甘草酸銨對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110703-201933、110704-202028、110754-201827、111715-201203、111818-201603、111719-201806、111610-201607、110731-201720，純度分別為93.4%、93.1%、93.4%、93.8%、92.1%、供鑒別用、93.1%）；人參皂苷Rc 對照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號為MUST-18032302，純度為99.7%）；麥冬皂苷D 對照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號為18012909，純度為98%）。麥冬、人參、甘草、粳米、大棗飲片（廣東一方制藥有限公司，批號分別為GP1903282、GP1810240、GP1812001、GP1908023 和GP1809185）、法半夏（四川天雄藥業(yè)有限公司，批號為GP11904034），經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任藥師鑒定，分別為麥冬Ophiopogon japonicus（L.f）Ker-Gawl.的干燥塊根，五加科植物人參Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根莖，豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.干燥根和根莖，禾本科植物稻（粳稻）Oryzasativa L.以及鼠李科植物棗Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果實，天南星科植物半夏Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥塊莖的相關(guān)炮制加工品，均符合2020 年版《中國藥典》（一部）中的相關(guān)規(guī)定。水為超純水，甲醇和乙腈為色譜純，甲酸為質(zhì)譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 檢測條件

2.1.1 色譜條件 Waters CORTECS T3 C18（2.1 mm×150 mm，1.6 μm）色譜柱；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～8 min，5%～18%B；8～11 min，18%～20%B；11～21 min，20%～21%B；21～23 min，21%～28%B；23～29 min，28%～30%B；29～38 min，30%～38%B；38～47 min，38%～55%B；47～54 min，55%～65%B）；流速為0.3 mL/min；柱溫為30°C；進樣量為2μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 HESI 離子源，正、負離子監(jiān)測模式；裂解電壓3.80 kV；輔助氣流量10 mL/min；離子傳輸管溫度320 ℃；輔助氣溫度350 ℃；掃描模式Full MS/dd-MS2，F(xiàn)ull MS 分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 500。MS/MS模式時，正負離子模式下的碰撞能均為20 eV，以亮氨酸腦啡肽為內(nèi)標校正質(zhì)量精度。

2.2 供試品溶液制備

根據(jù)處方考證結(jié)果，確定麥門冬湯的制備工藝為：稱取麥冬130.65 g、法半夏18.76 g、人參7.33 g、甘草7.43 g、粳米5.65 g、大棗9.74 g，加水2 400 mL，浸泡后采用傳統(tǒng)砂鍋先武火沸后文火煎煮至1 200 mL，濾過，濾液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至約450 mL的濃縮液，取濃縮液冷凍干燥，即得麥門冬湯凍干粉。精密稱取麥門冬湯凍干粉1.0 g，置具塞錐形瓶中，加75%（體積分數(shù)，下同）甲醇25 mL，超聲處理（功率300 W，頻率50 kHz）30 min，取出，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加75%甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，加75%甲醇至刻度，搖勻，0.22 μm 的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得，麥門冬湯供試品溶液。各單味藥的制備工藝如上，分別同法制備麥冬、法半夏、人參、甘草、粳米、大棗6味單味藥供試品溶液。

2.3 對照品溶液制備

精密稱取甲基麥冬二氫高異黃酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、麥冬皂苷D對照品適量，加75%甲醇使溶解，作為混合對照品溶液1；精密稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb2和人參皂苷Rd 對照品適量，加75%甲醇使溶解，作為混合對照品溶液2；精密稱取甘草苷、異甘草苷、甘草素和甘草酸銨對照品適量，加75%甲醇使溶解，作為混合對照品溶液3。

2.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)一級質(zhì)譜提供的精確相對分子質(zhì)量，采用Xcalibar 2.0 軟件計算可能的分子式（誤差范圍±5.0 ppm，1 ppm=1×10-6），將其他未知化合物的二級碎片離子與對照品、中藥成分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫（OTCML）、mzVault 2.0 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫、Compound Discoverer 3.0 軟件、Mass Frontier 8.0軟件結(jié)合相關(guān)文獻報道提供的裂解碎片進行比對，并根據(jù)二級碎片離子推導化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，進一步確定未知化合物的分子式及結(jié)構(gòu)。對于化合物中部分同分異構(gòu)體的鑒別，可通過與對照品比對或裂解規(guī)律的不同進行區(qū)分；對于裂解路徑一致的同分異構(gòu)體，主要采用ChemBioDraw Ultra 12.0 軟件給出的有機化合物疏水常數(shù)（logP）對極性大小進行判斷，同時結(jié)合文獻中化合物的保留時間（tR）進行推測。

3 結(jié)果

3.1 化合物鑒定

采用UPLC-Q-Orbitrap-MS 在“2.1”檢測條件下對供試品溶液和對照品溶液分別進行分析，得正、負離子模式下的總離子流圖（見圖1）。按照“2.4”數(shù)據(jù)處理方法，最終在麥門冬湯中鑒定出141 個化合物，包括黃酮及其苷類54 個、高異黃酮類27 個、三萜及其苷類40個、甾體皂苷類7個、苯丙素類7個和其他類6 個；其中14 個成分通過與對照品對比確認，單味藥歸屬，各化學成分的保留時間（tR）、準分子離子峰質(zhì)荷比的測量值、碎片離子等數(shù)據(jù)見表1。

圖1 麥門冬湯的UPLC-Q-Exactive MS的正離子（A）和負離子（B）總離子流圖Figure 1 Total ion chromatograms of UPLC-Q-Exactive MS of Maimendong Decoction in positive mode(A)and negative mode(B)

表1 麥門冬湯中化合物的UPLC-Q-Exactive MS定性分析結(jié)果Table 1 Qualitative analysis results of chemical constituents in Maimendong Decoction by UPLC-Q-Exactive MS

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

3.2 麥門冬湯中主要化學成分的質(zhì)譜裂解規(guī)律

3.2.1 黃酮類化合物 黃酮類化合物是麥門冬湯中主要的一類活性成分，該類化合物主要來自于麥冬、甘草和大棗，既有黃酮苷元，也有含糖基的黃酮苷。甘草中含有豐富的黃酮，其相關(guān)裂解規(guī)律的文獻報道較多[7]，黃酮苷多見丟失相應(yīng)糖基的苷元離子，其裂解規(guī)律與相應(yīng)苷元的準分子離子裂解規(guī)律一致。此外，對于黃酮及其苷類化合物的裂解，容易失去連在環(huán)上的取代基如羥基和甲氧基等；以及黃酮母核C 環(huán)的開裂或者重排，多可觀察到CH3、CO、HCO、CO2、CH2O2和C4H8等的中性丟失。C 環(huán)的開裂產(chǎn)生的離子對于母核的推斷具有重要的意義，本研究基于UPLC-Q-Exactive MS高分辨質(zhì)譜共鑒定了54個黃酮類化合物。

通過建立的LC-MS方法，在麥門冬湯中一共鑒別了32 種黃酮類化合物。為了幫助鑒定和證實其他黃酮類化合物，以甘草素為例闡述其可能的裂解規(guī)律。峰34（tR=20.56 min）在正離子模式檢測下，可以觀察到準分子離子峰為m/z257.081 0[M+H]+，利用軟件Xcalibur 4.0 分析其元素組成并推導其可能的分子式為C15H12O4，二級質(zhì)譜圖可觀察到碎片離子239.070 5 [M+H-H2O]+、211.075 3 [M+HC2H6O]+、163.039 5[M+H-C6H6O]+和137.023 4[M+H-C8H8O]+，通過相關(guān)文獻報道[7-10]及對照品比對，推測峰34 為甘草素，其可能的裂解規(guī)律見圖2。在麥門冬湯中共鑒定了22 種黃酮苷類化合物。峰16（tR=11.63 min）和30（tR=19.34 min）通過標準品無偏差地鑒別為甘草苷和異甘草苷。這里以負離子模式下的部分黃酮苷類化合物為例解析其裂解規(guī)律，例如峰16母離子為m/z417.119 9[M-H]-，其二級質(zhì)譜主要的碎片離子為255.066 5[M-H-Glc]-、227.196 9[M-H-Glc-CO]-、135.007 8[M-H-Glc-C8H8O]-，通過相關(guān)文獻報道[7-11]及對照品比對，推測峰16為甘草苷。

圖2 甘草素可能的裂解規(guī)律Figure 2 The possible fragmentation pathway of Liquiritigenin

3.2.2 高異黃酮類化合物 共鑒別了27種高異黃酮類化合物，主要來源于麥冬。麥冬黃酮為百合科沿階草屬特有高異黃酮，此類化合物結(jié)構(gòu)較異黃酮類化合物多1個碳原子，由色原酮、色滿酮的C3位接芐基而形成的一系列衍生物，為一類特殊的黃酮類化合物。根據(jù)所鑒定黃酮的碎裂規(guī)律，C 環(huán)與B 環(huán)連接鍵均易發(fā)生斷裂，A 環(huán)骨架較穩(wěn)定。與對照品峰保留時間和二級質(zhì)譜圖對比，確認峰134 為麥冬二氫高異黃酮A，峰136為麥冬二氫高異黃酮B。以麥冬二氫高異黃酮A 為例，峰134 在正離子模式檢測下，準分子離子峰為m/z343.118 2 [M+H]+，在負離子模式下檢測到m/z341.103 6 [M-H]-，利用軟件Xcalibur 4.0分析其元素組成并推導其可能的分子式為C19H18O6。在正離子模式下，二級質(zhì)譜圖可見m/z325.108 1[M-H-H2O]-、207.065 5[M-H-C8H8O2]-、189.055 6[M-H-C8H8O2-H2O]-和135.044 2[M-HC12H10O2]-的碎片離子，經(jīng)與對照品對比，確定該化合物為麥冬二氫高異黃酮A，結(jié)合文獻報道[12-15]和特征離子碎片推測其可能的裂解途徑見圖3。

圖3 麥冬二氫高異黃酮A的裂解規(guī)律Figure 3 The fragmentation pathway of Ophiopogonanone A

3.2.3 三萜類化合物 共鑒定出40 種三萜類成分，包括三萜及其苷類，主要來源于人參、甘草、大棗和粳米。此類成分的LC-MS 總離子流圖在正負離子模式下均有較好的響應(yīng)度，在負離子模式下容易形成[M-H]-和[M+HCOO]-的準分子離子，而在正離子模式下，被電離的分子易結(jié)合氫和鈉離子而形成[M+H]+和[M+Na]+的準分子離子。人參皂苷類成分大多具有相同的基本結(jié)構(gòu)，其母核結(jié)構(gòu)大部分是由17 個碳原子組成的四元環(huán)，來源于甘草、粳米和大棗的三萜及其苷類屬于五環(huán)三萜型。同時，其苷元母核結(jié)構(gòu)中含有葡萄糖醛酸（Glc A）、葡萄糖（Glc）、鼠李糖（Rha）、阿拉伯糖（Ara）及木糖（Xyl）等糖鏈。因此，該類化合物在質(zhì)譜條件下主要發(fā)生糖鏈、側(cè)鏈的裂解和脫水。

共鑒定了四環(huán)三萜類皂苷16種，其中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf、人參皂苷Rc、人參皂苷Rb2和人參皂苷Rd是通過與對照品峰保留時間和二級質(zhì)譜圖對比確認。以人參皂苷Re（峰39）為例，在負離子模式下，顯示其準分子離子m/z991.551 8 [M+HCOO]-和945.544 7 [MH]-其主要的特征碎片離子為m/z799.486 7[M-HRha]-、637.432 1[M-H-Rha-Glc]-、619.420 2[M-H-Rha-Glc-H2O]-、475.382 2 [M-H-Rha-2Glc]-等，是準分子離子峰失去1 分子鼠李糖和2 分子葡萄糖而產(chǎn)生，通過與對照品及相關(guān)文獻[16-19]比對，鑒定為人參皂苷Re。

共鑒定了24種五環(huán)三萜及其苷類成分，此類化合物苷元部分上的基團特征多為C22位含有乙?；u基或者鼠李糖，C30為多含有羧基，C3為多含葡萄糖醛酸、葡萄糖或者鼠李糖等，而C24的為少數(shù)含有羥基，其裂解規(guī)律為中性丟失AcOH、H2O、CH2O及HCOOH 等中性分子[20]。以甘草酸為例闡述三萜皂苷類成分的裂解規(guī)律。該化合物的正離子質(zhì)譜中可以觀察到m/z823.412 1 [M+H]+，負離子質(zhì)譜中給出了m/z821.398 7 [M-H]-，綜合分析確定了其分子式為C42H62O16。在正離子二級質(zhì)譜的碎片峰中可以發(fā)現(xiàn)m/z645.370 2 [M-H-Glc A]-，469.327 4 [M-H-2Glc A]-，和351.056 7 [M-H-470 Da]-，確定結(jié)構(gòu)中C3位連接2 個葡萄糖醛酸的結(jié)構(gòu)，且470 Da 應(yīng)該為苷元的相對分子質(zhì)量。后又觀察到803.410 4[M-H-H2O]-，627.358 6[M-H-Glc AH2O]-，和583.366 6[M-H-Glc A-H2O-CO2]-等碎片離子，結(jié)合文獻報道[20-23]及與對照品對比，最后推測峰84為甘草酸。

3.2.4 甾體皂苷類化合物 甾體皂苷主要來源于方中的麥冬，共鑒定了7種甾體皂苷類化合物，是麥冬的特征性成分。該類化合物因分子結(jié)構(gòu)中連有多個糖基和羥基，易發(fā)生丟失所連糖基或脫水的中性丟失。峰126 在正負離子模式下，分別顯示了m/z855.464 8 [M+H]+和853.461 7 [M-H]-的準分子離子峰，利用軟件分析其元素組成并推導其可能的分子式為C44H70O16。在正離子模式的二級質(zhì)譜中，該母離子連續(xù)丟失糖基和脫水，形成m/z723.433 0[M+H-Xyl]+、577.375 4[M+H-Xyl-Rha]+、559.367 3[M+H-Xyl-Rha-H2O]+、431.316 5 [Aglycone+H]+、413.305 3 [Aglycone+H-H2O]+、287.200 7 [Agly‐cone+H-144]+，269.190 3 [Aglycone+H-144-H2O]+等的特征碎片離子，結(jié)合文獻報道[22-27]及與對照品對比，最后推測峰126為麥冬皂苷D，其可能的裂解規(guī)律見圖4。

圖4 麥冬皂苷D的裂解規(guī)律Figure 4 The fragmentation pathway of Ophiopogonin D

3.2.5 苯丙素類化合物 通過UPLC-Q-Exactive MS數(shù)據(jù)分析，結(jié)合文獻對比共識別了在7 種苯丙素類化合物，均來源于方中的法半夏、粳米、甘草和大棗。苯丙素類成分以異落葉松脂素-9'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷為例。例如峰23 在正離子模式下保留時間為16.42 min 時為給出了m/z523.216 3[M+H]+的準分子離子，經(jīng)軟件計算的其分子式為C26H34O11，該母離子連續(xù)丟失糖基和脫水，形成二級碎片主要有m/z361.128 4 [M+H-Glc]+、343.118 4 [M+H-Glc-H2O]+和237.076 0[M+H-Glc-124 Da]+等。由于具有以上特征的裂解碎片峰，并與文獻報道數(shù)據(jù)對比[28-30]，將峰23 鑒定為異落葉松脂素-9'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

3.2.6 其他化合物 從麥門冬湯中還鑒別了一些其他的成分，包括芳香酸類、生物堿等類化合物，主要來源于法半夏、大棗、粳米和甘草[28-30]。芳香酸類成分在質(zhì)譜中的裂解特征主要為丟失CO、CO2、H2O等中性分子。根據(jù)裂解規(guī)律并結(jié)合文獻報道[28-29]，鑒定了麥門冬湯中的芳香酸類化合物。以峰4（原兒茶酸）為例，在二級質(zhì)譜中，其準分子離子峰為[M-H]-m/z153.018 4，丟失一分子CO2，得到m/z109.028 3，準分子離子丟失一分子H2O，得到m/z135.007 6。類似的，其他芳香酸類和生物堿類化合物得到鑒定[28-30]。

4 討論

中藥復方成分復雜，根據(jù)各種成分的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，綜合超聲提取、索氏提取、加熱回流提取等方法的優(yōu)劣點，超聲提取法簡單、快速、高效，因此實驗采用超聲提取法對麥門冬湯進行處理。對提取溶劑（50%、75%、100%甲醇及水，50%、75%、100%乙醇及水）進行考察，結(jié)果表明75%甲醇提取所得到的化學成分信息最多，因此選擇75%甲醇作為提取溶劑。本實驗考察了甲醇-水體系和乙腈-水體系對麥門冬湯提取物的分離能力，發(fā)現(xiàn)乙腈和水體系表現(xiàn)出更好的分離和洗脫能力。對乙腈-水體系的水相pH 進行考察，分別考察0.01%甲酸、0.1%甲酸和0.2%甲酸，發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸水可以防止峰的嚴重拖尾，最終確定乙腈-0.1%甲酸水體系。在此研究的基礎(chǔ)上，優(yōu)化麥門冬湯的質(zhì)譜條件，通過考察不同裂解能量對麥門冬湯化學成分的影響，優(yōu)化了最佳裂解條件，最終正負離子模式下均選擇20 eV 作為碰撞能量。

古代經(jīng)典名方是指療效確切、應(yīng)用廣泛并具有明顯特色與優(yōu)勢的古代中醫(yī)典籍所記載的方劑。目前麥門冬湯臨床主要用于慢性萎縮性胃炎和慢性肺纖維化等呼吸道疾病患者，且療效顯著[1-2]。麥門冬湯由多味藥組成，化學成分復雜。本研究采用UPLC-Q-Exactive MS 技術(shù)對麥門冬湯的化學成分進行快速分析和鑒別，采用正、負離子2種模式進行分析，首次從麥門冬湯中共鑒定出141個化學成分，包括黃酮及其苷類54 個、高異黃酮類27 個、三萜及其苷類40個、甾體皂苷類7個、苯丙素類7個和其他類6個。首次對經(jīng)典名方麥門冬湯的化學成分進行了全成分分析，本研究結(jié)果進一步豐富了麥門冬湯的物質(zhì)基礎(chǔ)，系統(tǒng)闡明了麥門冬湯的化學組成，為進一步明確其質(zhì)量控制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了參考。