張建軍，李潔環(huán)，王利勝，蘇安宇

[1.廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院），廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006]

參芩方由苦參、黃芩、黃柏等藥味組成，原為搽劑，是廣東省第二中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，多年來一直用于治療由濕疹引起的皮膚瘙癢或炎癥感染、糜爛、結(jié)痂，療效確切，年使用量達(dá)1 萬瓶。但是參芩搽劑的生物利用度較低，其所含有效成分因水溶性低極易結(jié)晶析出，難以分散均勻，臨床使用過程中易干燥，藥物作用時(shí)間短，且載藥量小，皮損廣泛者用藥也受到限制，因而制約了其推廣應(yīng)用。為提高該方有效成分的溶解度和分散度，增加藥物透皮吸收，提高其生物利用度，課題組在前期的研究中，已將其開發(fā)制成了凝膠制劑，完成參芩凝膠處方的篩選及制備工藝優(yōu)化，現(xiàn)擬進(jìn)一步研究其體內(nèi)皮膚局部藥動(dòng)學(xué)。

微量滲析取樣技術(shù)是基于膜滲析原理，將滲析探針埋植于活體組織中，在基本不干擾正常體內(nèi)生命過程的情況下，實(shí)現(xiàn)活體的連續(xù)、動(dòng)態(tài)采樣，具有多部位、多組分同時(shí)取樣，取樣量少，避免活體處于失血狀態(tài)等優(yōu)點(diǎn)；且取出樣品雜質(zhì)含量少，可直接進(jìn)入分析系統(tǒng)，分析條件更接近體內(nèi)條件[1-2]。小檗堿和黃芩苷是參芩凝膠中的重要活性成分，其中，小檗堿具有抗病原微生物、抗腫瘤、抗炎等活性[3]，其通過降低T 細(xì)胞與外基質(zhì)的黏附能力，阻斷炎性細(xì)胞mRNA 的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄發(fā)揮抗炎作用[4]；黃芩苷具有抗炎、抗病毒、抗菌等生物活性[5]，可通過Toll樣受體（TLR）、脂多糖（LPS）等影響效應(yīng)分子的表達(dá)和分泌，并影響腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素（IL）等炎癥因子的水平，干擾相關(guān)信號(hào)通路，從而達(dá)到改善炎癥的作用[6]。本研究旨在建立小檗堿、黃芩苷皮膚在體微量滲析取樣方法，考察回收率的穩(wěn)定性等，以明確所建立的微滲析方法的可行性，并初步考察冰片對(duì)參芩凝膠的促滲透作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀（悟空K2025）；AUW120D 十萬分之一電子分析天平（日本SHIMADZU 公司）；90-1 型恒溫磁力攪拌器（上海滬西分析儀器公司）；微量滲析取樣系統(tǒng)：MD-0100 灌注器、MD-1001 灌注器推進(jìn)泵、MD-1000B 流速控制器（美國BAS）；CMA30 線性探針（直徑0.24 mm，分子截留量6 kDa，瑞典CMA）；KQ5200DE 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

苦參、黃芩、黃柏等飲片購自廣州金芝中藥飲片有限公司，經(jīng)廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院劉法錦研究員鑒定，苦參（產(chǎn)地：黑龍江）為豆科植物苦參Sophora flavescensAit.的干燥根的加工炮制品，黃芩（產(chǎn)地：山西）為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根的加工炮制品，黃柏（產(chǎn)地：四川）為蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinenseSchneid.的干燥樹皮的加工炮制品，冰片（合成龍腦）購自福建青松股份有限公司，上述飲片經(jīng)鑒定均為正品，質(zhì)量均符合《中國藥典》2020 年版一部各飲片項(xiàng)下的有關(guān)規(guī)定。

黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)110715-201318，純度93.3%）、鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)110713-200911，純度86.8%）（中國食品藥品檢定研究院）；乙腈（色譜純，美國MREDA 公司）；磷酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；無水乙醇（分析純，天津津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠）；氯化鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；烏來糖（上海源葉生物科技有限公司）；肝素鈉（150 u/mg，蘭杰柯科技有限公司）；肉豆蔻酸異丙酯、聚氧乙烯蓖麻油（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；丙三醇（湖南爾康制藥股份有限公司）；參芩凝膠（實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性Wistar 大鼠，體質(zhì)量200～240 g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（粵）2019-0202，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 小檗堿、黃芩苷含量測(cè)定方法的建立[7]

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱：Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸溶液（30∶70）；檢測(cè)波長：230 nm；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.1.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取黃芩苷對(duì)照品8.00 mg、鹽酸小檗堿對(duì)照品3.00 mg 于100 mL 量瓶中，用30%乙醇生理鹽水溶解并定容至刻度，配成黃芩苷濃度為80.0 μg/mL、鹽酸小檗堿濃度為30.0 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的配制 分別以黃芩苷和鹽酸小檗堿混合對(duì)照品溶液、30%乙醇生理鹽水為灌注液[8-10]，分別通過微量滲析探針灌注，收集滲析液，分別作為體外滲析液樣品和空白滲析液樣品。

2.1.4 專屬性試驗(yàn) 取上述混合對(duì)照品溶液、體外滲析液和空白滲析液樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，黃芩苷、小檗堿峰形良好，滲析液中其他成分對(duì)本測(cè)定無干擾。見圖1。

圖1 黃芩苷和小檗堿的HPLC圖Figure 1 HPLC diagrams of baicalin and berberine

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密量取上述混合對(duì)照品溶液0.001、0.01、0.02、0.04、0.1、0.2 mL，分別置于1 mL 量瓶中，加30%乙醇生理鹽水稀釋至刻度，配制成濃度分別為0.08、0.8、1.6、3.2、8.0、16.0 μg/mL的黃芩苷對(duì)照品溶液和濃度為0.03、0.3、0.6、1.2、3.0、6.0 μg/mL 的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）作圖，得黃芩苷線性回歸方程為Y=12.104X-0.291 2，r2=0.999 9；鹽酸小檗堿線性回歸方程為Y=28.934X-0.854 8，r2＝0.999 7。表明黃芩苷在0.08～16.0 μg/mL、小檗堿在0.03～6.0 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 取黃芩苷、鹽酸小檗堿濃度分別為8.0、3.0 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10 μL測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算得黃芩苷、小檗堿峰面積RSD分別為0.32%、0.38%，表明儀器的精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取微量滲析液樣品，于第0、2、4、6、8、12、24 h 分別進(jìn)樣10 μL 測(cè)定，計(jì)算黃芩苷、小檗堿峰面積RSD 值分別為2.88%、0.40%，表明黃芩苷和小檗堿在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2 微量滲析探針回收率和空白耗損率的測(cè)定

增量法：探針外藥物經(jīng)膜滲入探針內(nèi)，使空白灌注液中藥物濃度升高，這個(gè)過程叫藥物的回收。回收率（R）=C滲析/C組織×100%，其中C滲析代表滲析液中藥物的濃度，C組織代表探針植入組織中藥物的濃度。

減量法：探針內(nèi)藥物經(jīng)膜流出探針外，使含藥灌注液藥物濃度降低，這個(gè)過程叫藥物的損失或耗損。損失率（L）=（C灌注-C滲析）/C灌注×100%，其中C滲析代表滲析液中藥物的濃度，C灌注代表灌注液中藥物的濃度。

2.3 灌注速度與取樣間隔的確定

取黃芩苷、鹽酸小檗堿濃度分別為8.0、3.0 μg/mL的混合對(duì)照品溶液適量，置于燒瓶中，將線性探針浸入其中，保鮮膜封住。以30%乙醇生理鹽水為灌注液，溫度控制在37 ℃左右，在0.5、1、2、3、4 μL/min的流速下進(jìn)行灌注，灌注1 h 后開始收集不同流速下的滲析液，平行收集3 個(gè)樣品，每個(gè)樣品30 μL。按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算探針體外回收率。

同法將探針浸于30%乙醇生理鹽水中，以黃芩苷、鹽酸小檗堿混合對(duì)照品溶液（黃芩苷濃度為8.0 μg/mL、鹽酸小檗堿濃度為3.0 μg/mL）為灌注液，同法在不同流速下灌注并進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算探針體外空白耗損率。結(jié)果見圖2。

圖2 灌注速度對(duì)體外回收率和空白耗損率的影響Figure 2 The effects of perfusion speeds on the in vitro R and L of the probe(,n=3)

由結(jié)果可知，黃芩苷、小檗堿探針體外回收率均與灌注速度呈負(fù)相關(guān)，以0.5 μL/min 的灌注速度下體外回收率最高，但低灌注速度下取樣時(shí)間延長，樣品間誤差增大，不利于數(shù)據(jù)獲取，而且實(shí)驗(yàn)效率低下。綜合考慮，確定灌注速度為1 μL/min，取樣間隔為30 min，此條件下黃芩苷和小檗堿的探針體外回收率分別為（38.01±0.42）%和（44.74±0.33）%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，同一灌注速度下兩個(gè)成分的體外回收率與空白耗損率基本一致，表明反滲析法適用于計(jì)算體內(nèi)回收率。

2.4 藥物濃度對(duì)體外回收率的影響

取黃芩苷、鹽酸小檗堿濃度分別為16.0、6.0 μg/mL，8.0、3.0 μg/mL，3.2、1.2 μg/mL、0.8、0.3 μg/mL 的4 組混合對(duì)照品溶液，置于燒瓶中，將探針依次浸入其中，保鮮膜封住。以30%乙醇生理鹽水為灌注液，溫度控制在37 ℃左右，控制灌注液流速為1 μL/min，開泵運(yùn)行1 h 后開始收集滲析液，每次收集30 μL，每個(gè)濃度收集3個(gè)樣品，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算探針體外回收率。

同法將探針浸于30%乙醇生理鹽水中，以上述4組不同濃度的混合對(duì)照品溶液為灌注液，同法操作并進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算探針體外空白耗損率。結(jié)果見圖3。

圖3 藥物濃度對(duì)體外回收率和空白耗損率的影響Figure 3 The effects of drug concentrations on the in vitro R and L of the probe(,n=3)

由試驗(yàn)結(jié)果可知，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的藥物濃度下，黃芩苷、小檗堿的體外回收率基本一致；相同濃度下，黃芩苷、小檗堿各自的探針體外回收率與空白耗損率也大致相等；表明藥物濃度對(duì)探針體外回收率影響不顯著，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步表明反滲析法適用于計(jì)算體內(nèi)回收率。

2.5 微量滲析探針體內(nèi)回收率穩(wěn)定性考察

2.5.1 動(dòng)物處理與探針植入 取25%烏來糖（5 mL/kg）對(duì)SD 大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉后，剃除大鼠腹部皮毛。大鼠仰臥位固定在加熱墊上，標(biāo)記探針植入點(diǎn)。按探針植入操作說明，撕裂管植入大鼠皮下，再將探針插入撕裂管內(nèi)（探針事先進(jìn)行飽和：浸泡于1 000 u/mL 的肝素鈉溶液中，并以含1 000 u/mL肝素鈉的30%乙醇生理鹽水作為灌注液進(jìn)行灌流），隨后把撕裂管撕開使探針膜管留在皮下。最后用組織膠將探針固定在植入點(diǎn)。整個(gè)過程需保持探針膜濕潤，可用30%乙醇生理鹽水進(jìn)行灌流。

2.5.2 探針在體回收率的穩(wěn)定性考察 以30%乙醇生理鹽水為灌注液，以1 μL/min 的流速灌流1 h使平衡后，換成混合對(duì)照品溶液（黃芩苷、鹽酸小檗堿的濃度分別為8.0、3.0 μg/mL），以1 μL/min 流速繼續(xù)灌流探針，平衡1 h 后開始收集樣品，取樣間隔為30 min，按上述方法進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的探針體內(nèi)空白耗損率，結(jié)合回收率與空白耗損率的關(guān)系，考察探針在12 h 內(nèi)體內(nèi)回收率的穩(wěn)定性。結(jié)果見圖4。

圖4 黃芩苷、小檗堿探針體內(nèi)回收率的穩(wěn)定性Figure 4 Stability of recovery rates for baicalin and berberine probes in vivo(,n=3)

結(jié)果表明，黃芩苷、小檗堿的探針體內(nèi)回收率分別為（21.91±1.90）%、（40.08±1.87）%，且12 h 內(nèi)保持穩(wěn)定，表明經(jīng)皮微量滲析取樣試驗(yàn)過程中，各時(shí)間點(diǎn)的探針體內(nèi)回收率基本一致。因此，對(duì)測(cè)試所得的滲析液中的藥效成分濃度，采用回收率進(jìn)行校正，即可得到探針外組織液中大致的藥效成分濃度，表明該方法可用于黃芩苷、小檗堿的經(jīng)皮微量滲析取樣的研究。

2.6 參芩凝膠促滲工藝的初步研究及評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)選用冰片作為透皮促滲劑，考察冰片加入對(duì)參芩凝膠中黃芩苷、小檗堿透皮性能的影響。

2.6.1 參芩凝膠的制備 按前期實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的處方和方法制備參芩凝膠。稱取7%肉豆蔻酸異丙酯、30%聚氧乙烯蓖麻油、30%丙三醇，將三者混勻，加入黃柏提取物、黃芩提取物（黃柏提取物、黃芩提取物均為實(shí)驗(yàn)室自制，各提取物的加入量按原處方生藥量及提取物干浸膏得率折算），攪拌均勻，加入不同劑量的冰片（0%、3%，冰片事先用適量乙醇溶解），攪拌均勻后逐滴加水至100 g，同時(shí)勻速同向攪拌，加入已充分溶脹的卡波姆至凝膠基質(zhì)含量為1%，攪勻，滴加三乙醇胺至pH值達(dá)6.5～7.5，即得。

2.6.2 冰片對(duì)參芩凝膠的促滲作用考察 按“2.5.2”項(xiàng)下方法處理動(dòng)物并植入探針，以1 μL/min 的流速灌流30%乙醇生理鹽水平衡1 h 后，于探針上方大鼠腹部表皮標(biāo)記2 cm×2 cm 的給藥區(qū)域，仔細(xì)涂抹參芩凝膠1 g，開始收集樣品，灌注液為30%乙醇生理鹽水，流速為1 μL/min，采樣間隔為30 min，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并利用“2.5.2”項(xiàng)下所得的黃芩苷與小檗堿的在體耗損率，結(jié)合回收率與耗損率的關(guān)系，考察無冰片凝膠組和3%冰片凝膠組中小檗堿與黃芩苷的透皮釋放情況，繪制冰片加入后參芩凝膠皮下黃芩苷、小檗堿藥-時(shí)變化曲線。結(jié)果見圖5。

圖5 冰片加入后的參芩凝膠皮下黃芩苷、小檗堿藥-時(shí)變化曲線Figure 5 Drug-time curves of baicalin and berberine in Shenqin gel after borneol addition(,n=3)

結(jié)果表明，3%冰片加入后能顯著提升參芩凝膠中黃芩苷的透過量，同時(shí)對(duì)小檗堿的透過量也有一定的提升作用，這對(duì)后續(xù)參芩凝膠促滲工藝、透皮性能的進(jìn)一步研究提供了一定的參考。

3 討論

微量滲析取樣技術(shù)因其創(chuàng)傷小、可連續(xù)動(dòng)態(tài)取樣、采集液可直接進(jìn)樣分析等優(yōu)勢(shì)，已成為經(jīng)皮藥動(dòng)學(xué)研究的主流[11-12]，具有廣闊的應(yīng)用和發(fā)展前景。本實(shí)驗(yàn)首次建立了參芩凝膠中黃芩苷、小檗堿經(jīng)皮微量滲析取樣的方法，經(jīng)過對(duì)灌注速度、藥物濃度的考察，發(fā)現(xiàn)探針體外回收率與灌注速度呈負(fù)相關(guān)，從試驗(yàn)效率和數(shù)據(jù)穩(wěn)定性出發(fā)，確定灌注速度為1 μL/min，取樣間隔為30 min。在此條件下，黃芩苷、小檗堿體外回收率分別為（38.01±0.42）%、（44.74±0.33）%；同時(shí)，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的藥物濃度下，黃芩苷、小檗堿的體外回收率基本一致；相同濃度下，兩成分各自的探針體外回收率與空白耗損率也無顯著差異，證明了反滲析法可用于兩成分在體微量滲析取樣實(shí)驗(yàn)中回收率的測(cè)定，從而確定了黃芩苷、小檗堿皮膚在體微量滲析取樣的方法。

參芩凝膠由苦參、黃芩、黃柏等藥味組成，其中苦參、黃芩為方中君藥，黃柏為方中臣藥，均具有清熱燥濕、解毒之功效。實(shí)驗(yàn)前期對(duì)滲析液中苦參堿、氧化苦參堿的含量測(cè)定方法進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)樣品不經(jīng)過中性氧化鋁柱處理時(shí)色譜峰分離度較差，無法滿足定量分析的需求，且凝膠樣品經(jīng)過透皮吸收，滲析液中苦參堿、氧化苦參堿含量偏低，再經(jīng)過過柱處理，幾乎測(cè)不到滲析液中苦參堿、氧化苦參堿成分，因此，選擇君藥黃芩中黃芩苷和臣藥黃柏中小檗堿作為本研究的含測(cè)指標(biāo)。

由于灌注液的選擇要考慮與組織中細(xì)胞外液的相關(guān)因素盡可能相近，以減少灌注液對(duì)動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[8]。為減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高系統(tǒng)適應(yīng)性，實(shí)驗(yàn)擬采用微滲析介質(zhì)來配制對(duì)照品溶液。因此，在前期實(shí)驗(yàn)中，試用過林格氏液和生理鹽水作為灌注液，但由于黃芩苷幾乎不溶于水，在這兩種灌注液中溶解不充分。經(jīng)查閱文獻(xiàn)后，采用30%乙醇生理鹽水作為灌注液時(shí)，黃芩苷可溶，且未見30%乙醇生理鹽水有不良效果的報(bào)道，因此，本研究采用30%乙醇生理鹽水作為灌注液。在后續(xù)研究中，將繼續(xù)對(duì)灌注液的種類進(jìn)行優(yōu)選，以期篩選出更加優(yōu)良的微滲析介質(zhì)。

冰片是一種常用的化學(xué)促滲劑，能改變皮膚角質(zhì)層結(jié)構(gòu)從而促進(jìn)藥物經(jīng)皮滲透，本身也具有抗菌、消炎、止癢的外用功效。本研究擬在參芩凝膠中加入適量冰片以促進(jìn)方中有效成分透皮吸收，提高療效。為考察冰片在微滲析中對(duì)參芩凝膠的促滲效果，對(duì)加入冰片與未加冰片的樣品開展了比較實(shí)驗(yàn)研究。在前期研究中，通過Franz 擴(kuò)散池法初步考察了冰片對(duì)參芩凝膠的體外透皮促進(jìn)作用，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為3%的冰片具有較好的促進(jìn)透皮效果。因此，本研究采用加入3%冰片與未加冰片的樣品進(jìn)行比較。后續(xù)將繼續(xù)開展不同質(zhì)量濃度冰片促滲效果的研究，優(yōu)選最佳劑量，并考察不同冰片種類（天然冰片、合成冰片）及其他促滲劑對(duì)參芩凝膠的影響。

在參芩凝膠的初步促滲工藝研究中，發(fā)現(xiàn)3%冰片對(duì)黃芩苷的促滲效果比對(duì)小檗堿的促滲效果顯著。分析原因可能是對(duì)于促滲小檗堿來說，冰片的加入量還不夠多，或冰片不是小檗堿的最優(yōu)促滲劑[13-15]。在一些研究中也出現(xiàn)相同的研究結(jié)果，郭淑娟[16]、歐陽麗影[17]的研究中，冰片對(duì)黃芩苷的促滲作用顯著，楊丹[14]的研究顯示3%冰片對(duì)小檗堿有促滲透作用，但與冰片對(duì)黃芩苷的促滲相比，其對(duì)小檗堿的增滲比明顯小很多，促滲作用較弱。但這一研究結(jié)果尚缺乏充分的討論與系統(tǒng)性研究。筆者認(rèn)為冰片的促滲原理是改變表皮角質(zhì)層的微結(jié)構(gòu)[18]，具有廣泛的促滲作用，黃芩苷因其水、醇溶性差的特性[19-20]，本身難以透過表皮角質(zhì)層，當(dāng)加入冰片后可以得到顯著的透皮效果；而小檗堿本身分子量小、脂溶性與水溶性良好，本身就有較好的透過性能，故加入冰片對(duì)小檗堿的表皮角質(zhì)層透過量影響相對(duì)較小。相關(guān)研究有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。