李琳，楊金生，趙寒冬，袁陸，管郡，王楠，劉云志*

（1.吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春 130062；2.長(zhǎng)春農(nóng)業(yè)博覽園，吉林 長(zhǎng)春 130117 ；3.大安市畜牧總站，吉林 大安 131300）

血清4型禽腺病毒感染即肝炎-心包積液綜合征，又叫心包積液綜合征，是由血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4，F(xiàn)ADV-4）引起的一種急性傳染病[1]。本病典型的發(fā)生過(guò)程是雞在3周齡出現(xiàn)死亡，在4～5周齡出現(xiàn)死亡高峰，然后死亡率開(kāi)始下降。本病潛伏期短，發(fā)病快，呈急性死亡，死亡率在20%～80%。本病于1987年在巴基斯坦安卡拉地區(qū)首次暴發(fā)，因此也被稱為安卡拉病[2]。隨后在世界多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有報(bào)道，我國(guó)于2006～2014年有零星出現(xiàn)，2015年后在全國(guó)多個(gè)省份快速流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。禽腺病毒屬共3個(gè)群，14個(gè)血清型，其中禽腺病毒血清4型屬Ⅰ群可引起雞的安卡拉病。由于Ⅰ亞群腺病毒作為原發(fā)病原的作用尚未搞清楚，不同的血清型，甚至相同血清型的不同毒株，其致病力和感染力差異很大，在造成發(fā)病和死亡或者引發(fā)呼吸道疾病的能力也有所不同。但當(dāng)它與傳染性法氏囊病毒共同感染卻可增強(qiáng)禽腺病毒的致病性，共同感染雞貧血病病毒時(shí)能大大增強(qiáng)禽腺病毒引起肝炎和致死能力。本實(shí)驗(yàn)室此次分離獲得的致病血清4型禽腺病毒毒株，初步命名為FADV-4 CC株，為下一步病毒的遺傳演化規(guī)律研究和發(fā)病分子機(jī)制研究打下基礎(chǔ)，并對(duì)該病在吉林省的流行防控、抗病毒藥物的篩選、疫苗研制都將具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

2022年6 月吉林省長(zhǎng)春市某蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)送檢49日齡病死雞（品種為海蘭褐），截止送雞前，死亡率達(dá)到20%以上，發(fā)病率在80%左右。病雞臨床主要表現(xiàn)為精神沉郁、羽毛成束，有明顯的呼吸道和神經(jīng)癥狀。

1.2 主要試劑

瓊脂糖（分析純），50×TAE緩沖液，PBS，DL2000 DNA Marker，10×Loading Buあer，雙蒸餾水，PCR 用 ExTaq，10×ExTaq Buあer，dNTP Mixture，傳染性法氏囊病抗原快速檢測(cè)試紙（河南百奧生物工程有限公司）等。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

引物設(shè)計(jì)主要參照安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)《I群血清4型禽腺病毒核酸PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程》（DB 34/T 3121—2018）[4]。上游引物 P1：FADV-4(5'-GACCGTTACAAGTTTAGCATCTCC -3')，下游引物P2：FADV-4(5'- TCGCAGGAAGTCGTAGTGGA-3')，擴(kuò)增核酸片段大小為951 bp，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。如果樣品的PCR產(chǎn)物電泳后在951 bp位置出現(xiàn)特異性的條帶，則判定為禽腺病毒4型核酸檢測(cè)陽(yáng)性，反之為陰性。

1.4 病料處理與分離

無(wú)菌采取病雞心包積液、肝臟、脾臟、腎臟接種血瓊脂平板培養(yǎng)基，同時(shí)對(duì)病雞肝臟按1∶5 (V/V)比例加入生理鹽水研磨，反復(fù)凍融3次，經(jīng)10 000r/min高速離心1 h，取上清液接種7日齡SPF雞胚（卵黃接毒），采集尿囊液，用尿囊液提取的核酸作為 DNA 模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。

1.5 PCR擴(kuò)增禽腺病毒鑒定的反應(yīng)體系

10×ExTaq buffer(Mg2+plus) 2.5 μL ，dNTP Mixture 1 μL，P1：FADV-4（10 μM）0.5 μL，P2：FADV-4（10 μM）0.5 μL，ExTaq 酶 0.3 μL，DNA 模板（質(zhì)量濃度大于 129.6 pg/μL）2 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)至 20 μL，擴(kuò)增參數(shù)為：第一階段94 ℃預(yù)變性5 min；第二階段94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，30個(gè)循環(huán)；第三階段 72 ℃延伸 10 min，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察結(jié)果。

1.6 血凝試驗(yàn)（HA）、試紙條檢測(cè)

鑒于送檢病料需要實(shí)驗(yàn)室病毒分離鑒定及后期雞群治療，檢測(cè)是否有混合感染發(fā)生，因此通過(guò)常規(guī)血凝試驗(yàn)和傳染性法氏囊病抗原快速檢測(cè)試紙，檢測(cè)病雞是否患有新城疫、禽流感和傳染性法氏囊病這幾個(gè)主要易發(fā)疫病。

1.7 回歸試驗(yàn)

試驗(yàn)將15日齡的SPF雞分攻毒組和對(duì)照組，各5只。攻毒組中5只雞均肌肉注射尿囊液0.5 mL，其余5只雞肌肉注射生理鹽水0.5 mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 剖檢及細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果

對(duì)送檢病死雞進(jìn)行剖檢，可見(jiàn)心臟被淡黃色透明液體包裹，肝臟腫大、變黃（圖1）、有出血點(diǎn)（圖2），腎臟腫大，腸道無(wú)明顯病變。病料經(jīng)血瓊脂平板培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)24 h，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。經(jīng)詢問(wèn)，雞場(chǎng)還未接種過(guò)腺病毒任何疫苗。

圖1 病死雞心包積液，肝臟腫大變黃

圖2 病死雞心包積液，肝臟有出血點(diǎn)

2.2 血凝試驗(yàn)、試紙條檢測(cè)結(jié)果

采集尿囊液進(jìn)行血凝試驗(yàn)，不能凝集1%雞紅細(xì)胞懸液，證明分離毒株無(wú)血凝性，對(duì)照組新城疫病毒凝集1%雞紅細(xì)胞懸液；傳染性法氏囊病抗原快速檢測(cè)試紙檢測(cè)呈陰性，因此分離毒不含傳染性法氏囊病毒。

2.3 病毒分離和增殖

接種7日齡SPF雞胚5枚，置37 ℃繼續(xù)孵化，雞胚分別于接種后3日死亡3枚，4日1枚，5日死亡1枚，無(wú)菌采集死亡雞胚的尿囊液。

2.4 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

以尿囊液提取的核酸作為DNA模板，通過(guò)PCR檢測(cè)，在951 bp處出現(xiàn)目的條帶，陰性對(duì)照未見(jiàn)特異條帶（圖3）。

圖3 血清4型禽腺病毒的PCR鑒定

2.5 回歸試驗(yàn)

用無(wú)菌采集的尿囊液既命名為FADV-4 CC株攻毒15日齡的SPF雞，發(fā)病率和死亡率均為100%（5/5），剖檢死亡攻毒雞發(fā)現(xiàn)肝臟腫大變黃明顯，心臟被一層薄膜包裹，可見(jiàn)明顯心包積液（圖4和圖5）。對(duì)照組雞只無(wú)臨床癥狀，均健康存活。

圖4 攻毒SPF雞肝臟變黃、有出血點(diǎn)，可見(jiàn)心包積液

圖5 攻毒SPF雞肝臟明顯變黃

3 小結(jié)

禽腺病毒屬于腺病毒科禽腺病毒屬成員為雙股DNA病毒。血清4型禽腺病毒屬于禽腺病毒C種成員FAV-4型，被認(rèn)為是引起雞心包積液綜合征的病原[5]。本病可垂直傳播也可水平傳播，以心臟被淡黃色透明液體包裹、肝臟腫大為特征。養(yǎng)殖戶一般均在70日齡首免，30日后進(jìn)行第二次免疫，一些養(yǎng)殖戶開(kāi)產(chǎn)前還進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫。由于個(gè)別養(yǎng)殖場(chǎng)周邊沒(méi)有發(fā)生過(guò)腺病毒，養(yǎng)殖戶抱有僥幸心理不接種腺病毒疫苗，近年來(lái)導(dǎo)致該病毒在某些地區(qū)仍有零星發(fā)生。該病暴發(fā)突然，發(fā)病率高，治療后蛋雞產(chǎn)蛋量只能達(dá)到80%～85%左右，且后期一些處于亞健康雞只由于免疫力低仍會(huì)有零星死亡，給養(yǎng)殖場(chǎng)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。因此，在加強(qiáng)飼養(yǎng)管理的同時(shí)，建議通過(guò)新流腺三聯(lián)滅活疫苗【雞新城疫、禽流感（H9亞型）、禽腺病毒病（I群4型）三聯(lián)滅活疫苗（La Sota株+YT株+QD株）】或新流法腺四聯(lián)滅活疫苗來(lái)對(duì)本病進(jìn)行有效預(yù)防和控制。對(duì)未接種疫苗雞場(chǎng)，建議及時(shí)補(bǔ)免。若發(fā)生疫情應(yīng)先緩解臨床癥狀，采用中藥抗病毒藥同時(shí)用抗生素，以此提高機(jī)體的免疫力，補(bǔ)免完成的同時(shí)要密切關(guān)注群體，防止應(yīng)激的發(fā)生。