李 靜，晏 萌，沈金燦，肖陳貴，麥艷玲，李 楊，郭建寧，鐘潤生*

（1.深圳信息職業(yè)技術(shù)學(xué)院 交通與環(huán)境學(xué)院，廣東 深圳 518172；2.香港城市大學(xué) 海洋污染國家重點實驗室，香港 999077；3.深圳海關(guān)食品檢驗檢疫技術(shù)中心 深圳市食品安全檢測技術(shù)研發(fā)重點實驗室，廣東 深圳 518026）

有害藻華是威脅、危害海洋生態(tài)環(huán)境和人類健康的一種海洋災(zāi)害。近幾十年來，由于不斷加劇的人為壓力以及逐漸惡劣的全球氣候變化，有害藻華發(fā)生的頻率及影響范圍不斷增大［1－2］。其相關(guān)的產(chǎn)毒微藻所產(chǎn)生的海洋藻毒素是目前已知的最毒的一類天然產(chǎn)物之一，易累積于各種海洋生物體內(nèi)［2－3］，人類攝食藻毒素含量超標的海產(chǎn)品可引起各種食源性疾?。?－8］。目前，已在海洋環(huán)境及生物體中發(fā)現(xiàn)超過300種藻毒素［9－11］。典型的高毒性海洋藻毒素包括原多甲藻酸貝類毒素（AZAs）、裸藻毒素（BTXs）、太平洋雪卡毒素（P－CTXs）、鰭藻毒素（DTXs）、米氏裸甲藻貝類毒素（GYM）、刺尾魚素（MTX3）、大田軟骨酸貝毒素（OA）、扇貝毒素（PTX2）、螺環(huán)內(nèi)酯毒素（SPX1）及蝦夷扇貝毒素（YTXs）。海洋生物中藻毒素的水平主要受其棲息地環(huán)境污染狀況和飲食偏好的影響［12－13］，海水、懸浮顆粒物及沉積物是其棲息地環(huán)境的重要組成部分。因此，開發(fā)多種藻毒素的高精密度痕量檢測技術(shù)有助于闡釋其在海洋環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化及歸宿，為更有效地管理漁業(yè)資源及保障人類健康提供技術(shù)支持。

超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS/MS）具有選擇性好、靈敏度高、可比性和重復(fù)性好的優(yōu)點，可同時定量分析多種藻毒素［14－16］，是目前進行目標及非目標藻毒素篩查最常用的方法之一。例如，王艷龍等［17］建立了測定海水懸浮顆粒物中8種典型脂溶性藻毒素的UPLC－MS/MS法；高莉媛等［18］建立了測定海洋微藻藻粉中8種脂溶性藻毒素的高效液相色譜－電噴霧離子阱質(zhì)譜法；García－Altares等［19］建立了測定海產(chǎn)品中17種脂溶性藻毒素的UPLC－MS/MS法；Chen等［10］采用固相萃取法結(jié)合液相色譜－飛行時間質(zhì)譜（LC－TOF MS）檢測海水中的8種脂溶性藻毒素，回收率為30.2% ~ 83.3%。然而，由于藻毒素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)差異，上述方法均在電噴霧模式下采用正、負離子分開掃描檢測，增加了檢測成本及時間；UPLC－MS/MS在分析樣品時不可避免地受到基質(zhì)效應(yīng)的影響，且前處理方法的萃取效率低，導(dǎo)致檢測值偏高或偏低。因此亟需開發(fā)有效可靠的多種高毒性藻毒素的前處理方法，以降低基質(zhì)效應(yīng)，延長儀器及色譜柱的使用壽命，并結(jié)合高效、靈敏以及可正、負離子同時掃描的UPLC－MS/MS儀器以提高樣品分析的準確性及效率，為良好明晰環(huán)境中藻毒素的污染狀況和賦存狀態(tài)，以及海洋生態(tài)系統(tǒng)的提前預(yù)警奠定基礎(chǔ)。

本研究建立了一種固相萃取結(jié)合UPLC－MS/MS同時測定18種藻毒素的分析方法，對色譜－質(zhì)譜條件及固相萃取和氮吹濃縮條件進行優(yōu)化，達到了有效降低樣品基質(zhì)效應(yīng)，并提高方法靈敏度的目的。該方法適用于同時快速檢測實際海水、懸浮顆粒物及沉積物中的18種藻毒素。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290型超高效液相色譜儀（美國Agilent公司），API 5500型三重四極桿質(zhì)譜儀配電噴霧離子源（美國AB SCIEX公司）；Phenomenex Kinetex C18色譜柱（100 mm × 2.1 mm i.d.，1.7 μm，美國Phenomenex公司）；平行振蕩器；20位固相萃取裝置（美國Waters公司）；旋渦振蕩混合器（美國Thermo公司）；Sigma冷凍離心機（最大轉(zhuǎn)速14 000 r/min，美國Sigma公司）；TurboVap LU型氮吹濃縮儀（Caliper Life Sciences公司）；Eppendorf移液器（德國Eppendorf公司）；Agilent Bond Elut C18固相萃取柱（500 mg/6 mL）；Waters Oasis HLB固相萃取柱（500 mg/6 mL）；Phenomenex StrataX固相萃取柱（500 mg/6 mL）。

雪卡毒素標準品（P－CTX－1、P－CTX－2及P－CTX－3，純度> 95%）由澳大利亞昆士蘭大學(xué)Richard J. Lewis教授提供；刺尾魚素（MTX3）標準品由新西蘭考斯隆研究所提供；大田軟骨酸毒素（OA）、鰭藻毒素（DTX1和DTX2）、扇貝毒素（PTX2）、米氏裸甲藻貝類毒素（GYM）、螺環(huán)內(nèi)酯毒素（SPX1）、原多甲藻酸貝類毒素（AZA1、AZA2及AZA3）、蝦夷扇貝毒素（YTX和homoYTX）標準品購自加拿大國家海洋研究中心；裸藻毒素（BTX2、BTX3及BTX9）標準品購自美國LKT實驗室。甲醇和乙腈為HPLC純（德國Merck公司）；甲酸、氯化鈉、甲酸銨為HPLC純，氨水及丙三醇為分析純（美國Sigma公司）；實驗用水由Milli－Q超純水處理系統(tǒng)（美國Millipore公司）制備。

1.2 標準溶液的配制

準確取18種海洋藻毒素標準物質(zhì)適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的單標儲備液。按照一定的比例分別吸取各藻毒素單標儲備液，用80%甲醇水配制成100 ng/mL的標準工作液，并按需逐級稀釋，各標準溶液置于?20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 色譜－質(zhì)譜條件

色譜條件：Phenomenex Kinetex C18色譜柱（100 mm × 2.1 mm i.d.，1.7 μm）；流動相：A相為水，B相為95%乙腈水，兩相均含有0.1%甲酸和2 mmol/L甲酸銨。流速為200 μL/min，柱溫為35 ℃，進樣體積為5 μL。線性梯度洗脫，洗脫程序：0 ~ 1 min，20% B；1 ~ 6 min，20% ~ 80% B；6 ~ 8 min，80% B；8 ~ 10 min，80% ~ 100% B；10 ~ 14 min，100% B；14 ~ 14.1 min，100% ~ 20% B；14.1 ~ 19 min，20% B。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源；P－CTX－1、P－CTX－2、P－CTX－3、PTX2、GYM、SPX1、AZA1、AZA2、AZA3、BTX2、BTX3及BTX9采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）正離子模式（ESI+）檢測，OA、DTX1、DTX2、MTX3、YTX、homoYTX采用MRM負離子模式（ESI?）檢測；噴霧電壓分別為5 500 V和?4 500 V，霧化氣壓力為207 kPa（GS1，30 psi），去溶劑氣壓力為276 kPa（GS2，40 psi），碰撞氣壓力為69 kPa（CAD，10 psi），離子源溫度為400 ℃。18種藻毒素的分子式、保留時間（tR）、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）、碰撞室出口電壓（CXP）、入口電壓（EP）值見表1。

表1 18種藻毒素的分子式、保留時間及質(zhì)譜參數(shù)Table 1 The formulas，retention times and mass spectrometric parameters of 18 phycotoxins

（續(xù)表1）

1.4 樣品前處理

海水樣品用烘干至恒重的玻璃纖維濾膜（直徑為47 mm，孔徑為0.45 μm）進行過濾，收集固體懸浮顆粒物；將濾膜置于凍干機中凍干，通過十萬分之一的電子天平稱量和計算，得到懸浮顆粒物的質(zhì)量。

已過濾海水（1 L）通過預(yù)先用10 mL甲醇和10 mL水活化的Agilent Bond Elut C18（500 mg/6 mL）固相萃取柱進行萃取，棄去流出液，用5 mL超純水淋洗后抽干，再用5 mL甲醇及5 mL含0.3%氨水的甲醇依次洗脫。洗脫液中加入100 μL的10%丙三醇－甲醇溶液，隨后于40 ℃下氮吹濃縮至0.5 mL，過0.22 μm有機膜，待檢測。

凍干的懸浮顆粒物或沉積物樣品（1 g）用3 mL 80%甲醇水超聲提取3次，合并萃取液（約9 mL），加入超純水將其稀釋至25%甲醇水溶液中（約30 mL），后續(xù)固相萃取及氮吹濃縮處理步驟依照海水處理流程。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜－質(zhì)譜條件的優(yōu)化

為獲得滿意的色譜分離效果和質(zhì)譜靈敏度，對UPLC－MS/MS條件進行了優(yōu)化。API 5500型三重四極桿質(zhì)譜儀可同時運行正負電噴霧電離模式，實現(xiàn)18種藻毒素的同時檢測，大大節(jié)省了分析成本。采用針泵式進樣，對18種藻毒素的質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，并選擇出最優(yōu)的母離子及子離子，具體參數(shù)如表1所示。

在最佳質(zhì)譜條件下，對色譜流動相、柱溫、進樣體積等條件進行優(yōu)化。乙腈和水是分析藻毒素最常規(guī)的流動相體系，當UPLC分離酸堿性物質(zhì)時，色譜柱填料中的游離硅羥基與解離后目標物產(chǎn)生的二級作用導(dǎo)致色譜峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，在流動相中加入增強離子化的pH調(diào)節(jié)劑（甲酸/乙酸或氨水/三乙胺）和減少次級保留的緩沖鹽（甲酸銨或乙酸銨），可減弱拖尾、改善峰形。例如，Yogi等［20］采用甲醇/水 + 0.1%甲酸 + 5 mmol/L甲酸銨酸性流動相分析了珊瑚魚和岡比甲藻中的16種雪卡毒素；García－Altares等［19］比較了4種典型流動相體系即酸性（pH 2.6）、中性（pH 6.8）、弱堿性（pH 7.9）及堿性（pH 11）對海產(chǎn)品中17種脂溶性藻毒素分離效果的影響?；诖?，本研究比較了乙腈/水和甲醇/水2種流動相體系在酸性、中性、弱堿性及堿性條件下18種藻毒素的色譜出峰情況。相比于酸性及堿性流動相，在中性和弱堿性色譜條件下18種目標物的分離效果及靈敏度無顯著改善；雖然甲醇/水流動相體系下目標物的信號強度高于乙腈/水體系，但使用乙腈/水時兩對同分異構(gòu)體（P－CTX－2、P－CTX－3；OA、DTX2）可獲得更佳的分離度；此外，部分目標物質(zhì)（如CTXs、OA及DTXs）在堿性條件下的信號顯著高于酸性條件，但AZAs呈現(xiàn)峰偏移且色譜峰過寬現(xiàn)象，且堿性條件會溶解色譜柱的硅膠填料，大大縮短色譜柱使用壽命，流動相更易變質(zhì)及污染。因此，選擇95%乙腈水/水（兩相中加入0.1%甲酸和2 mmol/L甲酸銨）為流動相，18種藻毒素在6 min內(nèi)分離良好，目標物的總離子流圖如圖1。

圖1 酸性條件下18種藻毒素的總離子流圖Fig.1 Chromatogram of 18 phycotoxins under acidic chromatographic conditions

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 固相萃取柱的選擇采用合適的前處理方法可減少或降低基質(zhì)效應(yīng)并延長儀器和色譜柱的使用壽命，同時提高方法的定量下限。固相萃取是最常用的前處理方法之一，廣泛應(yīng)用于不同種類的樣品如海水、懸浮顆粒物、沉積物、浮游植物、藻類和生物群樣品［10，21－23］。其中，反相固相萃取柱在藻毒素樣品制備中應(yīng)用最廣泛，因此考察了硅膠鍵合基體Agilent Bond Elut C18（500 mg/6 mL）以及聚合物基體Waters Oasis HLB（500 mg/6 mL）和Phenomenex StrataX（500 mg/6 mL）3種典型反相固相萃取柱對18種目標毒素的萃取效率［10，14，24－25］。

結(jié)果表明（圖2），18種藻毒素在3種固相萃取柱上的回收率分別為84.0% ~ 116%、82.0% ~ 117%及74.0% ~ 123%。前2種固相萃取柱對18種藻毒素的萃取效率優(yōu)于Phenomenex StrataX柱，且Phenomenex StrataX固相萃取柱耗時長。Agilent Bond Elut C18和Waters Oasis HLB固相萃取柱對18種藻毒素的萃取效率相當，然而對于結(jié)構(gòu)高度氧化的梯狀環(huán)聚醚類目標物P－CTXs和BTXs，Agilent Bond Elut C18的萃取效率（95.0% ~ 113%）整體高于Waters Oasis HLB柱（84.0% ~ 106%），可能是由于聚合物基體（二乙烯苯－含氮乙烯基團）對梯狀環(huán)聚醚類物質(zhì)的吸附作用強于硅膠基體（十八烷基），導(dǎo)致目標物難洗脫。綜合考慮，最終選擇Agilent Bond Elut C18固相萃取柱進行萃取。

圖2 不同固相萃取柱對18種藻毒素回收率的影響（n = 3）Fig.2 Effects of different cartridges on the recoveries of 18 phycotoxins（n = 3）

2.2.2 氮吹濃縮對目標物回收率的影響為提高方法的靈敏度，通常采用氮氣吹掃法濃縮樣品。氮吹法的效果主要取決于溫度、氮氣流量、化合物性質(zhì)和樣品狀態(tài)。為剔除基質(zhì)效應(yīng)的影響，找到目標物損失環(huán)節(jié)，首先在無基質(zhì)情況下通過在前處理不同步驟添加目標藻毒素進行了加標實驗，結(jié)果表明目標物BTXs、GYM及SPX1的回收率較低（BTXs為40% ~ 50%，GYM約為50%，SPX1約為45%），是由氮吹引起。

相關(guān)文獻表明，不涉及氮吹的方法呈現(xiàn)出較好的回收率［26－27］，然而在氮吹濃縮時，相關(guān)研究呈現(xiàn)出隨機的回收率較低情況［10，14－15］。為防止在氮吹過程中目標物的隨機損失，選取丙三醇添加至洗脫液中以降低分析物的損失。丙三醇被廣泛用作食品化學(xué)中的甜味劑和藥物配方中的保濕劑，由于存在3個羥基，可與水混溶并具有吸濕性，已被應(yīng)用于氮吹下減少黃曲霉素的損失［28］。在氮氣吹掃下考察了添加不同體積的10%丙三醇－甲醇對18種藻毒素回收率的影響。如圖3所示，在吹氮步驟中，洗脫液中添加10%丙三醇－甲醇對GYM、SPX1和BTXs的回收率有顯著改善（p< 0.05），其回收率隨著10%丙三醇－甲醇體積的增加而增加，而后達到穩(wěn)定狀態(tài)。GYM、SPX1和BTXs的平均回收率分別從52.0%提高至115%、45.0%提高至102%、40.0% ~ 50.0%提高至81.0% ~ 90.0%，其余化合物在不添加或添加10%丙三醇－甲醇的情況下均保持較穩(wěn)定的回收率（96.0% ~ 112%）。GYM和SPX1的回收率提高可能是由于它們的螺亞胺結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，丙三醇混合物可以增強酶促糖化和氨的回收［29］。因此，選擇在洗脫液中添加100 μL的10%丙三醇－甲醇進行后續(xù)優(yōu)化，此時各藻毒素的回收率達到穩(wěn)定。

圖3 10%丙三醇－甲醇溶液加入量對18種藻毒素回收率的影響（n = 3）Fig.3 Effects of volume of 10% glycerol－methanol on the recoveries of 18 phycotoxins（n = 3）

2.3 分析方法評價

2.3.1 基質(zhì)效應(yīng)由于樣品中存在各種干擾物質(zhì)（如色素、脂質(zhì)等），在進行UPLC－MS/MS分析時會引起基質(zhì)效應(yīng)。有效的前處理方法可降低基質(zhì)效應(yīng)，從而避免樣品中目標化合物的檢出結(jié)果偏低或偏高。采用經(jīng)“1.4”方法處理后的空白海水、懸浮顆粒物及沉積物樣品提取液，配制18種藻毒素的混合標準溶液，以80%甲醇水配制相同濃度的標準溶液，分別采用本方法進行測定并繪制標準曲線，按照下式計算基質(zhì)效應(yīng)（ME）：ME =kmatrix/kstandard。式中，kmatrix為空白提取液配制藻毒素混合標準溶液中單個目標物的曲線斜率；kstandard為以80%甲醇水配制相同濃度的標準溶液中對應(yīng)單個目標物的曲線斜率。結(jié)果表明，海水、懸浮顆粒物及沉積物對18種藻毒素有不同程度的基質(zhì)抑制（ME < 1）和增強（ME > 1）作用，并在可接受范圍內(nèi)（0.80 ~ 1.20），其在海水、懸浮顆粒物及沉積物中的ME分別為0.81 ~ 1.23、0.80 ~ 1.16及0.88 ~ 1.16（表2）。

表2 18種藻毒素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量下限以及基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Linear ranges，correlation coefficients（r2），LODs，LOQs and matrix effects for 18 phycotoxins

（續(xù)表2）

2.3.2 線性范圍、檢出限與定量下限以80%甲醇水配制質(zhì)量濃度分別為0.0、0.01、0.05、0.10、0.50、1.0、2.0、5.0、10、20、50 ng/mL的標準樣品溶液，采用本方法進行測定，外標法定量，并以18種藻毒素的定量離子峰面積對其質(zhì)量濃度進行線性回歸；分別根據(jù)3倍和10倍信噪比確定方法檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）。表2結(jié)果表明，18種藻毒素的相關(guān)系數(shù)（r2）為0.991 1 ~ 0.999 9，檢出限為0.015 ~ 75 pg/L（或pg/g），定量下限為0.05 ~ 250 pg/L（或pg/g）。

2.3.3 回收率與相對標準偏差采用三水平六平行的加標回收實驗考察方法的準確性和可靠性。在空白海水、懸浮顆粒物及沉積物樣品中分別添加18種藻毒素混合標準溶液，加標水平為0.20、1.0、5.0 ng/L（或ng/g），采用本方法進行測定。結(jié)果顯示，18種藻毒素的回收率為77.4% ~ 119%，相對標準偏差（RSD）為1.1% ~ 15%（表3）。表明本方法的準確度和精密度良好，能滿足實際海水、懸浮顆粒物及沉積物樣品中18種藻毒素的測定要求。

表3 海水、懸浮顆粒物及沉積物中18種藻毒素的平均加標回收率及相對標準偏差Table 3 Mean spiked recoveries and RSDs of 18 phycotoxins in seawater，suspended particulate matter and sediment

2.4 實際樣品檢測

采用建立的方法對深圳珠江口海域28個站點的海水、懸浮顆粒物及沉積物樣品進行18種目標藻毒素的分析。樣品中共檢出10種藻毒素，包括AZA1、AZA2、AZA3、DTX1、DTX2、GYM、homoYTX、MTX3、OA及PTX2（表4）。海水樣品中最主要的檢出毒素為PTX2（平均值為4 220 pg/L），而懸浮顆粒物及沉積物樣品中最主要的檢出毒素為homoYTX（平均值分別為27.7 ng/g （dw）和77.6 pg/g （dw）），并在中國海水及沉積物中首次檢出MTX3。珠江口海域中藻毒素的污染情況與大亞灣海域相似，且PTX2的濃度水平相當（1 190 ~ 5 970 pg/L）［16］，但珠江口懸浮顆粒物中PTX2的最高含量（199 ng/g （dw））高于青島海域懸浮顆粒物中PTX2的水平（最大值：790 pg/g （dw）；僅PTX2被檢出）［17］。

表4 海水、懸浮顆粒物及沉積物樣品中藻毒素的檢測結(jié)果Table 4 Detection results of phycotoxins in seawater，suspended particulate matter and sediment samples

（續(xù)表4）

3 結(jié) 論

本研究建立了同時測定海水、懸浮顆粒物及沉積物中18種典型藻毒素的UPLC－MS/MS方法。本方法簡單快捷，靈敏度和精密度高，回收率良好，能夠滿足實際樣品中18種目標藻毒素同時測定的要求。采用本方法對采自深圳珠江口28個站點的海水、懸浮顆粒物及沉積物樣品進行檢測，共檢出10種藻毒素，說明珠江口海洋環(huán)境中分布著藻毒素，并首次在中國海水及沉積物中檢出MTX3。