陳芳如，張兆康，2，何書(shū)涵，余羲溪，李艷霞*

（1.閩江學(xué)院 材料與化學(xué)工程學(xué)院，福建 福州 350108；2.福州大學(xué) 石油化工學(xué)院，福建 福州 350108）

隨著社會(huì)的高速發(fā)展和人類(lèi)文明的進(jìn)步，人們的生活水平有了極大的提高。但是環(huán)境污染與快節(jié)奏生活也導(dǎo)致肥胖、亞健康人群的比例不斷上升，諸如糖尿病、高血脂、心血管疾病、神經(jīng)性疾病等嚴(yán)重影響了人們的日常生活。這些疾病的治療通常不是一蹴而就，需要較長(zhǎng)的調(diào)養(yǎng)過(guò)程，需要對(duì)病人情況進(jìn)行日常監(jiān)測(cè)。譬如糖尿病，目前尚未有徹底根治的方法，患者一般需要終身檢測(cè)與治療，以控制血糖范圍，預(yù)防各類(lèi)并發(fā)癥。研究表明，人體的尿液、汗液、眼淚等生物流體的葡萄糖含量與體內(nèi)血糖濃度存在關(guān)聯(lián)，可用于糖尿病的血糖監(jiān)測(cè)［3］。但使用傳統(tǒng)方法檢測(cè)患者的血液指標(biāo)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，給醫(yī)院和患者帶來(lái)了極大的不便，因此，對(duì)病患血糖水平的實(shí)時(shí)及非侵入式檢測(cè)顯得尤為重要［1］。

生物傳感器是一種能將電化學(xué)傳感和生物分子特異性識(shí)別相結(jié)合的傳感裝置，在當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室和臨床分析各種化學(xué)和生物目標(biāo)中起著關(guān)鍵作用。電化學(xué)傳感器的最終目標(biāo)是構(gòu)建更加簡(jiǎn)便、靈敏和可靠的傳感界面，進(jìn)一步放大檢測(cè)信號(hào)，提高靈敏度和準(zhǔn)確度［2］。功能納米材料和納米技術(shù)的發(fā)展為改善電化學(xué)傳感器性能提供了新的可能，尋找高性能電極材料是制備優(yōu)異電化學(xué)傳感器的關(guān)鍵。隨著納米材料對(duì)高性能的器件需求日益增加，可控微納結(jié)構(gòu)的研究成為熱點(diǎn)之一［4］?？煽匚⒓{結(jié)構(gòu)的制備，重點(diǎn)在于微納加工技術(shù)的應(yīng)用，使其朝著簡(jiǎn)化制備工藝、低成本和高重復(fù)性的方向發(fā)展，激光微加工的廣泛應(yīng)用，極大地提高了加工效率和重復(fù)性，為下一代智能健康檢測(cè)提供了新思路。

石墨烯是一種單原子層的二維sp2雜化碳納米片，由于其大比表面積、高電子遷移率、熱導(dǎo)率、生物相容性、超低密度和機(jī)械柔性，從而表現(xiàn)出優(yōu)異的理化性能，并在傳感器、樣品前處理和超級(jí)電容器等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［5－6］。激光誘導(dǎo)石墨烯（LIG）技術(shù)可誘導(dǎo)聚酰亞胺（PI）襯底直接生成三維多孔結(jié)構(gòu)的石墨烯，表現(xiàn)出大比表面積和高導(dǎo)電性，制備過(guò)程無(wú)需高溫和溶劑，在柔性電極制備中應(yīng)用廣泛［7－8］。另外，作為最典型的嵌入式系統(tǒng)，較小體積的微電極使得電化學(xué)分析便攜、快速，更利于實(shí)際應(yīng)用［9－10］。

葡萄糖氧化酶（GOx）因具有重要的催化活性而被廣泛研究，其價(jià)格低廉，穩(wěn)定性好，實(shí)用性強(qiáng)，也是制備酶?jìng)鞲衅鞯睦硐肽Ｐ头肿樱?1］。鑒于酶的高選擇性和高催化活性特點(diǎn)，目前GOx法是市場(chǎng)上使用最多的血糖檢測(cè)方法，然而該工作的難點(diǎn)在于將酶固定在所需的平臺(tái)上。GOx通常被固定在覆蓋薄氟錫氧化物或銦錫氧化物、金或玻碳電極等剛性基底表面，阻礙了其在人體上的應(yīng)用。LIG電極因其良好的物生物相容性，以及作為酶的良好環(huán)境和促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移而被廣泛開(kāi)發(fā)［12］。電化學(xué)和激光相結(jié)合可為GOx在石墨烯基質(zhì)中的共價(jià)鍵合以及GOx的電子轉(zhuǎn)移提供良好環(huán)境，在葡萄糖監(jiān)測(cè)方面顯示出較好潛力，尤其在非侵入性和無(wú)痛性方面［13］。本文通過(guò)設(shè)計(jì)三電極圖案，結(jié)合LIG技術(shù)制備微型柔性石墨烯電極，利用1?芘丁酸的疏水端苯環(huán)與石墨烯的六元環(huán)結(jié)構(gòu)的π－π疊加效應(yīng)，對(duì)LIG電極表面工作區(qū)域羧基化，進(jìn)而共價(jià)交聯(lián)GOx，通過(guò)采用便攜式電化學(xué)工作站、計(jì)時(shí)電流分析法，記錄在恒定電壓下GOx催化葡萄糖產(chǎn)生的電流信號(hào)與葡萄糖濃度的關(guān)系，所制備的酶電極可用于人體血清、尿樣和汗液的葡萄糖檢測(cè)，從而構(gòu)建了基于GOx的高靈敏、高選擇葡萄糖傳感，進(jìn)一步推進(jìn)便攜、綠色、低成本生物傳感器的研制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Nano Pro－Ⅲ型激光打印機(jī)，配連續(xù)半導(dǎo)體激光器，波長(zhǎng)450 nm，輸出功率5.5 W（天津嘉銀納米科技有限公司）用于LIG電極制備；便攜式電化學(xué)工作站（sensit/BT，雷迪美特中國(guó)有限公司）。

聚酰亞胺（PI）膜（厚度0.08 μm，天津嘉銀納米科技有限公司）；導(dǎo)電銀漿（深圳市奧斯邦股份有限公司）；Ag/AgCl漿（廣州市銀標(biāo)貿(mào)易有限公司）；氯化鉀（99.5）、鐵氰化鉀（99.5）、亞鐵氰化鉀（99.5）、葡萄糖（分析純）、50%戊二醛（福州鑫裕華實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；葡萄糖氧化酶（GOx，150 U/mg）、人工汗液、人工尿液、胎牛血清（源葉生物科技有限公司）；1-芘丁酸（上海麥克林生化科技股份有限公司，98%）、牛血清白蛋白（BSA，98.0%）、磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS，0.1 mol/L，pH 7.0）（北京鼎國(guó)生物科技有限公司）。

1.2 電極的制備

1.2.1LIG電極的制備 將PI膜緊密粘貼于PET柔性基底上，Nano Pro－Ⅲ激光打印機(jī)與電腦連接，設(shè)計(jì)三電極圖案，設(shè)置激光相對(duì)強(qiáng)度為35%，雕刻深度為20%，激光打印石墨烯圖案，打印的電極依次用乙醇、水淋洗，室溫晾干。在石墨烯尾部（三電極端頭）涂上導(dǎo)電銀漿，參比電極末端涂上Ag/AgCl漿，聚二甲基硅氧烷（PDMS）固定工作區(qū)域面積，放入培養(yǎng)皿中蓋好，靜置，固化，得LIG電極，待用。

1.2.2LIG/芘丁酸電極的制備 于LIG電極工作區(qū)域，滴加3 μL 5 mmol/L 1-芘丁酸（簡(jiǎn)寫(xiě)為芘丁酸）的乙酸溶液，均勻分散，靜置1 h，依次用乙酸、乙醇、水淋洗電極，室溫下晾干，得到LIG/芘丁酸電極，使電極表面羧基化。

1.2.3LIG/GOx電極的制備 配制質(zhì)量濃度為4 mg/mL GOx和2 mg/mL BSA的PBS溶液（0.1 mol/L，pH 7.0），作為GOx溶液。于LIG/芘丁酸電極工作區(qū)域，先用2 μL乙醇浸潤(rùn)，半干（減小表面張力），再滴加10 μL GOx ?0.5%戊二醛混合溶液（7∶3，體積比），4 ℃活化過(guò)夜，純水淋洗，晾干備用，制得LIG/GOx電極，于培養(yǎng)皿中密閉，儲(chǔ)于冰箱備用。

1.3 葡萄糖電化學(xué)傳感分析

取所制備的LIG/GOx電極，從低到高移取100 μL系列濃度葡萄糖溶液，對(duì)電極進(jìn)行i~t掃描。每次更換溶液，需要用高一級(jí)濃度的溶液潤(rùn)洗電極3遍，恒定0.7 V電位下進(jìn)行掃描，每個(gè)濃度計(jì)時(shí)80 s，得i~t曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 電極制備及葡萄糖傳感

LIG/GOx電極制備及葡萄糖傳感分析過(guò)程示意圖如圖1所示，具體過(guò)程包括：A：激光直寫(xiě)三電極圖案化石墨烯；B：制備LIG電極；C：自組裝1-芘丁酸；D：戊二醛共價(jià)鍵合GOx；E：計(jì)時(shí)電流分析。

圖1 葡萄糖傳感分析示意圖Fig.1 Schematic of glucose sensing analysis

在室溫條件下使用連續(xù)半導(dǎo)體激光器，將聚酰亞胺（PI）襯底改性為具有高導(dǎo)電性的三維多孔石墨烯結(jié)構(gòu)［14］，無(wú)需使用高溫工藝、溶劑或后續(xù)處理。其基本原理是通過(guò)激光照射，將sp3碳原子光熱轉(zhuǎn)化為sp2碳原子［15］。激光照射產(chǎn)生的能量導(dǎo)致晶格振動(dòng)，產(chǎn)生較高的局域溫度，從而破壞碳氧鍵、碳氧鍵和氮碳鍵，芳香族化合物重新排列形成多層石墨結(jié)構(gòu)。結(jié)合圖案化設(shè)計(jì)，可制備特定圖案的石墨烯電極。芘丁酸疏水端的4個(gè)苯環(huán)相連的芘結(jié)構(gòu)，與石墨烯的碳六元環(huán)結(jié)構(gòu)通過(guò)π－π疊加效應(yīng)，穩(wěn)定結(jié)合在石墨烯電極表面，另一端的親水端羧基通過(guò)戊二醛共價(jià)交聯(lián)葡萄糖氧化酶，經(jīng)BSA封閉，得到LIG/GOx電極［16－18］。

2.2 電極材料的表征

采用掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)LIG和LIG/芘丁酸復(fù)合電極進(jìn)行表征（圖2）。可觀察到LIG電極表面呈現(xiàn)3D介孔的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且分散均勻、質(zhì)地緊密（圖2A），表明石墨烯電極具有較大的比表面積。LIG/GOx復(fù)合電極（圖2B）仍然保留完整的介孔結(jié)構(gòu)，說(shuō)明在GOx修飾過(guò)程中，電極表面形貌未被破壞，同時(shí)石墨烯膜層增厚，表明石墨烯表面富含的羧基通過(guò)與戊二醛共價(jià)交聯(lián)，將葡萄糖氧化酶成功固定到電極上。用透射電子顯微鏡（TEM）對(duì)激光直接制備的石墨烯納米材料進(jìn)行表征，可觀察到石墨烯的多層片狀結(jié)構(gòu)（圖2C）及LIG薄片的波紋狀結(jié)構(gòu)以及晶格條紋（圖2D），這些波紋結(jié)構(gòu)的形成歸因于激光輻射產(chǎn)生的表面熱膨脹，證明采用本方法的激光誘導(dǎo)技術(shù)，可一步生成石墨烯。

圖2 LIG電極（A）和LIG/GOx復(fù)合電極（B）的SEM圖及LIG石墨烯材料的TEM圖（C、D）Fig.2 SEM images of graphene electrode（A） and LIG/GOx composite electrode（B） and TEM images of LIG graphene materials（C，D）

采用EDS光譜分析LIG和LIG/GOx復(fù)合電極表面的C、N、O元素成分。圖3A所示，LIG電極表面C、N、O元素的相對(duì)含量分別為93.22%、1.44%和5.34%，說(shuō)明LIG電極表面主要由C組成，含極少量的N和O，修飾GOx后（圖3B），C、N和O元素的含量分別為88.32%、4.92%和6.76%，其O含量明顯增加，這是由于GOx富含氧元素，證明GOx成功修飾到LIG電極表面。

為進(jìn)一步表征電極表面GOx的共價(jià)修飾情況，采用Nicolet is50紅外光譜儀，將樣品壓在衰減全反射ATR附件上，對(duì)LIG和LIG/GOx電極工作區(qū)域界面進(jìn)行紅外全反射光譜分析。結(jié)果如圖3C所示，LIG電極表面未見(jiàn)明顯紅外吸收峰，而LIG/GOx電極表面可觀察到許多特征紅外吸收峰，其中3 287 cm?1處對(duì)應(yīng)O—H、N—H伸縮振動(dòng)，2 930 cm?1處對(duì)應(yīng)飽和碳上的C—H伸縮振動(dòng)，1 314 cm?1附近指紋峰對(duì)應(yīng)飽和碳上的C—H面內(nèi)彎曲振動(dòng)，1 640 cm?1處對(duì)應(yīng)酰胺鍵的伸縮振動(dòng)，1 142 cm?1對(duì)應(yīng)C—O—C（酯）的反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)，1 081、1 002 cm?1處對(duì)應(yīng)C—O鍵的伸縮振動(dòng)，這些特征峰的出現(xiàn)，表明GOx已成功修飾至LIG電極表面。

進(jìn)一步采用賽默飛DXR智能拉曼光譜儀對(duì)LIG的形成進(jìn)行表征，結(jié)果如圖3D所示?？捎^察到3個(gè)典型的石墨烯指紋振動(dòng)峰，分別為1 575 cm?1處的G帶、1 345 cm?1處的D帶和2 679 cm?1處的2D帶。D帶和2D帶分別為六方碳結(jié)構(gòu)sp2雜化的初級(jí)面內(nèi)振動(dòng)和二階面內(nèi)振動(dòng)，而G帶則與sp2雜化的C—C鍵拉伸模式有關(guān)。D帶和G帶之間的強(qiáng)度比（ID/IG）接近1，表明石墨烯結(jié)構(gòu)存在缺陷。

圖3 LIG、LIG/GOx電極表面的EDS 光譜（A、B）與紅外光譜（C），LIG石墨烯材料的拉曼光譜（D）Fig.3 EDS spectra（A，B） and infrared spectra（C） of LIG and LIG/GOx electrode surfaces，and Raman spectrum of LIG graphene materials（D）

2.3 電極的電化學(xué)活性

采用鐵氰化鉀溶液的循環(huán)伏安（CV）圖觀察電極的組裝過(guò)程，從圖4A可以看出，LIG電極有明顯的氧化還原峰。當(dāng)芘丁酸修飾LIG電極后，氧化峰正移，還原峰負(fù)移，響應(yīng)電流明顯下降，這是由于芘丁酸屬于小分子基團(tuán)，導(dǎo)電性能差，對(duì)電極表面的電子轉(zhuǎn)移有明顯的阻礙作用。LIG/GOx電極的峰電流進(jìn)一步減小，表明GOx已成功修飾至電極表面。LIG/芘丁酸電極能充分固定GOx，促進(jìn)GOx電活性中心與電極表面之間的電子轉(zhuǎn)移，同時(shí)保留了GOx的生物活性，給予GOx直接進(jìn)行電化學(xué)行為的微環(huán)境。GOx修飾的LIG電極的CV曲線(xiàn)圖仍然具有較明顯的氧化還原峰，說(shuō)明LIG/GOx電極表面仍具有良好的導(dǎo)電性及電化學(xué)響應(yīng)。

圖4 LIG、LIG/芘丁酸、LIG/GOx滴加鐵氰化鉀溶液（A）及LIG、LIG/GOx滴加PBS和葡萄糖溶液（B）的循環(huán)伏安圖Fig.4 Cyclic voltammograms of LIG，LIG/pyrene butyric acid，and LIG/GOx in potassium ferricyanide solution（A），LIG and LIG/GOx in PBS and glucose solution（B）

采用CV法進(jìn)一步考察LIG、LIG/GOx電極在PBS和葡萄糖溶液中的電化學(xué)行為。由于GOx作為識(shí)別元件對(duì)葡萄糖具有較高的選擇性，圖4B顯示LIG/GOx電極比LIG電極在葡萄糖溶液中具有更好的電化學(xué)響應(yīng)，說(shuō)明GOx在電化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中對(duì)葡萄糖起到了酶催化效果。

參照文獻(xiàn)［19］，電極表面的有效面積（Aef）f可根據(jù)Randles－Sevcik方程計(jì)算：Ip=2.69 ×105Aeffn2/3D01/2C0ν1/2。式中，n指參與氧化還原過(guò)程中電子傳遞數(shù)（n= 1，K3［Fe（CN）6］溶液），D0指鐵氰化鉀溶液的擴(kuò)散系數(shù)（0.673 × 10?5cm2/s），C0指氧化還原媒介質(zhì)的體相濃度（5 × 10?6mol/cm3K3［Fe（CN）6］），v為電位掃描速率，Ip為氧化峰電流（A）。通過(guò)公式，結(jié)合圖4A的CV曲線(xiàn)，計(jì)算出LIG、LIG/芘丁酸、LIG/GOx、LIG/GOx（BSA）電極的Aeff值依次為0.222、0.090、0.048、0.028 cm2，表明LIG電極經(jīng)芘丁酸、GOx以及BSA修飾后，電極表面產(chǎn)生較大影響，其氧化還原峰電流逐步降低，有效面積逐步減小。

單位面積修飾物的負(fù)載量（Γ，mol/cm2）通過(guò)Faraday公式計(jì)算：Ip=nFQv( 4RT)=n2F2AΓv( 4RT)和Γ=Q(nFAeff)，式中，Q為CV曲線(xiàn)的氧化峰面積積分，R為氣體常數(shù)，T為溶液絕對(duì)溫度，n指參與氧化還原過(guò)程中電子傳遞數(shù)（n= 1），F(xiàn)指法拉第常數(shù)（F = 96 493 C/mol）。通過(guò)公式和結(jié)合圖4A，計(jì)算出LIG/芘丁酸，LIG/GOx電極表面修飾物質(zhì)的Γ值分別為2.48 × 10?9、3.42 × 10?9mol/cm2，從而計(jì)算出被固定在電極表面單位面積GOx的數(shù)量為9.4 × 10?10mol/cm2。

2.4 電位對(duì)電流信號(hào)的影響

為比較葡萄糖氧化酶在不同電位的電化學(xué)響應(yīng)，參考文獻(xiàn)［18，20］并根據(jù)圖4B的CV曲線(xiàn)，選擇0.5、0.6、0.7 V 3個(gè)恒定電位進(jìn)行比較。以PBS緩沖液作為基底液，在3個(gè)恒定電位下，每隔80 s依次從低到高對(duì)不同濃度的葡萄糖溶液進(jìn)行計(jì)時(shí)電流掃描。結(jié)果顯示，隨著電壓的增加，LIG/GOx電極對(duì)葡萄糖的靈敏度隨之增加，且在0.7 V時(shí)對(duì)葡萄糖的電流響應(yīng)最顯著、靈敏度最高（圖5A），其優(yōu)異性可能與葡萄糖氧化酶的催化活性及穩(wěn)定性有關(guān)。實(shí)驗(yàn)選擇0.7 V作為L(zhǎng)IG/GOx測(cè)試萄萄糖的最佳工作電位。

葡萄糖氧化酶在氧分子存在下能氧化葡萄糖生成D-葡萄糖內(nèi)酯酸。圖5B為經(jīng)N2除氧和不除氧條件下，LIG/GOx對(duì)葡萄糖溶液的i~t曲線(xiàn)圖。結(jié)果顯示，不除氧條件下，LIG/GOx的計(jì)時(shí)電流信號(hào)隨葡萄糖濃度的增加而顯著增加，而脫氧情況下其計(jì)時(shí)電流變化不大，表明此時(shí)GOx對(duì)葡萄糖的生物電催化氧化效果不明顯。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［21］，推測(cè)GOx在LIG/GOx電極表面可能發(fā)生如下電化學(xué)反應(yīng)：

圖5 LIG/GOx在不同電位（A）和脫氧環(huán)境下（B）對(duì)葡萄糖的i ~ t曲線(xiàn)圖Fig.5 i－t curves of LIG/GOx in glucose solution at different potentials（A） and deoxygenation（B）glucose concentration（from left to right）：0，5.0 × 10?5，1.0 × 10?4，5.0 × 10?4，1.0 × 10?3，2.5 × 10?3，5.0 × 10?3，1.0 × 10?2 mol/L

即氧化態(tài)葡萄糖酶（GOx（FAD））將葡萄糖氧化為葡萄糖內(nèi)酯酸，同時(shí)還原態(tài)酶GOx（FADH2）將溶液中氧氣還原為過(guò)氧化氫。在含氧條件下，反應(yīng)（1）和（2）同時(shí)發(fā)生；在脫氧條件下，具有生物活性的GOx（FAD）發(fā)生反應(yīng)（1），GOx（FADH2）在修飾電極上發(fā)生直接電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)（反應(yīng)（3），這也是無(wú)氧條件下，計(jì)時(shí)電流具有一定信號(hào)響應(yīng)，但信號(hào)強(qiáng)度隨濃度變化不大的原因。

2.5 工作曲線(xiàn)

在0.7 V電位下，以PBS緩沖液作為基底液，每隔80 s對(duì)不同濃度（5.0 × 10?5、1.0 × 10?4、5.0 ×10?4、1.0 × 10?3、2.5 × 10?3、5.0 × 10?3、1.0 ×10?2mol/L）葡萄糖溶液依次進(jìn)行掃描，采用計(jì)時(shí)電流法考察LIG、LIG/GOx電極對(duì)葡萄糖的響應(yīng)（圖6）。結(jié)果顯示，與LIG相比，LIG/GOx對(duì)葡萄糖的響應(yīng)迅速，且隨著體系中葡萄糖濃度的增加，響應(yīng)電流呈階梯式增長(zhǎng)，說(shuō)明LIG/GOx電極對(duì)葡萄糖具有極高的親和力和酶催化活性。

將不同濃度所得計(jì)時(shí)電流值與葡萄糖濃度對(duì)數(shù)作工作曲線(xiàn)（圖6），可以看出：LIG/GOx的電流響應(yīng)與葡萄糖濃度的對(duì)數(shù)呈指數(shù)關(guān)系，葡萄糖溶液檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍為5.0 × 10?5~ 1.0×10?2mol/L，其檢測(cè)范圍寬于常規(guī)血糖儀（羅氏卓越精采血糖儀的檢測(cè)范圍為0.6 ~ 33.3 mmol/L，三諾GA－3血糖儀的檢測(cè)范圍為1.1 ~ 33.3 mmol/L）。通過(guò)逐步降低葡萄糖溶液濃度，測(cè)得檢出限（S/N= 2）為5.0 × 10?5mol/L。說(shuō)明LIG/GOx電極對(duì)葡萄糖檢測(cè)具有較靈敏的電流響應(yīng)，而LIG電極對(duì)葡萄糖基本無(wú)響應(yīng)，證明GOx在電化學(xué)反應(yīng)中對(duì)葡萄糖起到定向催化作用。

圖6 LIG、LIG/GOx電極對(duì)濃度葡萄糖溶液的i ~ t曲線(xiàn)圖Fig.6 i－t curves of LIG and LIG/GOx in different glucose concentrations glucose concentration（from left to right）：0，5.0 × 10?5，1.0 × 10?4，5.0 × 10?4，1.0 × 10?3，2.5 × 10?3，5.0 × 10?3，1.0 × 10?2 mol/L；insert：the calibration curves

將本方法與幾種報(bào)道的葡萄糖電化學(xué)生物傳感器進(jìn)行比較（見(jiàn)表1）。結(jié)果顯示，本方法所構(gòu)建的傳感器具有較寬的檢測(cè)范圍和較好的靈敏度，且電極易于制備、環(huán)境友好、成本低廉，具有良好的應(yīng)用前景。

表1 電化學(xué)葡萄糖傳感方法的比較Table 1 The comparison of electrochemical sensor for detection of glucose

2.6 電極性能

選取濃度均為1 mmol/L的酒石酸、蔗糖、半乳糖、乳糖酸和葡萄糖等小分子樣品，采用計(jì)時(shí)電流法分析其在修飾電極上的電化學(xué)響應(yīng)情況。實(shí)驗(yàn)顯示，只有葡萄糖表現(xiàn)出顯著的電流響應(yīng)，而酒石酸、蔗糖、半乳糖、乳糖酸等均表現(xiàn)出微弱的電流響應(yīng)。表明半乳糖等干擾物對(duì)葡萄糖的檢測(cè)干擾較小，LIG/GOx電極對(duì)葡萄糖傳感具有良好的選擇性。

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，采用同一LIG/GOx電極連續(xù)測(cè)定5次，隨著使用次數(shù)的增加，電流曲線(xiàn)呈緩慢下降趨勢(shì)，但仍具有較好的電流強(qiáng)度，表明該LIG/GOx電極具有良好的重復(fù)性。

對(duì)同一批次5個(gè)LIG/GOx電極進(jìn)行i ~ t掃描。結(jié)果表明，濃度為1.0 × 10?4、1.0 × 10?3、5.0 ×10?3mol/L的葡萄糖溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為7.7%、6.8%、5.0%，說(shuō)明該LIG/GOx電極具有良好的精密度。

在相同條件下，將LIG/GOx電極在冰箱4 ℃下放置8 d，分別在第1、2、4、8 d進(jìn)行測(cè)定，并記錄i~t曲線(xiàn)。隨著電極放置時(shí)間的延長(zhǎng)，電流響應(yīng)呈緩慢下降趨勢(shì)，但仍有較好的電流表現(xiàn)，說(shuō)明放置一定時(shí)間，GOx損失不顯著，該LIG/GOx電極具有較好的穩(wěn)定性和使用壽命。

2.7 LIG/GOx電極的柔性

考察了該電極在卷曲狀態(tài)下的電化學(xué)性質(zhì)。采用平鋪和卷曲狀態(tài)（圖7內(nèi)插圖）下LIG/GOx電極對(duì)高、中、低3種濃度的葡萄糖溶液進(jìn)行i~t曲線(xiàn)掃描（圖7）。結(jié)果顯示，兩種狀態(tài)下，i~t曲線(xiàn)接近重合，說(shuō)明LIG/GOx電極在一定卷曲程度下，仍保留良好的電化學(xué)響應(yīng)，卷曲后不影響使用［26］。表明所制備的LIG/GOx電極具備一定的柔性。

圖7 柔性L(fǎng)IG/GOx電極在不同彎曲狀態(tài)下的i ~ t曲線(xiàn)Fig.7 i－t curves of the flexible LIG/GOx electrode under different crimping conditions

2.8 實(shí)際樣品的測(cè)定

選取用PBS稀釋1倍的人工尿液、人工汗液，稀釋20倍的胎牛血清的作為生物樣品，分別添加低、中、高3種不同濃度的葡萄糖溶液，進(jìn)行i ~ t掃描，并計(jì)算加標(biāo)回收率。由表2可知，尿液、血清、汗液樣品中葡萄糖的回收率依次為73.0% ~97.8%、103% ~ 144%、79.1% ~ 104%，其中血清樣品的加標(biāo)回收率偏高，但仍在可接受范圍，說(shuō)明本方法能較好地用于尿液、血清、汗液等生物樣品中葡萄糖的檢測(cè)。

表2 不同生物樣品中葡萄糖的加標(biāo)回收率Table 2 Spiked recoveries of glucose in different biological samples

3 結(jié) 論

本文采用LIG技術(shù)制備柔性L(fǎng)IG電極，通過(guò)GOx的共價(jià)修飾，構(gòu)建了一種葡萄糖生物傳感器。選擇靈敏的計(jì)時(shí)電流法研究了葡萄糖在GOx修飾電極的電化學(xué)行為。結(jié)果表明，LIG/GOx電極在0.7 V恒定電位下，其響應(yīng)電流在5.0 × 10?5~ 1.0 × 10?2mol/L范圍內(nèi)隨葡萄糖濃度的增加而增加，對(duì)葡萄糖表現(xiàn)出較高的選擇性和靈敏度，良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，且具有一定柔性。基于LIG電極的葡萄糖檢測(cè)成本低廉，操作簡(jiǎn)便，可用于實(shí)際樣品分析，并賦予這類(lèi)傳感器的非臨床和無(wú)創(chuàng)檢測(cè)功能，同時(shí)也為葡萄糖的便攜式檢測(cè)開(kāi)拓了新思路，具有很好的應(yīng)用前景。