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        桑枝不同部位超高效液相特征圖譜建立及化學(xué)模式識別研究

        2023-02-20 05:22:28鄧?yán)罴t陳仕妍王壽富林偉雄張雪蘭邱彩月黃貴發(fā)張正
        廣東藥科大學(xué)學(xué)報 2023年1期
        關(guān)鍵詞:桑枝綠原藥材

        鄧?yán)罴t,陳仕妍,王壽富,林偉雄,張雪蘭,邱彩月,黃貴發(fā),張正

        (1.廣東一方制藥有限公司,廣東佛山 528244;2.廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室,廣東佛山 528244)

        桑枝始載于《本草圖經(jīng)》[1],為??粕僦参锷orus albaL.的干燥嫩枝,味微苦,性平,入肝經(jīng),具有祛風(fēng)濕、利關(guān)節(jié)功效,可治療風(fēng)濕痹病、肩臂、關(guān)節(jié)酸痛麻木等癥,臨床上常用于治療肩臂關(guān)節(jié)腫痛、四肢痙攣和肌體風(fēng)癢等疾病[2-3]。桑枝的資源非常豐富,在全國各地均有分布,但主產(chǎn)于浙江、安徽、江蘇、湖南等地[4],一般春末夏初采收,呈長圓柱形,少有分枝,長短不一,從結(jié)構(gòu)上可分為木質(zhì)部和韌皮部兩部位,各約占全桿桑枝的72%、27%,另髓芯部約占1%[5]。現(xiàn)代研究表明,桑枝主要含有黃酮類、生物堿類、木質(zhì)素類、果膠類、多糖類等化學(xué)成分[6-8],不同部位化學(xué)成分差異較大,如木質(zhì)素和多糖類在木質(zhì)部中的含量占比略高,而韌皮部中則含有較多的果膠類成分[9]。為進(jìn)一步探究桑枝不同部位的化學(xué)成分差異,彌補《中國藥典》2020 年版桑枝項下僅有性狀和顯微鑒別,而無相關(guān)化學(xué)成分定性定量分析的空白。本研究通過建立超高效液相色譜法,獲得桑枝及其不同部位全面系統(tǒng)的超高效液相特征圖譜,運用方差分析、熱圖和聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法判別分析等化學(xué)模式識別方法對超高效液相特征圖譜中的多指標(biāo)變量進(jìn)行統(tǒng)計分析,深入研究桑枝不同部位主要特征性成分的差異,對完善桑枝質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂及今后桑枝資源綜合開發(fā)利用具有重要意義。

        1 材料

        1.1 儀器

        Waters H-Class 型超高效液相色譜儀(美國Waters 公司);ME204E 型、XP26 型分析天平(瑞士METTLER TOLEDO 公司);KQ-500DE 型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);111B 型二兩裝高速中藥粉碎機(浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司);MiliQ Direct 8 型超純水機(德國Merck 有限公司)。

        1.2 藥品與試劑

        桑皮苷A 對照品(純度≥98%,批號18052901,購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司);綠原酸對照品(純度:96.30%,批號110753-202119,購自中國食品藥品檢定研究院);隱綠原酸對照品(純度:99.30%,批號DST220104-035,購自成都德斯特生物技術(shù)有限公司);乙腈為色譜級(默克公司),其余試劑為分析純,水為超純水。10 批桑枝藥材(編號S1-S10)經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅教授鑒定為桑科植物桑Morus albaL.的干燥嫩枝,來源信息詳見表1。將10 批桑枝藥材不同部位分開,分別得木質(zhì)部芯桿(編號G1-G10)、韌皮部皮(編號P1-P10)。

        表1 10批桑枝來源信息Table 1 Source information of 10 batches of Ramulus Mori

        2 方法與結(jié)果

        2.2 特征圖譜的建立

        2.2.1 色譜條件 Waters HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);流動相A:乙腈,流動相B:0.1%磷酸,梯度洗脫(0~2 min,9%~13%A;2~6 min,13%~14%A;6~7 min,14%~23%A;7~18 min,23%~40%A;18~19 min,40%~68%A;19~20 min,68%~9%A);檢測波長:320 nm;流速:0.3 mL·min-1;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:1 μL。

        2.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱定桑皮苷A、綠原酸、隱綠原酸對照品,加50%甲醇制成每1 mL分別含86.05 μg桑皮苷A、98.90 μg綠原酸、88.48 μg隱綠原酸的溶液,作為對照品參照物溶液。

        2.2.3 供試品溶液的制備 取桑枝樣品粉末(過三號篩)約0.5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇50 mL,稱定重量,超聲(功率:500 W,頻率:40 kHz)處理15 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用50%甲醇補足減失質(zhì)量,搖勻,采用0.22 μm濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得。

        2.2.4 精密度考察 取桑枝藥材粉末適量,按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件檢測樣品,重復(fù)進(jìn)樣6 次,以2 號峰桑皮苷A為參照峰(S),計算得到各特征峰相對保留時間(RRT)和相對峰面積(RPA)的RSD均小于3%,提示儀器精密度良好。

        2.2.5 重復(fù)性考察 取桑枝藥材粉末適量,平行6份,按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣檢測樣品,以2 號峰桑皮苷A 為參照峰(S),計算得到各特征峰RRT 和RPA 的RSD均小于3%,提示該方法重復(fù)性良好。

        2.2.6 穩(wěn)定性考察 取桑枝藥材粉末適量,按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,室溫放置,分別在樣品制備后0、2、4、8、12、24 h 按照“2.2.1”項下色譜條件檢測樣品,以2 號峰桑皮苷A 為參照峰(S),計算得到各特征峰RRT 和RPA 的RSD 均小于5%,提示供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.2.7 桑枝特征圖譜的建立 按“2.2.3”項下方法制備10批桑枝藥材供試品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件檢測,采集色譜圖,將其導(dǎo)入國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)》軟件中進(jìn)行色譜圖匹配,建立桑枝藥材的特征圖譜。以S1圖譜作為參照圖譜,時間窗寬度設(shè)置為0.1 min,經(jīng)多點校正、全譜峰匹配、中位數(shù)法生成10批桑枝藥材的共有特征圖譜及對照特征圖譜,10 批桑枝藥材共有特征圖譜中共標(biāo)定了共有峰11個,通過對照品比對,指認(rèn)了2 號峰為桑皮苷A、4 號峰為綠原酸、5 號峰為隱綠原酸,詳見圖1、2。計算10 批桑枝藥材特征圖譜與生成的共有對照特征圖譜的相似度為0.936、0.971、0.859、0.989、0.994、0.865、0.982、0.940、0.924、0.898,表明不同批次桑枝樣品間質(zhì)量一致性整體較好。

        圖1 10批桑枝藥材共有特征圖譜Figure 1 Common characteristic chromatograms in 10 batches of Ramulus Mori

        2.2.8 桑枝不同部位特征圖譜評價 按“2.2.3”項下方法制備10批桑枝芯桿及皮兩部位的供試品溶液,按“2.2.1”項下色譜條件檢測,采集色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012版)》軟件中進(jìn)行色譜圖匹配,分別以G1、P1 圖譜作為參照圖譜,經(jīng)多點校正、全譜峰匹配生成10批桑枝芯桿及皮兩部位的共有特征圖譜,同時采用中位數(shù)法分別生成對照特征圖譜,10 批桑枝芯桿及皮共有特征圖譜中均標(biāo)定了11 個共有峰。共有特征圖譜詳見圖3,對照特征圖譜詳見圖4。

        圖2 桑枝藥材對照圖譜和對照品圖譜Figure 2 Reference characteristic chromatogram of Ramulus Mori and chromatograms of mixed reference substances

        圖3 桑枝芯桿(A)和皮(B)共有特征圖譜Figure 3 Common characteristic chromatograms of Ramulus Mori core rod(A)and bark(B)

        圖4 桑枝芯桿和皮的對照特征圖譜Figure 4 Reference characteristic chromatograms of Ramulus Mori core rod and bark

        2.3 化學(xué)模式識別分析

        2.3.1 方差分析 采用SPSS 20.0 軟件對10 批桑枝藥材、芯桿和皮共有特征峰的單位峰面積(μAu*s/g)進(jìn)行單因素方差分析。結(jié)果顯示,芯桿的峰3、5、10,皮的峰1、2、4、5、9-11 與藥材間的單位峰面積差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),表明藥材各特征峰的含量與芯桿接近,而與皮差異較大,或與芯桿在藥材占比較大有關(guān);芯桿的峰1-4、11 與皮間的單位峰面積差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,即桑枝皮中峰1-4的單位峰面積顯著大于桑枝芯桿,而桑枝皮中峰11的單位峰面積則顯著小于桑枝芯桿,此外峰5、6、9、10 的單位峰面積在芯桿中含量略高,峰7、8 的單位峰面積在皮中含量略高,表明桑枝不同部位含有的化學(xué)成分存在一定差異。10 批桑枝不同部位特征圖譜共有峰單位峰面積的方差分析結(jié)果見表2。

        表2 桑枝不同部位樣品特征圖譜共有峰峰面積方差分析結(jié)果Table 2 Variance analysis of common peak area of different parts of Ramulus Mori(,n=10)

        表2 桑枝不同部位樣品特征圖譜共有峰峰面積方差分析結(jié)果Table 2 Variance analysis of common peak area of different parts of Ramulus Mori(,n=10)

        與藥材比較:aP<0.05;與芯桿比較:bP<0.05

        2.3.2 熱圖和聚類分析 以11 個共有特征峰單位峰面積為變量,采用對數(shù)歸一化方式,以Euclidean 平方距離為度量標(biāo)準(zhǔn),使用HemI 1.0軟件對10批桑枝藥材、芯桿和皮特征圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行熱圖和聚類分析。熱圖分析結(jié)果顯示桑枝藥材、芯桿和皮間化學(xué)成分含量差異較大,其中桑枝皮1-4共有特征峰顏色偏暖,表明其所含各成分含量較藥材、芯桿高;桑枝皮9-11 共有特征峰稍偏冷,表明其所含各成分含量均較藥材、芯桿低;5~8 特征峰在桑枝藥材、芯桿和皮間顏色相近,表明其所含化學(xué)成分含量差異較?。怀Vλ幉牡腟8樣品與桑枝皮樣品聚在一起外,樣品聚類分析結(jié)果顯示桑枝藥材和芯桿可大致聚為Ⅰ類,桑枝皮大致聚為Ⅱ類,表明桑枝芯桿與藥材的一致性較高,且與皮區(qū)分明顯,如圖5所示。

        圖5 桑枝不同部位的熱圖聚類分析圖Figure 5 Heat map and dendrogram of hierarchical cluster analysis of different parts of Ramulus Mori

        2.3.3 PCA 分析 在聚類分析的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步采用主成分分析(PCA)對桑枝藥材、芯桿和皮樣品進(jìn)行比較,通過數(shù)學(xué)降維的原理,從10批桑枝藥材、芯桿和皮樣品原數(shù)據(jù)中提取幾個具代表的綜合性指標(biāo)來代替多個原始變量。PCA 分析結(jié)果中提取到4個特征值大于1 的主成分(PC),可用于反映桑枝藥材、芯桿和皮樣品特征圖譜86.08%以上信息,其中PC1 貢獻(xiàn)率為31.82%,貢獻(xiàn)率最大,PC2 貢獻(xiàn)率為27.28%,PC3 貢獻(xiàn)率為17.59%,PC4貢獻(xiàn)率為9.40%。由前3 個主成分建立坐標(biāo)系,得到10 批桑枝藥材、芯桿和皮樣品的PCA得分圖(詳見圖6),由圖可見,桑枝藥材與芯桿聚為一類,桑枝皮單獨聚為一類,PCA 的整體區(qū)分與熱圖聚類分析結(jié)果一致。根據(jù)桑枝不同部位共有峰成分矩陣,主成分1的信息來自峰1、2、4、8,其中2號峰為桑皮苷A、4號峰為綠原酸;主成分2 的信息來自峰6、9、10、11;主成分3 的信息來自峰3、7;主成分4 的信息來自峰5隱綠原酸。詳見表3。

        表3 桑枝不同部位成分矩陣Table 3 Composition matrix of different parts of Ramulus Mori

        圖6 桑枝不同部位樣品的主成分分析得分圖Figure 6 Principal component analysis score plot of different parts of Ramulus Mori samples

        以Y1,Y2,Y3、Y4 代表4 個主成分來作為10 批不同部位桑枝成分所表達(dá)的信息,建立桑枝不同部位品質(zhì)評價模型,得出如下成分的線性關(guān)系表達(dá)式分別為Y1=F1*0.906+F2*0.890+F3*0.613+F4*0.649-F5*0.043+F6*0.359+F7*0.568+F8*0.747+F9*0.049-F10*0.231-F11*0.152;Y2=F1*0.041-F2*0.040-F3*0.031-F4*0.346+F5*0.570+F6*0.541+F7*0.178+F8*0.341+F9*0.818+F10*0.828+F11*0.870;Y3=F1*0.280-F2*0.324+F3*0.710+F4*0.553+F5*0.368+F6*0.202-F7*0.672-F8*0.530+F9*0.034+F10*0.181-F11*0.008;Y4=-F1*0.222+F2*0.155+F3*0.248-F4*0.279+F5*0.691+F6*0.055+F7*0.290-F8*0.085-F9*0.488-F10*0.049-F11*0.091。結(jié)合1、2、3、4 主成分方差貢獻(xiàn)率,桑枝藥材、芯桿和皮的綜合評價表達(dá)式Y(jié)綜合得分=(Y1*31.82+Y2*27.28+Y3*17.59+Y4*9.40)/86.08,根據(jù)以上公式得到桑枝藥材、芯桿和皮的綜合評價得分及排名,排名前10的樣品中桑枝皮占了7 批,排名前20 的樣品中桑枝藥材占了7 批、桑枝皮占了9 批,表明桑枝皮的化學(xué)成分綜合質(zhì)量水平優(yōu)于桑枝藥材及芯桿,桑枝藥材綜合質(zhì)量水平則介于桑枝皮和芯桿之間。詳見表4。

        表4 桑枝不同部位主成分得分及綜合得分排名Table 4 Ranking of principal component scores and comprehensive scores of different parts of Ramulus Mori

        2.3.4 OPLS-DA 分析 為了進(jìn)一步明確桑枝藥材、芯桿和皮樣品之間產(chǎn)生差異的主要標(biāo)志物,基于主成分分析(PCA)結(jié)果,采用監(jiān)督模式識別法進(jìn)行桑枝藥材、芯桿和皮樣品間正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA),計算出對差異貢獻(xiàn)較大的因素。以模型變量投影(VIP)值為指標(biāo)對引起桑枝藥材、芯桿和皮樣品間差異的成分進(jìn)行分析,篩選貢獻(xiàn)較大的6 個變量(以VIP 值>1 為標(biāo)準(zhǔn)),分別為1 號峰(VIP=1.247)、10 號峰(VIP=1.171)、4 號綠原酸峰(VIP=1.134)、2 號桑皮苷A 峰(VIP=1.133)、3 號峰(VIP=1.072)和11 號峰(VIP=1.046),提示上述6 個成分是引起桑枝藥材、芯桿和皮樣品間成分差異的主要標(biāo)志性成分,其余峰VIP 值小于1,對樣品的區(qū)分影響較小。詳見圖7。

        圖7 桑枝不同部位樣品11個共有峰的VIP值Figure 7 VIP values of 11 common peaks of different parts of Ramulus Mori

        3 討論

        本研究通過建立桑枝不同部位超高效液相特征圖譜,結(jié)合方差分析、熱圖和聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘法判別分析進(jìn)行化學(xué)模式識別分析,能將桑枝芯桿與皮進(jìn)行有效地區(qū)分。方差分析結(jié)果表明桑枝不同部位所含的化學(xué)成分存在較大差異,偏水溶性成分(峰1-4)含量主要富集在桑枝皮中,偏脂溶性成分(峰9-11)含量主要富集在桑枝芯桿中,這與熱圖分析結(jié)果桑枝皮1-4共有特征峰顏色偏暖,9-11 共有特征峰顏色偏冷相符。PCA 分析結(jié)果顯示桑枝藥材與芯桿聚為一類,桑枝皮單獨聚為一類,與熱圖聚類分析結(jié)果一致,進(jìn)一步建立桑枝不同部位品質(zhì)評價模型,表明桑枝皮的化學(xué)成分的綜合質(zhì)量水平優(yōu)于桑枝藥材及芯桿,或為桑枝不同結(jié)構(gòu)組織上的差異導(dǎo)致主要化學(xué)成分的合成和積累不同,同時又因芯桿占藥材的絕大部分導(dǎo)致藥材質(zhì)量與芯桿相似,故在藥材采收時應(yīng)綜合考慮不同生長年限、不同直徑大小等因素下皮和芯桿主要化學(xué)成分的合成積累,另在藥材加工時也應(yīng)注意對皮部的保留以確保藥材品質(zhì)。OPLS-DA分析進(jìn)一步明確了桑枝藥材、芯桿和皮樣品之間產(chǎn)生差異的6 個主要標(biāo)志物,其中標(biāo)志物之一桑皮苷A為二羥基芪類化合物,又稱為氧化白藜蘆醇苷,主要存在于桑屬植物中[10-11],在桑枝藥材中質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對較高,具有鎮(zhèn)咳平喘、抗炎鎮(zhèn)痛、抑制絡(luò)氨酸酶、抗氧化活性以及逆轉(zhuǎn)耐藥活性等多種作用[12-14],作為評價桑枝不同部位差異及藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)具有重要意義。

        本研究建立的超高效液相特征圖譜和化學(xué)模式識別分析方法能較好地反映桑枝不同部位化學(xué)成分的分布規(guī)律及差異性?!吨袊幍洹?020 年版收載的桑枝來源為桑的嫩枝,規(guī)定其直徑應(yīng)為0.5~1.5 cm,但未對嫩枝的生長年限做明確的規(guī)定[2],劉善新等[15]通過比較不同生長年限桑枝中的黃酮成分,發(fā)現(xiàn)生長時間在半年內(nèi)的桑枝,黃酮的總含量和種類均明顯少于生長時間1 年以上的桑枝,因此桑枝藥材質(zhì)量控制應(yīng)關(guān)注不同生長時期不同部位主要成分桑皮苷A 及其他化學(xué)成分的含量變化規(guī)律,同時結(jié)合藥效學(xué)及安全性評價開展進(jìn)一步的系統(tǒng)研究。

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