吳周璐，龔穎蕓，付真真，周紅文

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210029

隨著現(xiàn)代社會(huì)生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，肥胖（obesity）的發(fā)生率不斷升高，目前肥胖及其相關(guān)并發(fā)癥已經(jīng)成為世界性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。2020年發(fā)布的《中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告》顯示，我國(guó)超重人口已達(dá)3.25億，占據(jù)成年總?cè)丝诘?0.1%，其中肥胖人群數(shù)量接近9 000萬(wàn)［1］。當(dāng)攝入能量大于消耗能量時(shí)，機(jī)體會(huì)將過(guò)剩能量轉(zhuǎn)變?yōu)橹具M(jìn)行貯存，進(jìn)而導(dǎo)致肥胖的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步根據(jù)肥胖癥患者的相關(guān)代謝指標(biāo)水平（如血糖、血壓和血脂水平等）進(jìn)行分類(lèi)，可將其分為代謝健康的肥胖患者（metabolically healthy obesity，MHO）［2-3］和代謝不健康的肥胖患者（metabolically unhealthy obesity，MUO）［4］。除生活方式和藥物干預(yù)外，減重代謝手術(shù)已成為目前治療重度肥胖及其并發(fā)癥的有效手段［5-6］。

脂肪組織作為一個(gè)復(fù)雜的內(nèi)分泌器官，除了脂肪細(xì)胞外，還包含了免疫細(xì)胞、血管基質(zhì)細(xì)胞、結(jié)締組織和神經(jīng)組織等多種成分。既往研究表明，增生肥大的脂肪組織中通常伴隨各類(lèi)免疫細(xì)胞的異常浸潤(rùn)，導(dǎo)致肥胖癥患者體內(nèi)持續(xù)的低水平慢性炎癥狀態(tài)，并影響機(jī)體的糖脂代謝能力，造成相關(guān)臨床指標(biāo)的異常改變，進(jìn)而引起相關(guān)并發(fā)癥，例如胰島素抵抗（insulin resistance，IR）［7］、心血管疾?。?-10］以及非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）［11-12］等。

根據(jù)部位的不同，脂肪組織主要分為皮下脂肪組織（subcutaneous adipose tissue，SAT）和內(nèi)臟脂肪組織（visceral adipose tissue，VAT）兩大類(lèi)。VAT 中的固有免疫細(xì)胞群與肥胖狀態(tài)下脂肪組織穩(wěn)態(tài)及低水平炎癥的調(diào)節(jié)有關(guān)，并伴有數(shù)量和功能的改變［13］。針對(duì)肥胖人群的研究證實(shí)，VAT中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)最為明顯，相關(guān)炎癥因子水平與VAT中巨噬細(xì)胞水平呈正相關(guān)，并且糖代謝受損亞組人群脂肪組織表現(xiàn)為巨噬細(xì)胞優(yōu)先向VAT浸潤(rùn)的表型［14］；另有研究顯示，VAT分布對(duì)于代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）的發(fā)生具有預(yù)測(cè)作用［15-16］，均提示VAT的異常擴(kuò)增伴隨炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)可能是影響不同肥胖個(gè)體代謝功能的關(guān)鍵因素。近期相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，特殊類(lèi)型的B細(xì)胞所產(chǎn)生的IgG可能是介導(dǎo)肥胖炎癥發(fā)展的關(guān)鍵因子，再次強(qiáng)調(diào)了免疫細(xì)胞在肥胖相關(guān)炎癥發(fā)生過(guò)程中的重要作用［17］。

本課題組前期的脂肪組織RNA-seq研究結(jié)果表明，與體重正常（lean）組相比，MHO 組及MUO 組間VAT差異表達(dá)基因富集于炎癥免疫通路［18］，從而引起思考：不同體重人群的VAT內(nèi)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況是否存在差異？其與代謝相關(guān)差異表達(dá)基因是否存在關(guān)聯(lián)？故本研究針對(duì)以上3組間VAT中各類(lèi)免疫細(xì)胞占比及變化情況進(jìn)行探究，并通過(guò)MHO組及MUO 組間差異表達(dá)的免疫細(xì)胞與RNA-seq 中差異表達(dá)的炎癥及免疫反應(yīng)通路基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，旨在評(píng)估肥胖患者代謝能力受損與各類(lèi)免疫細(xì)胞占比改變的相關(guān)性。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

收集于南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院因肥胖行代謝手術(shù)治療的48 例患者及體重和代謝指標(biāo)正常但因其他非炎癥性疾病（疝氣、膽結(jié)石及腎囊腫等）行腹腔鏡手術(shù)的11例患者的內(nèi)臟脂肪組織標(biāo)本，同時(shí)匯總了患者相關(guān)病史及臨床檢查數(shù)據(jù)。該項(xiàng)目獲得南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2016-SR-220），且所有標(biāo)本的收集均在術(shù)前獲得患者書(shū)面的知情同意。

MUO 組的定義［4］：患者體重指數(shù)（body mass index，BMI）≥28 kg/m2，且至少滿(mǎn)足以下標(biāo)準(zhǔn)中的3項(xiàng)：空腹血糖≥5.6 mmol/L，收縮壓≥130 mmHg，舒張壓≥85 mmHg，甘油三酯（triacylglycerol，TAG）＞1.7 mmol/L，高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-c）＜1.3 mmol/L（女性）或＜1.04 mmol/L（男性）。MHO 組的定義［2，19］：患 者BMI≥28 kg/m2，空腹血糖＜5.6 mmol/L，收縮壓＜130 mmHg，舒張壓＜85 mmHg，TAG＜1.7 mmol/L，且既往無(wú)高脂血癥、高血壓、糖尿病等病史。Lean組的定義：患者BMI＜28 kg/m2。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及RNA-seq測(cè)序

收集的內(nèi)臟脂肪組織標(biāo)本均通過(guò)TRIzol法提取RNA，使用Qiagen RNeasy 試劑盒純化后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、Nanodrop 及Agilent2100確認(rèn)每個(gè)樣品的RNA 質(zhì)量?；贗llumina 平臺(tái)的NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit 制備每個(gè)樣品的RNA-seq庫(kù)，并在Illumina HiSeq 4000平臺(tái)上進(jìn)行RNA-seq。

1.2.2 免疫細(xì)胞構(gòu)成比計(jì)算

利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)CIBERSORT（https：//cibersortx.stanford.edu/）［20］，對(duì)RNA-seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行基于線性支持向量回歸原理的反卷積分析，可計(jì)算獲得22種不同類(lèi)型和功能的免疫細(xì)胞在內(nèi)臟脂肪組織樣本中的占比分?jǐn)?shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 25 軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，并對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)。3組間比較應(yīng)用單因素方差分析，事后比較應(yīng)用鄧尼特t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析應(yīng)用Pearson 相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖片由GraphPad Prism 8 軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 3組人群分組情況及相關(guān)臨床指標(biāo)

首先對(duì)相關(guān)患者的代謝特征數(shù)據(jù)（如年齡、性別比、BMI 及空腹血糖等）按照分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，最終符合標(biāo)準(zhǔn)的Lean組、MHO組及MUO組入組人數(shù)分別為11例、22例及26例，其具體臨床數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 3組人群的臨床指標(biāo)Table 1 Clinical characteristics of three groups of participants（）

表1 3組人群的臨床指標(biāo)Table 1 Clinical characteristics of three groups of participants（）

HbA1c：糖化血紅蛋白；TC：總膽固醇；TAG：甘油三酯；HDL-c：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-c：低密度脂蛋白膽固醇。

2.2 3組人群內(nèi)臟脂肪組織中的免疫細(xì)胞占比情況

將3 組人群的內(nèi)臟脂肪標(biāo)本提取RNA 并進(jìn)行RNA-seq測(cè)序，利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)CIBERSORT進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，可以推算得到共22種免疫細(xì)胞在VAT中的占比情況。

與Lean 組比較，MHO 及MUO 組人群VAT 中的巨噬細(xì)胞占比變化明顯，其中以M2 型巨噬細(xì)胞表達(dá)增加為主（圖1）。

圖1 3組人群內(nèi)臟脂肪組織RNA-seq分析所得相關(guān)免疫細(xì)胞占比情況Figure 1 Proportion of immune cells in VAT among three groups from RNA-seq analysis

通過(guò)分析各類(lèi)免疫細(xì)胞在組間的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）在3 組間的比例呈依次遞減的趨勢(shì)［Lean 組（7.08±4.04）%，MHO 組（5.69±3.45）%，MUO 組（4.08±2.59）%］，且Lean組與MUO組的Treg比例存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Lean組與MUO 組比較，P=0.031，圖2A）。而被激活的自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞則在Lean 組中占比較高，為（4.53±2.80）%，在肥胖的兩組人群間比較，MUO 組被激活的NK 細(xì)胞占比有高于MHO 組的趨勢(shì)，但兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［MHO組（1.78±1.73）%，MUO 組（2.32±1.87）%，MHO 組與MUO 組比較，P=0.361，圖2B］。免疫細(xì)胞中的巨噬細(xì)胞亞群中，M1型巨噬細(xì)胞的占比在3 組間沒(méi)有明顯改變［Lean 組（0.04±0.14）%，MHO 組（0.11±0.42）%，MUO 組（0.21±0.38）%，圖2C］。M0 型巨噬細(xì)胞的占比在MUO組明顯升高，而在代謝正常的兩組間沒(méi)有明顯差 異［Lean 組（2.69 ± 4.45）%，MHO 組（3.13 ±7.46）%，MUO 組（12.00±12.79）%，Lean 組與MUO組比較，P=0.011；MHO 組與MUO 組比較，P=0.003，圖2D］。發(fā)揮抗炎作用的M2 型巨噬細(xì)胞占比的改變最為明顯，無(wú)論是MHO組還是MUO組，對(duì)比Lean組，M2 型巨噬細(xì)胞的占比都明顯增加［（Lean 組（20.63±7.72）%，MHO 組（28.54±9.76）%，MUO 組（28.51±7.19）%，Lean 組與MHO 組比較，P=0.013；Lean組與MUO組比較，P=0.011，圖2E］。

圖2 3組人群內(nèi)臟脂肪中差異表達(dá)的免疫細(xì)胞亞群Figure 2 Differentially expressed immune cell subclasses in VAT among three groups

通過(guò)分析各亞型巨噬細(xì)胞在整群巨噬細(xì)胞中的占比（圖3）發(fā)現(xiàn)，相較MHO組，MUO 組VAT 中的M2 型巨噬細(xì)胞在巨噬細(xì)胞整群中占比明顯下降［Lean 組｛88.99 ± 15.01）%，MHO 組（90.75 ±18.79）%，MUO 組（73.82±23.55）%，MHO 組與MUO組比較，P=0.012］，而促炎的M1 型巨噬細(xì)胞在巨噬細(xì)胞整群中占比則有相對(duì)升高的趨勢(shì)［Lean 組（0.14±0.46）%，MHO 組（0.27±0.92）%，MUO 組（0.46±0.86）%］，提示MUO 組內(nèi)VAT 中存在較高的炎癥水平，且這種持續(xù)慢性低炎癥水平狀態(tài)與肥胖患者代謝紊亂的發(fā)生有關(guān)。

圖3 3 組人群內(nèi)臟脂肪中M1（A）和M2 型（B）巨噬細(xì)胞在總巨噬細(xì)胞中的占比Figure 3 The proportion of M1（A）and M2（B）macrophages in total macrophages in VAT among three groups

2.3 MHO與MUO組間GPR183和C5AR1與巨噬細(xì)胞亞群水平存在相反關(guān)聯(lián)性

在既往對(duì)相關(guān)RNA-seq 數(shù)據(jù)的分析統(tǒng)計(jì)中，已經(jīng)明確了內(nèi)臟脂肪組織中存在30 余種基因在Lean組、MHO組及MUO組間皆存在差異性表達(dá)，尤其是部分炎癥通路和免疫反應(yīng)相關(guān)基因，如C5AR1、GPR183、IL1RN、ITGAX、CD300LB及MSR1等，與空腹血糖、收縮壓等代謝指標(biāo)關(guān)聯(lián)［18］，提示機(jī)體內(nèi)部炎癥反應(yīng)與代謝健康狀態(tài)具有一定相關(guān)性。利用The Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)C5AR1 等差異表達(dá)基因在脂肪組織中的單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)這些基因多數(shù)僅在以巨噬細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞中存在高表達(dá)（圖4）。

圖4 脂肪組織單細(xì)胞測(cè)序中C5AR1、GPR183、IL1RN、ITGAX、CD300LB和MSR1的表達(dá)水平Figure 4 Expression levels of C5AR1、GPR183、IL1RN、ITGAX、CD300LB and MSR1 in single-cell sequencing of adipose tissue

接著，又將已明確的31種在3組間差異表達(dá)的基因［18］與有差異的免疫細(xì)胞（Treg 細(xì)胞，激活的NK細(xì)胞，M0、M1及M2型巨噬細(xì)胞）占比進(jìn)行相關(guān)性分析（圖5）。在MHO與MUO組中，與代謝指標(biāo)無(wú)相關(guān)性的差異表達(dá)基因與巨噬細(xì)胞亞類(lèi)的關(guān)聯(lián)性相對(duì)較弱，與代謝指標(biāo)具有相關(guān)性的基因多與巨噬細(xì)胞亞類(lèi)存在較強(qiáng)關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步地對(duì)與代謝指標(biāo)相關(guān)的基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)數(shù)種基因的表達(dá)水平，如SPP1、CHIT1、ITGAX、CD300LB、IL1RN 及DCSTAMP等，與M0、M1 型巨噬細(xì)胞的占比呈正相關(guān)關(guān)系，而與M2 型巨噬細(xì)胞的占比大多數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。但MHO 與MUO 兩組間的不同之處在于C5a受體1（Complement fragment 5a receptor 1，C5AR1）與G 蛋白偶聯(lián)受體183（G-protein coupled receptor 183，GPR183）基因與巨噬細(xì)胞亞型的關(guān)聯(lián)性，這兩種基因在MHO 組中表現(xiàn)為與M0 及M1 型巨噬細(xì)胞占比正相關(guān)，與M2型巨噬細(xì)胞占比負(fù)相關(guān)；在MUO組中則呈現(xiàn)相反的關(guān)聯(lián)性。

圖5 3組人群中免疫反應(yīng)及炎癥通路基因表達(dá)與免疫細(xì)胞比例的相關(guān)性分析Figure 5 The correlation of gene expression of immune response and inflammation and proportion of immune cells among three groups

3 討論

結(jié)果證明，相較體重正常組，兩組肥胖患者的巨噬細(xì)胞整體表達(dá)水平都明顯提高；同時(shí)在兩組肥胖患者間比較巨噬細(xì)胞亞群的整體占比，抗炎的M2型巨噬細(xì)胞的比例在MUO 組中較MHO 組下降，提示代謝異常的肥胖患者體內(nèi)的炎癥水平相對(duì)更高。造成這種改變的具體機(jī)制為肥胖時(shí)增生的脂肪組織通過(guò)釋放白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）等炎癥因子和細(xì)胞因子，激活并募集以巨噬細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞［21-22］，成為病理性免疫反應(yīng)的激活部位，表現(xiàn)為肥胖機(jī)體內(nèi)的慢性持續(xù)性低水平炎癥狀態(tài)，最終導(dǎo)致機(jī)體代謝水平改變。

除了巨噬細(xì)胞亞群外，Treg表達(dá)水平在MUO組中下降明顯。Treg主要在免疫反應(yīng)中調(diào)節(jié)效應(yīng)性T細(xì)胞和B 細(xì)胞的作用以維持免疫穩(wěn)態(tài)，同時(shí)也通過(guò)分泌細(xì)胞因子白介素-10（interleukin-10，IL-10）等參與抗炎調(diào)節(jié)［23］。Treg被證明與促炎型巨噬細(xì)胞存在拮抗作用并可改善胰島素抵抗［24-26］，故肥胖狀態(tài)下Treg數(shù)量與功能下調(diào)與代謝紊亂的發(fā)生較為相關(guān)。

在激活的NK細(xì)胞分組中，MUO組相較MHO組的細(xì)胞占比有上升趨勢(shì)。NK細(xì)胞與巨噬細(xì)胞在功能上存在雙向調(diào)節(jié)作用［27］，并且Lee等［28］的動(dòng)物研究證明，在肥胖狀態(tài)下NK細(xì)胞能夠調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向促炎方向極化，從而引起胰島素抵抗等代謝狀態(tài)紊亂的發(fā)生。但本研究中，激活的NK細(xì)胞水平在體重正常的對(duì)照組較肥胖組別更高，可能是由于部分體重正常的對(duì)照者術(shù)中取材部位源自于腫塊周邊的脂肪組織，進(jìn)而引起了激活的NK細(xì)胞水平表達(dá)差異。

在前期研究中發(fā)現(xiàn)，3 組間的差異表達(dá)基因主要集中于免疫反應(yīng)與炎癥通路，其中部分基因與代謝參數(shù)相關(guān)［18］，且多數(shù)僅在脂肪組織的巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞中高表達(dá)。繼續(xù)對(duì)肥胖狀態(tài)下上調(diào)的炎癥通路基因與VAT 中差異表達(dá)的免疫細(xì)胞占比進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析驗(yàn)證，結(jié)果提示肥胖組中SPP1、CHIT1、ITGAX、CD300LB、IL1RN 及DCSTAMP 等差異表達(dá)基因與VAT中發(fā)揮促炎作用的M1型巨噬細(xì)胞占比正相關(guān)，與發(fā)揮抗炎作用的M2 型巨噬細(xì)胞占比負(fù)相關(guān)，再次印證了肥胖個(gè)體VAT中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增加，進(jìn)而導(dǎo)致組織內(nèi)高炎癥水平狀態(tài)。

與此同時(shí)，C5AR1 及GPR183 作為同樣在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)并且與代謝指標(biāo)相關(guān)的差異表達(dá)基因，在MHO與MUO組間，對(duì)二者與VAT中巨噬細(xì)胞占比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)卻表現(xiàn)出了相反的相關(guān)性，這種相反的趨勢(shì)提示我們思考：這兩種基因是否存在作為預(yù)測(cè)肥胖患者代謝狀態(tài)改變的相關(guān)因子的可能性？

C5AR1 為補(bǔ)體C5a 的對(duì)應(yīng)受體，可以激活多條重要信號(hào)通路途徑以正向調(diào)控炎癥反應(yīng)［29-31］。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠模型的脂肪組織中C5AR1的表達(dá)水平明顯升高；全身敲除C5AR1的小鼠在高脂喂養(yǎng)的條件下與對(duì)照組相比胰島素敏感性得到改善，這可能與敲除C5AR1后脂肪組織中M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量減少及抗炎因子IL-10的表達(dá)增加有關(guān)［32］。在高脂飲食誘導(dǎo)下，全身敲除C5AR1的小鼠性腺脂肪及腹股溝脂肪質(zhì)量較野生型小鼠明顯減少，伴隨更高的餐后脂質(zhì)清除率和較低的血漿甘油三酯及游離脂肪酸水平，該過(guò)程可能與C5AR1及C5AR 樣受體（C5aR-like receptor 2，C5L2）具有互作關(guān)系并形成異二聚體有關(guān)［33-34］。

GPR183 作為在多種免疫細(xì)胞表面表達(dá)的一種G 蛋白偶聯(lián)受體，與免疫反應(yīng)的激活與免疫細(xì)胞的遷移定位有直接關(guān)系［35］。Copperi 等［36］最新研究發(fā)現(xiàn)，GPR183 在棕色脂肪組織（brown adipose tissue，BAT）中高表達(dá)，通過(guò)應(yīng)用其內(nèi)源性配體7α，25-二羥基膽固醇（7α，25-dihydroxycholestero）可以激活BAT中的GPR183 從而抑制BAT 產(chǎn)熱功能，降低能量消耗，但GPR183在白色脂肪組織（white adipose tissue，WAT）中發(fā)揮何種作用尚未明確。故C5AR1 和GPR183 確可影響脂肪組織功能，但這二者在脂肪組織擴(kuò)增過(guò)程中是如何引起機(jī)體代謝能力改變的，其具體機(jī)制仍需要更深入的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上，本文通過(guò)RNA-seq 技術(shù)分析了正常體重者與不同代謝狀態(tài)的肥胖癥患者的VAT 中各型免疫細(xì)胞占比變化與部分免疫反應(yīng)通路基因的關(guān)聯(lián)性，再次驗(yàn)證了代謝正常及異常的肥胖患者內(nèi)臟脂肪組織中免疫細(xì)胞亞類(lèi)的構(gòu)成變化情況，并且分析得到C5AR1及GPR183基因與肥胖患者巨噬細(xì)胞亞群占比及代謝狀態(tài)變化有關(guān)，具有作為預(yù)測(cè)肥胖代謝狀態(tài)生物學(xué)因子的潛能。