鄒淳緣，許曉峰，盧仁泉，郭 林

復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院檢驗科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

肺癌是嚴重威脅全世界人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率高居第1位［1］。早期診斷對提高肺癌手術切除成功率、改善遠期生存結局具有十分重要的意義。而通過篩選敏感性、差異性表達的基因或蛋白，改進影像學診斷技術等有助于早期發(fā)現(xiàn)及診治肺癌。腫瘤的發(fā)生離不開環(huán)境的變化和基因的突變，進而影響參與組織和細胞正常生長和代謝的蛋白表達。因此，尋找特異性的腫瘤基因或蛋白，并可在外周血液中穩(wěn)定、高效檢測，無疑將為提高腫瘤早期診斷準確度和臨床干預提供重要依據(jù)。抑癌基因（p53）［2］、蛋白基因產(chǎn)物（PGP9.5）［3］、轉錄因子（SOX2）［4］、腫瘤相關基因編碼蛋白（GAGE7）［5］、解旋酶（GBU4-5）［6］和黑色素瘤抗原（MAGE A1）［7］蛋白被證實與肺癌的發(fā)生、發(fā)展具有密切關系，前期研究［8］發(fā)現(xiàn)其在肺癌外周血清中的抗體免疫染色陽性率顯著高于健康體檢者；本研究擬進一步探討肺癌腫瘤組織和外周血清中上述6種蛋白表達水平的相 關性。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

選擇2018年5月—2020年5月在復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院確診的肺癌患者共100例。納入標準：①年齡18～ 75歲；② 經(jīng)胸部CT、引導穿刺及手術后病理學檢查確診為肺癌，均為單發(fā)病變；③可手術切除完整腫瘤組織和癌旁3 cm外正常肺組織；④ 取得患者的知情同意，臨床資料完善。排除標準：①肺部轉移瘤，合并其他部位原發(fā)惡性腫瘤，已明確肺癌有遠處轉移，不適合手術切除；② 既往未行放化療。

100例患者中男性60例，女性40例，年齡52～ 75歲，平均（60.5±9.4）歲；腫瘤位于左側55例，右側45例；腫瘤臨床TNM分期Ⅰ期25例，Ⅱ期45例，Ⅲa期30例；病理學類型為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）80例，小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）20例；分化級別為低分化40例，中分化35例，高分化25例，腫瘤最大直徑為1.5～ 5.0 cm，平均（3.5±1.3）cm。

1.2 研究方法

手術切除完整腫瘤組織和癌旁組織（癌組織3 cm外的肺組織），采用免疫組織化學染色法檢測上述6種蛋白的陽性表達情況，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQPCR）法檢測其基因表達水平，采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測外周血中血清蛋白的陽性情況。

1.2.1 免疫組織化學染色法

常規(guī)制作石蠟組織切片，厚度5 μm，參照抗體二步法滴加順序進行組織染色，以大鼠抗人p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白一抗（美國Sigma公司，1∶2 000）置于濕盒內4 ℃溫育過夜，正常大鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）為陰性對照；滴加驢抗大鼠二抗（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司，1∶500）置于濕盒中27 ℃溫育 20 min；滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）置于濕盒中27 ℃溫育20 min；DAB顯色，在光學顯微鏡下觀察。以細胞染成黃色為強度指標，陽性細胞比例為數(shù)量指標，分別賦值0～ 3分和0～ 4分，兩項乘積＜4分為陰性，≥4分為陽性。

1.2.2 RTFQ-PCR檢測

采用德國Qiagen公司全量RNA提取試劑盒完成提取工作，冰上溶解、剪碎組織，加TRIzol萃取液，氯仿分層，乙醇溶解，RNeasy分離柱純化，緩沖液層析，反復多次，最后用紫外分光光度計測定RNA純度和濃度。按德國Qiagen公司反轉錄試劑盒說明書要求完成cDNA合成工作，1.0 μg樣品RNA+4 μL緩沖液+2 μL混合物+2 μL正反引物，加水至反應總體積20 μL。采用日本Takara公司試劑盒測定目標引物表達量，反應體系為6.8 μL SYBER+0.4 μL DYE+0.4 μL正反引物2.0 μL cDNA，置于美國Baker公司PCR反應儀上擴增，反應條件為95 ℃ 30 s（95 ℃ 5 s、60 ℃ 35 s），共進行40個循環(huán)，以U6為內參，計算相對表達量。p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGEA1目標基因的引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 ELISA測定

主要儀器為BIO-Tek全自動酶標儀，p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1對應抗體試劑盒由杭州凱保羅生物科技有限公司提供。

主要步驟：向固相板內每孔加入200 μL磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS），按照固相板加樣示意圖，加入50 μL質控品、校準品、上樣控制品、稀釋好的待測樣本在相應微孔中，確保所有微孔底部被溶液覆封，貼封板膜，室溫振蕩溫育60 min。每孔加工作液200 μL，重復上述步驟3次。每孔加入稀釋好的酶結合物工作液50 μL，貼封板膜室溫振蕩溫育30 min。重復洗板步驟，每孔加入混合好的顯色劑100 μL，室溫避光振蕩溫育15 min。與加入顯色劑相同的順序，每孔加入終止液50 μL，反應結束30 min內用酶標儀讀取450 nm處的吸光度（D）值。結果判定標準見表1。

表1 6種指標的醫(yī)學臨界值Tab.1 Medical cut-off values of 6 indicators

1.3 觀察指標

比較每例患者腫瘤組織與癌旁組織中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的陽性率和基因表達水平的差異；將上述6種蛋白的陽性率和基因表達水平分別與腫瘤的臨床病理學特征進行相關分析，其中臨床特征包括患者性別、年齡、腫瘤直徑、病理學類型、TNM分期和分化級別。最后，將腫瘤組織中上述6種蛋白的表達與外周血清表達進行相關分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0軟件對計量資料進行t或F檢驗，計數(shù)資料進行χ2檢驗，采用Pearson相關性分析腫瘤組織中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白表達與對應血清表達水平的相關關系，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤組織與癌旁組織中蛋白陽性表達及血清中陽性表達的比較

腫瘤組織、血清中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的陽性表達率明顯高于癌旁組織（P＜0.05，表2）。

表2 腫瘤組織與癌旁組織中蛋白陽性表達及血清中陽性表達的比較Tab.2 Comparison of positive protein expression in tumor tissues and adjacent tissues and serum［ n（%）］

2.2 腫瘤組織與癌旁組織中蛋白的相對表達水平及血清中表達水平的比較

腫瘤組織、血清中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的相對表達水平均明顯高于癌旁組織（P＜0.05，表3）。

表3 腫瘤組織與癌旁組織中蛋白相對表達水平及血清中表達水平的比較Tab.3 Comparison of protein relative expression levels in tumor tissues and adjacent tissues and serum expression levels（）

表3 腫瘤組織與癌旁組織中蛋白相對表達水平及血清中表達水平的比較Tab.3 Comparison of protein relative expression levels in tumor tissues and adjacent tissues and serum expression levels（）

2.3 腫瘤組織中蛋白陽性表達和相對表達水平與腫瘤臨床病理學特征的關系

腫瘤組織中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的陽性表達率和相對表達水平與腫瘤TNM分期和分化級別有關（P＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤直徑、病理學類型無關（P＞0.05，表4）。

表4 腫瘤組織蛋白陽性表達和相對表達水平與腫瘤臨床病理學特征的關系Tab.4 Relationship between positive and relative expression levels of protein in tumor tissues and clinicopathological characteristics of tumors［Quantification（n）］

2.4 血清中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGE A1陽性率及表達水平與腫瘤臨床病理學特征的關系

患者血清中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1陽性率及表達水平與腫瘤TNM分期和分化級別有關（P＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤直徑、病理學類型無關（P＞0.05，表5）。

表5 血清中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5、MAGE A1陽性率及表達水平與腫瘤臨床病理學特征的關系Tab.5 Relationship between the positive rate and level of p53,PGP9.5,SOX2,GAGE7,GBU4-5,MAGE A1 in serum and the clinicopathological characteristics of tumors［Quantification（n）］

2.5 腫瘤組織中蛋白表達與外周血清表達水平的關系

腫瘤組織中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白表達與對應血清表達水平具有較好的一致性（P＞0.05，圖 1）。

圖1 腫瘤組織中蛋白表達與外周血清表達水平的相關性分析Fig.1 Correlation analysis of tumor tissue protein expression and peripheral blood serum expression

3 討論

血清腫瘤相關抗原自身抗體直接參與腫瘤進展，惡性腫瘤細胞分泌的一些抗體可對腫瘤細胞增殖、遷移發(fā)揮促進作用，這一觀點已經(jīng)得到大多數(shù)研究學者的證實［8］。隨著惡性腫瘤細胞改變細胞表面抗原，腫瘤細胞表面抗原出現(xiàn)，誘導免疫系統(tǒng)產(chǎn)生自身抗體，國外一項研究［9］探討血清自身抗體在食管癌早期診斷中的應用價值，對130例食管癌患者和110例對照者進行ELISA檢測，繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，總靈敏度為83.08%，總特異度為72.73%，基于肯定判斷標準建立諾模圖，在校準曲線驗證后，計算ROC曲線的曲線下面積為0.880，說明血清自身抗體群聯(lián)合檢測對食管癌的早期診斷具有一定的臨床應用價值。有研究［10-11］發(fā)現(xiàn)，腫瘤發(fā)生早期人體免疫系統(tǒng)可識別腫瘤特異性抗原，細胞壞死后釋放至循環(huán)血液中。腫瘤相關抗原的改變，如過表達、突變、錯誤折疊、異常退化等，導致腫瘤患者反應性免疫應答，進而產(chǎn)生對應自身抗體。獲得免疫原性的主要途徑有：①蛋白過度表達、突變、折疊錯誤；② 異常表達，正常情況下腫瘤/睪丸抗原僅在人體生殖細胞中表達，但多種腫瘤中約有40個抗原異常表達（如MAGE A1、CAGE）；③蛋白轉譯后的修飾，如磷酸化、糖基化、剪切、氧化后出現(xiàn)新的表位；④ 蛋白異位表達，如腫瘤胞內蛋白分泌到細胞外或重新定位到細胞表面。

在癌癥的早期階段，機體的免疫系統(tǒng)可以識別出腫瘤細胞通過體液免疫表達的少量異常蛋白質即腫瘤特異性抗原，并產(chǎn)生針對這些抗原的抗體。不同種類肺癌的患者可以檢測血清中的腫瘤特異性抗原。這些抗體不僅可以在診斷出肺癌時檢測到，而且在某些情況下甚至可以在臨床癥狀出現(xiàn)前5年檢測到［12］。Chapman等［13］研究發(fā)現(xiàn)，歐洲人特有的7種自身抗體p53、c-myc、HER2、NY-ESO-1、CAGE、MUC1和GBU4-5的靈敏度為76%，特異度為92%。Zhang等［10］研究發(fā)現(xiàn)，腺癌組GBU4-5、PGP9.5水平高于鱗狀細胞癌組，表明GBU4-5和PGP9.5有可能用于區(qū)分腺癌和鱗狀細胞癌。然而腺癌組進一步分為原位腺癌組和浸潤性肺腺癌組，這兩組自身抗體的表達差異無統(tǒng)計學意義，不能用于區(qū)分特定的腺癌類型，表明雖然自身抗體可用于早期肺癌篩查，但不能用作準確診斷的手段。Infante等［14］首次發(fā)現(xiàn)p53與腫瘤進展相關，靈敏度為27%，特異度為90%。原因是p53不僅在肺癌中表達，而且在許多其他惡性腫瘤（如結直腸癌、乳腺癌等）中也表達。Parrales等［15］研究發(fā)現(xiàn)，p53在50%以上的癌癥中表達，這與腫瘤細胞的活性密切相關，是潛在的癌癥治療靶點。Qin等［16］研究發(fā)現(xiàn)，GBU4-5的靈敏度為7%，特異度為98%，曲線下面積為0.91，CAGE的靈敏度為14%，特異度為98%，曲線下面積為0.90，SOX2的靈敏度為14%，特異度為99%，曲線下面積為0.93。這些自身抗體靈敏度高，但特異度低，聯(lián)合檢測特異度高，但靈敏度較低。Du等［11］研究報道，聯(lián)合檢測7種自身抗體（p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5、CAGE和MAGEA1）比單抗體檢測更有利。

本研究顯示，肺癌組織中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的陽性率和基因表達水平均明顯高于癌旁組織（P＜0.05）。p53是最早發(fā)現(xiàn)的抑癌基因之一，也是目前研究最廣泛的腫瘤抗原，在所有惡性腫瘤中，50%以上會出現(xiàn)p53基因的突變［17］。p53蛋白調節(jié)細胞周期，p53基因突變導致p53蛋白失活是腫瘤發(fā)生的一個重要步驟［18］。PGP9.5是神經(jīng)元胞質基因產(chǎn)物，屬于泛素水解酶，是神經(jīng)內分泌系統(tǒng)特異性蛋白［19］。其表達不依賴神經(jīng)分化而獨立存在，與腫瘤的病理學分期密切相關，在原發(fā)性肺癌中大量表達，但在正常肺部組織中幾乎不表達［20］。SOX2具有HMG DNA結合域的轉錄因子，在胚胎干細胞和生殖細胞中表達。SOX2通過與靶基因HMG結構域特異性結合，調控胚胎和組織發(fā)育，維持干細胞多能性、增殖性和決定細胞壽命等［21］。SOX2誘導腫瘤癌信號表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和BCL2L1，促進肺癌細胞增殖；同時SOX2是肺腺癌預后不佳的獨立預測因子，與復發(fā)風險相關［22］。GAGE7屬于腫瘤/睪丸抗原，在正常組織中不表達，只在惡性腫瘤及睪丸組織中表達，具有抗細胞凋亡活性［23］。GBU4-5屬于腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）結合RNA解旋酶，在癌變過程中發(fā)揮重要作用，具有腫瘤特異性和免疫原性［24］。MAGE A1在正常組織中不表達，只在惡性腫瘤和睪丸組織中表達，在非小細胞肺癌中表達與較差的預后相關，與基因轉錄和腫瘤進展有關［25］。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的陽性率及基因表達水平與腫瘤TNM分期和分化級別有關（P＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤直徑、病理學類型無關（P＞0.05），提示p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1表達上調與腫瘤的惡性程度有關。腫瘤組織中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白的陽性表達與外周血清上述蛋白的陽性表達具有較好的一致性（P＞0.05）。證實通過外周血檢測對應抗體與腫瘤組織中蛋白陽性表達具有直接對應關系。

綜上所述，肺癌腫瘤組織和外周血清中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白表達陽性與腫瘤TNM分期和分化級別密切相關。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。