楊建英，朱 虹，徐 寧，陳曉紅，陳 慶，肖 珩

（廣東省汕頭市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測所，廣東 汕頭 515041）

隨著我國經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展和人們生活水平的日益提高，護(hù)膚品已成為必不可少的日用品。護(hù)膚品種類豐富，由于具有祛斑、祛痘、修護(hù)等功效，一直備受消費(fèi)者青睞。臨床上常用的利多卡因、丙氧卡因等麻醉劑，可暫時(shí)使神經(jīng)沖動被可逆性地阻斷，使局部疼痛、瘙癢在人的神志清醒狀態(tài)下短暫消失，因而可能被添加于宣稱具有祛斑、祛痘、修護(hù)、舒緩等功效的護(hù)膚品中，起到使面部肌膚短暫麻痹，痛感暫時(shí)消除的效果。但其能引起局部麻醉藥全身毒性（LAST）［1］和心臟毒性，消費(fèi)者長期使用可能對身體健康造成危害。麻醉類藥品已被《化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015版）》［2］列入化妝品禁用原料目錄中。然而，隨著醫(yī)學(xué)水平的不斷發(fā)展，麻醉類藥物種類遠(yuǎn)不止7種，常用的還有美索卡因、丙氧卡因、丙胺卡因等多種麻醉類藥物。為進(jìn)一步加強(qiáng)護(hù)膚品的安全監(jiān)管，保障消費(fèi)者安全，應(yīng)擴(kuò)大麻醉類藥物的檢測范圍。近年來關(guān)于麻醉劑的檢測方法主要有毛細(xì)管電泳法［3－4］、氣相色譜法［5］、氣相色譜－質(zhì)譜法［6］、離子色譜法［7］、液相色譜法［8－12］、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［13－18］等，主要涉及農(nóng)產(chǎn)品、化妝品、藥物、血漿、唾液、外用成人用品、醫(yī)療美容產(chǎn)品等。其中液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法具有選擇性好、靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)，目前已成為高通量分析最主要的檢測手段。已報(bào)道的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測定多種麻醉劑的研究大多采用含C18填料的色譜柱以反相模式分離化合物，往往會出現(xiàn)色譜保留與質(zhì)譜響應(yīng)難以兼顧的情形。

與以往報(bào)道的方法不同，本文以QuEChERS為前處理手段，創(chuàng)新性地采用Acclaim Mixed－Mode WCX－1混合模式色譜柱配合高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC－MS/MS）對護(hù)膚品中的21種麻醉劑進(jìn)行測定，既增強(qiáng)了目標(biāo)組分的保留，又提升了正模式下的響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了分離度與靈敏度的兼顧，為液質(zhì)聯(lián)用分析麻醉劑這類堿性化合物提供了一種新思路。本方法的建立可為護(hù)膚品中違禁使用的麻醉類藥物分析提供技術(shù)支持，提高護(hù)膚品安全風(fēng)險(xiǎn)的監(jiān)控水平。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

QTRAP 5500液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國AB SCIEX公司）；ME 204電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；pH計(jì)（PHS－3C型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；Multi Reax旋渦振蕩器（德國Heidolph公司）；SB25－12DT超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；3－18KS高速離心機(jī)（德國Sigma公司）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：普魯卡因胺、普魯卡因、苯佐卡因、利多卡因、丁卡因、三卡因、甲哌卡因（純度 ≥98%，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；布比卡因、羅哌卡因、鹽酸辛可卡因、丙胺卡因（純度 ≥ 83%，曼哈格（上海）生物科技有限公司）；鹽酸普莫卡因、布他卡因、利索卡因、鹽酸氯普魯卡因（純度 ≥ 98%，天津阿爾塔科技有限公司）；可卡因（1 mg·mL?1，美國Cerilliant公司）；美索卡因、丁氧卡因、丙美卡因（純度 ≥ 98%，加拿大ECO公司）；阿米卡因（純度99.8%，廣州佳途科技股份有限公司）；鹽酸丙氧卡因（純度97.0%，加拿大TRC公司）。

試劑與材料：甲醇、乙腈（HPLC級，瑞典Oceanpak公司）；甲酸（HPLC級，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；甲酸銨、乙酸銨（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；QuEChERS鹽析試劑包（含1.5 g乙酸鈉和6.0 g無水硫酸鎂）、QuEChERS凈化試劑包（含400 mg十八烷基鍵合硅膠（C18）、400 mg N-丙基乙二胺（PSA）、1 000 mg無水硫酸鎂）（美國Agilent公司）；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由arium mini plus超純水器（德國Sartorius公司）制備；針式過濾器（0.2 μm，PTFE（親水性），賽默飛世爾科技（中國）有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1樣品預(yù)處理準(zhǔn)確稱取均勻試樣0.5 g（精確至0.001 g）于50 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL水，充分渦旋分散后，準(zhǔn)確加入10 mL乙腈（含1.0%甲酸，體積分?jǐn)?shù)，下同），渦旋提取1 min，超聲提取20 min后，加入鹽析試劑包（含1.5 g乙酸鈉和6.0 g無水硫酸鎂），振搖1 min，以5 000 r·min?1離心5 min。移取5 mL上清液于15 mL聚丙烯離心管中，加入凈化試劑包（含400 mg C18、400 mg PSA、1 000 mg無水硫酸鎂），渦旋混勻1 min，以5 000 r·min?1離心5 min，吸取上清液過0.2 μm PTFE濾膜，待分析。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制取適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解稀釋，分別制備成100 μg·mL?1的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。取適量單標(biāo)儲備液，用甲醇逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為1 000 ng·mL?1和100 ng·mL?1的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。稱取與該待測樣品基質(zhì)類型相同的空白樣品0.5 g（精確至0.001 g）6份，分別加入適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，按“1.2.1”步驟處理，配制成質(zhì)量濃度為0.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100 ng·mL?1的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 儀器工作條件

1.3.1色譜條件色譜柱：Acclaim Mixed－Mode WCX－1色譜柱（150 mm × 2.1 mm × 3 μm，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL；流動相：A相為20 mmol·L?1甲酸銨溶液（用甲酸調(diào)至pH 4.0），B相為乙腈（含0.035%甲酸），流速為0.3 mL/min。梯度洗脫條件：0 ~ 1.0 min，10% B；1.0 ~ 6.0 min，10% ~ 60% B；6.0 ~ 8.0 min，60% B；8.0 ~ 9.0 min，60% ~ 90% B；9.0 ~ 11.0 min，90% B；11.0 ~ 12.0 min，90% ~ 10% B；12.0 ~ 15.0 min，10% B。

1.3.2質(zhì)譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正模式；采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），離子源噴霧電壓（IS）：5 500 V；離子源加熱溫度：600 ℃；氣簾氣（CUR）壓力：0.207 MPa；霧化氣（GAS1）壓力：0.414 MPa；加熱輔助氣（GAS2）壓力：0.379 MPa；其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 21種麻醉劑的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of the 21 anesthetics

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1色譜柱的選擇本研究中的21種麻醉劑多為中性或堿性物質(zhì)，目前已報(bào)道的液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜方法［13－18］較多采用C18色譜柱以反相模式分離化合物。文獻(xiàn)［13，15，17］通過在流動相中添加0.1%甲酸，在正模式下增強(qiáng)了電離效果，但會在一定程度上導(dǎo)致麻醉劑的色譜保留減弱，部分化合物（如普魯卡因胺、普魯卡因）在1 min內(nèi)出峰，而目標(biāo)化合物出峰過早易受到樣品基質(zhì)的干擾；文獻(xiàn)［14］在流動相中添加氨水提高流動相pH值以增強(qiáng)麻醉劑的色譜保留，但會抑制正模式的響應(yīng)，為達(dá)到合適的方法檢出限，需使用離子淌度差分質(zhì)譜提高方法的靈敏度。因此，液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜方法在分析堿性化合物時(shí)，會出現(xiàn)色譜保留與質(zhì)譜響應(yīng)難以兼顧的情形。此外，流動相pH值較低或較高，易對液相色譜系統(tǒng)管路造成腐蝕、磨損，對液相色譜管路耐受性的要求也會更高。

本研究采用的Acclaim Mixed－Mode WCX－1色譜柱能夠在單一鍵合相上提供多種保留機(jī)制，選擇性與C18反相色譜柱互補(bǔ)。該色譜柱的鍵合相為帶有羧基末端的疏水烷基鏈鍵合硅膠，疏水烴鏈提供反相保留（RP），羧基端基提供弱陽離子交換（WCX），適用于含伯仲叔胺及季銨結(jié)構(gòu)、有機(jī)胺類、含氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)等堿性化合物的分析［19－20］。普魯卡因胺的結(jié)構(gòu)式中含苯環(huán)、伯胺、仲胺和叔胺等官能團(tuán)，酸度系數(shù)pKa為9.24，該堿性化合物在傳統(tǒng)反相色譜柱上的保留較弱，出峰時(shí)間接近死時(shí)間［13，15，17］。本方法使用Acclaim Mixed－Mode WCX－1色譜柱分析此類堿性化合物時(shí)，選擇較為“溫和”的流動相條件（pH值為3.0 ~ 6.5），該色譜柱的羧基端基與含氮官能團(tuán)進(jìn)行離子交換，疏水烴鏈與苯環(huán)進(jìn)行反相保留，使得普魯卡因胺的保留顯著增強(qiáng)，岀峰時(shí)間在4 min左右（見圖1A），可有效避免樣品基質(zhì)干擾，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定性和定量。此外，嘗試采用Waters Symmetry C18色譜柱（150 mm × 2.1 mm，3.5 μm）在相同色譜－質(zhì)譜條件下進(jìn)行測試，色譜圖如圖1B所示。結(jié)果表明，Acclaim Mixed－Mode WCX－1色譜柱對21種麻醉劑的分離保留效果更好。因此，實(shí)驗(yàn)采用Acclaim Mixed－Mode WCX－1混合模式色譜柱配合HPLC－MS/MS測定護(hù)膚品中21種麻醉劑的含量，在確?；衔镯憫?yīng)的前提下，使目標(biāo)組分的保留增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)了分離度與靈敏度的兼顧。

圖1 2種不同色譜柱對21種麻醉劑的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 21 anesthetics by 2 different chromatographic columns

2.1.2流動相的選擇采用選定的色譜柱，在混合模式分離機(jī)制下以緩沖鹽和有機(jī)相為流動相體系?？紤]到該色譜柱適用的緩沖鹽濃度范圍，以及盡可能使用較低濃度的緩沖鹽添加劑以降低對質(zhì)譜系統(tǒng)的污染，選擇緩沖鹽濃度為20 mmol·L?1。實(shí)驗(yàn)首先考察了目標(biāo)化合物在20 mmol·L?1甲酸銨溶液－乙腈和20 mmol·L?1乙酸銨溶液－乙腈兩種流動相體系下的質(zhì)譜響應(yīng)。結(jié)果表明，在20 mmol·L?1甲酸銨溶液－乙腈流動相體系下，大多數(shù)麻醉劑的質(zhì)譜響應(yīng)更高。質(zhì)譜正模式下，為增強(qiáng)目標(biāo)化合物的響應(yīng)值，在20 mmol·L?1甲酸銨溶液中添加甲酸。進(jìn)一步考察了相同洗脫梯度下，20 mmol·L?1甲酸銨溶液的pH值分別為4.0、5.0和6.0時(shí)，各目標(biāo)化合物的質(zhì)譜響應(yīng)和同分異構(gòu)體的分離情況。實(shí)驗(yàn)表明，上述3種pH值條件下苯佐卡因和三卡因、丙美卡因和丙氧卡因這2對同分異構(gòu)體均獲得良好的分離，當(dāng)20 mmol·L?1甲酸銨溶液的pH值為4.0時(shí)，大多數(shù)麻醉劑的質(zhì)譜響應(yīng)更高，因此采用流動相的pH值為4.0。實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有機(jī)相不加甲酸時(shí)，普魯卡因胺的峰形拖尾，在有機(jī)相乙腈中加入體積分?jǐn)?shù)為0.035%的甲酸時(shí)，普魯卡因胺的峰形顯著改善。因此，最終采用20 mmol·L?1甲酸銨溶液（用甲酸調(diào)至pH 4.0）－乙腈（含0.035%甲酸）作為流動相，并進(jìn)一步優(yōu)化梯度洗脫程序。21種麻醉劑（100 ng·mL?1）的MRM色譜圖見圖1A。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

21種麻醉劑的化學(xué)性質(zhì)使之在正離子掃描模式下更易離子化。在ESI+模式下，分別對質(zhì)量濃度為50 ng·mL?1的21種麻醉劑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子掃描，均可獲得響應(yīng)最好的準(zhǔn)分子離子峰，且均為［M +H］+峰。對母離子進(jìn)行子離子掃描，選擇響應(yīng)較強(qiáng)、干擾較小的2個(gè)子離子作為定性離子，其中響應(yīng)最大的子離子作為定量離子，最后分別對每種麻醉劑的去簇電壓和碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表1。

2.3 提取條件的優(yōu)化

QuEChERS法的常用提取溶劑為乙腈，實(shí)驗(yàn)采用乙腈作為提取溶劑進(jìn)行考察。若在樣品中直接加入乙腈，膏霜類等樣品的復(fù)雜基質(zhì)不易分散，所以先加入水使樣品充分分散混勻后再加入乙腈進(jìn)行提取。在空白樣品中加入21種麻醉劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.2.1”步驟，考察了乙腈、乙腈（含0.1%甲酸）、乙腈（含0.5%甲酸）和乙腈（含1.0%甲酸）作為提取溶劑時(shí)21種麻醉劑的提取回收率，結(jié)果見圖2。由圖2可知，大約50%組分的提取回收率受甲酸體積分?jǐn)?shù)的影響不大，但有50%的麻醉劑在乙腈（含1.0%甲酸）作為提取溶劑時(shí)的提取回收率明顯高于其他3種提取溶劑，故實(shí)驗(yàn)選取乙腈（含1.0%甲酸）作為提取溶劑。

圖2 提取溶劑對樣品中21種麻醉劑提取回收率的影響Fig.2 Effect of variety of extraction solvent on the recoveries of 21 anesthetics in samples

2.4 凈化條件的選擇

護(hù)膚品基質(zhì)主要有脂類（角鯊?fù)?、合成甘油三酯等）、蠟類（蜂蠟、石蠟等）和有機(jī)酸等。QuEChERS方法常用的吸附劑中，C18可吸附脂類、蠟類等非極性雜質(zhì)，PSA可吸附有機(jī)酸、色素及金屬離子等，無水硫酸鎂可吸收有機(jī)相中殘留的水分，所以實(shí)驗(yàn)選取含C18、PSA以及無水硫酸鎂的QuEChERS凈化試劑包作為凈化吸附劑。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)評價(jià)

護(hù)膚品的基質(zhì)較為復(fù)雜，因此對21種麻醉劑的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了考察。基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME）按照公式ME=（基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率）× 100%計(jì)算。ME越接近100%，表明基質(zhì)效應(yīng)越小。ME在80% ~ 120%范圍內(nèi)，表明存在基質(zhì)效應(yīng)，但影響較低，可忽略不計(jì)；超出此范圍則表明基質(zhì)效應(yīng)較明顯。選擇膏霜、乳液和凝膠3種具有代表性的復(fù)雜基質(zhì)，通過實(shí)驗(yàn)分別獲得21種麻醉劑的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算ME值。由表2可知，21種麻醉劑在3種基質(zhì)中存在不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，且以基質(zhì)抑制為主。因此，通過基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，以更準(zhǔn)確地反映護(hù)膚品中21種麻醉劑的含量。

表2 21種麻醉劑在不同基質(zhì)中的回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n = 6）和基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Recoveries，relative standard deviations（n = 6） and matrix effects of 21 anesthetics in different matrices

（續(xù)表2）

2.6 線性方程、檢出限與定量下限

在“1.3”條件下，對21種麻醉劑的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，以化合物定量離子的色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y），以各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，ng·mL?1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。以空白樣品的3倍信噪比確定檢出限（LOD，S/N= 3），10倍信噪比確定定量下限（LOQ，S/N= 10）。由表3可知，21種麻醉劑在0.5 ~ 100 ng·mL?1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.99，方法檢出限為0.1 ~ 3 μg·kg?1，定量下限為0.3 ~ 10 μg·kg?1。

表3 21種麻醉劑的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量下限Table 3 Linear ranges，linear equations，correlation coefficients，LODs and LOQs of 21 anesthetics

2.7 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

分別選取具有代表性的膏霜、乳液和凝膠3種護(hù)膚品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。稱取經(jīng)檢測不含21種麻醉劑的樣品，分別添加低、中、高3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于樣品中，分別做6次平行實(shí)驗(yàn)。由表2可知，在3個(gè)加標(biāo)水平下，21種麻醉劑的平均回收率為84.3% ~ 109%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.70% ~7.1%，表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

2.8 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本方法對市面45批次護(hù)膚品進(jìn)行測定，其中1批次樣品檢出利多卡因（含量為107 mg·kg?1），1批次樣品檢出丙胺卡因（含量為83.8 mg·kg?1），均為宣稱具有舒緩功效的眼部護(hù)膚品。典型陽性樣品（檢出利多卡因）的色譜圖見圖3。其余樣品均未檢出本方法涉及的21種麻醉劑。

圖3 陽性樣品的MRM總離子流圖（A）和利多卡因的提取離子流圖（B、C）Fig.3 MRM total ion chromatogram（A） and extracted ion chromatograms of lidocaine（B，C） in a positive sample

3 結(jié) 論

本文建立了QuEChERS/高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)快速測定護(hù)膚品中21種麻醉劑的分析方法。該方法前處理簡單，創(chuàng)新性地采用Acclaim Mixed－Mode WCX－1混合模式色譜柱對護(hù)膚品中的21種麻醉劑進(jìn)行含量測定，實(shí)現(xiàn)了分離度與靈敏度的兼顧，可在15 min內(nèi)對21種麻醉劑進(jìn)行快速篩查，檢出限低，定性定量準(zhǔn)確，可為護(hù)膚品的安全監(jiān)管提供有力的技術(shù)支持。