孟慶余，高永靜

G 蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptor，GPCR）是一類 7-次跨膜蛋白，參與介導(dǎo)多種重要的生理功能，是暢銷藥物中占比最高和最成功的靶點(diǎn)之一。幾十年來，靶向GPCR 的藥物研發(fā)一直是學(xué)術(shù)界和制藥界的熱門焦點(diǎn)，這些已發(fā)現(xiàn)并批準(zhǔn)使用的 GPCR 藥物為多種人類疾病的治療提供了可能性，包括癌癥、病毒感染、炎癥性疾病和代謝性疾病等，例如艾塞那肽、利拉魯肽、利西拉肽和阿比魯肽等靶向胰高血糖素樣肽 1 受體的肽類藥物已用于 2 型糖尿病的治療[1]；靶向鈣敏感受體的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑西那卡塞已批準(zhǔn)用于甲狀旁腺功能亢進(jìn)治療[2]。

目前，一些基于熒光或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的功能性分析試劑盒已商品化，便于 GPCR 藥物篩選開發(fā)。然而，就研發(fā)新藥而言，現(xiàn)有技術(shù)的高投資和低產(chǎn)出的矛盾凸顯出對(duì)更高效的藥物篩選方法的需求。傳統(tǒng)的 GPCR 藥物篩選技術(shù)通常是基于放射性的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析，不僅價(jià)格昂貴而且有害健康。目前，盡管已經(jīng)有多種靶向 GPCR 藥物開發(fā)成功的案例，但是該類藥物多數(shù)仍呈現(xiàn)出一定的毒副作用，并且尚有超過 100 種孤兒 GPCRs（oGPCRs）的配體未知。因此，開發(fā)新的靶向 GPCR 的藥物需要更經(jīng)濟(jì)高效的藥物篩選方法，這無疑是未來藥物發(fā)現(xiàn)工作的新挑戰(zhàn)。在過去幾十年中，為了發(fā)現(xiàn)更精準(zhǔn)和全面的 GPCR 靶向藥物，人們一直致力于開發(fā)基于細(xì)胞水平的信號(hào)依賴性的分析方法，這些策略的開發(fā)為藥物發(fā)現(xiàn)提供了重要平臺(tái)。近年來，由于受體藥理學(xué)的進(jìn)展、結(jié)構(gòu)生物學(xué)的突破和生物技術(shù)的創(chuàng)新，GPCR藥物發(fā)現(xiàn)的新途徑相繼出現(xiàn)，包括高內(nèi)涵成像技術(shù)、3D 晶體學(xué)藥理分析技術(shù)以及虛擬篩選等。在多種靶向 GPCR 藥物高通量篩選（high throughput screening，HTS）的技術(shù)中選擇合理的篩選策略對(duì)于獲得高效、高特異性和低毒性的靶向藥物至關(guān)重要。

本綜述總結(jié)了使用最廣泛的 GPCR 檢測(cè)方法及其優(yōu)缺點(diǎn)以及用于 GPCR 藥物發(fā)現(xiàn)的 HTS 技術(shù)的最新進(jìn)展。

1 GPCRs 及其信號(hào)通路

GPCRs 也稱為 7-次跨膜螺旋（7TM）受體，是人類膜蛋白中一類最大的受體超家族，大約 800 個(gè)成員，可感知包括光、氣味、味道、激素和神經(jīng)遞質(zhì)在內(nèi)的多種細(xì)胞外信號(hào)[3]，在生理學(xué)和病理學(xué)方面發(fā)揮關(guān)鍵的功能。研究表明，大約 40% 的臨床批準(zhǔn)藥物靶向 GPCRs[4]。因此，了解GPCR 的信號(hào)機(jī)制對(duì)于更好地開發(fā) GPCR 靶向藥物至關(guān)重要。

GPCR 通過與異源三聚體鳥嘌呤核苷酸結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白（G 蛋白）偶聯(lián)[5]。異源三聚體 G 蛋白由 α、β 和 γ 亞基組成，在基礎(chǔ)狀態(tài)下，Gα 被二磷酸鳥苷（GDP）占據(jù)，激動(dòng)劑激活受體后，導(dǎo)致 GDP 與三磷酸鳥苷（GTP）交換，隨后 Gα 亞單位與 Gβγ 亞單位分離，分別與下游效應(yīng)蛋白相互作用，繼而引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，完成跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]。根據(jù)其下游功能和序列，Gα 亞基分為四個(gè)家族：Gαs（Gαs和 Gαolf）、Gαi/o（Gαi1、Gαi2、Gαi3、Gαo、Gαt1、Gαt2、Gαt3 和 Gαz）、Gαq/11（Gαq、Gα11、Gα14 和 Gα16）和Gα12/13（Gα12 和 Gα13）[7]（圖1）。一個(gè)受體可與多個(gè)G 蛋白亞型偶聯(lián)。

圖1 GPCRs 偶聯(lián)不同類型 G 蛋白信號(hào)通路示意圖（Gα 亞基可分為 Gαs、Gαi/o、Gαq/11 和 Gα12/13，在配體結(jié)合后，GPCR 改變其構(gòu)象并激活偶聯(lián)的 G 蛋白，隨后通過下游效應(yīng)器促進(jìn)相應(yīng)第二信使和報(bào)告基因的產(chǎn)生。圖中紅色字體表示常用 HTS 分析的檢測(cè)點(diǎn)，包括 cAMP 檢測(cè)、Ca2+ 通道檢測(cè)和報(bào)告基因分析）

GPCR 的典型信號(hào)通路是通過激活位于細(xì)胞表面的受體，將細(xì)胞外化學(xué)信號(hào)傳遞到胞內(nèi)。目前的研究表明，GPCRs主要通過兩條途徑介導(dǎo)和調(diào)節(jié)生理功能：G 蛋白途徑和β-arrestin 途徑。傳統(tǒng) GPCR 激動(dòng)劑與受體結(jié)合后激活 G蛋白信號(hào)通路，而 β-arrestin 偏好配體則主要激活β-arrestin 通路[8-9]。Gαs 和 Gαi/o 蛋白偶聯(lián)信號(hào)通路作用于腺苷酸環(huán)化酶（AC）從而催化 ATP 轉(zhuǎn)化為環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）。與 Gαs 蛋白偶聯(lián)的受體直接激活該過程，促進(jìn) cAMP 的產(chǎn)生；而與 Gαi/o蛋白偶聯(lián)的受體則抑制 AC 產(chǎn)生 cAMP。因此，與 Gαs 結(jié)合的 GPCR 可以抵消與 Gαi/o 結(jié)合的 GPCR 產(chǎn)生的效應(yīng)，反之亦然。細(xì)胞質(zhì)中 cAMP 的含量對(duì)生理病理?xiàng)l件下的多種離子通道的開放和絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶 A（PKA）家族成員的激活狀態(tài)起著關(guān)鍵的作用。cAMP 被認(rèn)為是第二信使，PKA 是第二效應(yīng)器[10-11]。Gαq/11 通路的效應(yīng)物是磷脂酶 C-β（PLCβ），它催化膜結(jié)合的 4,5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）裂解為 1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）和二?；视停―AG），IP3 作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）膜上的 IP3 受體，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放 Ca2+，而 DAG 沿質(zhì)膜擴(kuò)散并激活膜的絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶 C（PKC）結(jié)合部分[12-14]。

β-arrestin 是細(xì)胞中重要的調(diào)節(jié)蛋白，包括 β-arrestin 1和 β-arrestin 2，在持續(xù)激動(dòng)劑刺激的情況下，GPCR 被特異性 GPCR 激酶（G protein-coupled receptor kinases，GRK）磷酸化，β-arrestins 招募到磷酸化 GPCR 使受體與 G 蛋白解偶聯(lián)，并將受體靶向網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞囊泡，最終終止 G蛋白信號(hào)傳導(dǎo)[15]。β-arrestin 募集是一種普遍存在的 GPCR信號(hào)負(fù)調(diào)控機(jī)制，在幾乎所有 GPCR 通路中已經(jīng)得到證實(shí)[16]，并且該途徑是 G 蛋白非依賴性的，可以通過偏倚配體獨(dú)立地進(jìn)行藥理學(xué)調(diào)節(jié)[17]，這可能為 GPCR 信號(hào)的功能選擇性（偏倚激活）以及 GPCR 藥物開發(fā)提供了一種新的、通用的、與 G 蛋白無關(guān)的方法。這種分析對(duì)于篩選 Gαi 偶聯(lián)的 GPCR 和孤兒 GPCR 特別有利。此外，β-arrestins 不僅可以阻斷 G 蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而且在 GPCRs 的脫敏、內(nèi)化、復(fù)合致敏、細(xì)胞增殖反應(yīng)和基因轉(zhuǎn)錄等方面都發(fā)揮重要作用[8,18]。

除了上述作用途徑，GPCR 可以從細(xì)胞內(nèi)部或在內(nèi)化過程中的任意時(shí)間段內(nèi)發(fā)出傳遞信號(hào)[18-19]。原則上，通過改變配體的物理化學(xué)性質(zhì)，可以改變其在細(xì)胞上和細(xì)胞內(nèi)的分布[20]。是否可以通過藥物干預(yù)來控制內(nèi)化和再循環(huán)/降解的速度還有待研究。

2 GPCRs 藥物篩選技術(shù)發(fā)展歷程及功能分析平臺(tái)

鑒于 GPCR 在正常生理狀態(tài)和疾病中的重要性，以及它們通過使用小分子作為調(diào)節(jié)因子進(jìn)行治療干預(yù)的潛力，GPCR 是目前市場(chǎng)上最大的藥物治療靶點(diǎn)家族，每年的利潤(rùn)在數(shù)十億美元[21]。然而現(xiàn)有的藥物篩選技術(shù)仍然不同程度地限制了 GPCR 靶點(diǎn)藥物的開發(fā)，因此，GPCR 相關(guān)檢測(cè)方法和配體的篩選一直處于研究和發(fā)展階段。GPCR 高通量藥物篩選技術(shù)的發(fā)展歷程主要包括傳統(tǒng)的經(jīng)典途徑和近年來發(fā)現(xiàn)的新途徑。傳統(tǒng)的經(jīng)典靶向通路涉及機(jī)制較單一，測(cè)量方法局限于一維層面。最早應(yīng)用于 GPCR 藥物研究的方法是放射性配基結(jié)合技術(shù)。1970年，Lefkowitz 等[22]使用放射性標(biāo)記的激素進(jìn)行了第一次放射性配基結(jié)合實(shí)驗(yàn)，以確定其受體的結(jié)合親和力。從那時(shí)起，3H 或125I 標(biāo)記的配體開始廣泛用于表征化合物對(duì)靶 GPCR 的親和力。然而由于放射性配基標(biāo)記繁雜、價(jià)格昂貴、并且需要復(fù)雜的清洗和過濾步驟，導(dǎo)致了其他替代技術(shù)的產(chǎn)生，包括依賴于檢測(cè)G 蛋白介導(dǎo)的第二信使的經(jīng)典途徑，例如 cAMP 檢測(cè)技術(shù)、基于鈣流的熒光成像讀片器（fluorometric imaging plate reader，F(xiàn)LIPR）技術(shù)、基于共振能量轉(zhuǎn)移的福斯特?zé)晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移（f?rster resonance energy transfer，F(xiàn)RET）和生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（bioluminescence resonance energy transfer，BRET）技術(shù)，以及 G 蛋白非依賴性檢測(cè)途徑——β-arrestin 的募集實(shí)驗(yàn)等。此外，對(duì)相關(guān)報(bào)告基因的檢測(cè)也已廣泛使用[23]。這些基于熒光或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的功能性分析試劑盒可以從公司購(gòu)買。

為使篩選方法更可行、篩選結(jié)果更準(zhǔn)確，GPCR 藥物篩選技術(shù)的新方法正在逐步更新和開發(fā)，并且用于 GPCR的藥物篩選工具也更加先進(jìn)。近年來，出現(xiàn)了多種 GPCR藥物開發(fā)的新途徑，包括熒光素酶雙亞基系統(tǒng)、高內(nèi)涵篩選技術(shù)、無標(biāo)簽全細(xì)胞分析技術(shù)以及虛擬篩選等（表1）。

表1 GPCR 篩選技術(shù)總結(jié)

2.1 cAMP 檢測(cè)法

cAMP 由 ATP 生成，是介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)、激素和藥物參與多種生理反應(yīng)的最重要的第二信使之一，也是 GPCR 藥物研發(fā)途徑中的重要一環(huán)。如前所述，與 Gαs 和 Gαi/o 蛋白偶聯(lián)的 GPCR 分別激活或抑制腺苷酸環(huán)化酶，從而增加或降低 cAMP 水平。

cAMP 水平通常使用競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)量，例如 LANCE cAMP和 HTRF-cAMP 檢測(cè)試劑盒。LANCE cAMP 試劑盒是一種均相時(shí)間分辨熒光能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）免疫測(cè)定法。該測(cè)定基于銪標(biāo)記的 cAMP 示蹤劑復(fù)合物和樣品 cAMP 競(jìng)爭(zhēng) Alexa Fluor 647 染料標(biāo)記的 cAMP 特異性抗體上的結(jié)合位點(diǎn)。銪標(biāo)記的 cAMP 示蹤劑復(fù)合物是由生物素化-cAMP和 Eu-鏈霉親和素之間的緊密相互作用形成的。當(dāng)抗體與Eu-鏈霉親和素/生物素-cAMP 示蹤劑結(jié)合時(shí)，340 nm 的光脈沖激發(fā)示蹤劑的銪螯合物分子，導(dǎo)致能量轉(zhuǎn)移到熒光團(tuán)，熒光團(tuán)可在 665 nm 處發(fā)光。因此，測(cè)試樣本中的 cAMP水平越高，競(jìng)爭(zhēng)水平越高，發(fā)出的信號(hào)越低，反之亦然（圖2）[24-25]。HTRF-cAMP 的檢測(cè)原理是基于均相時(shí)間分辨熒光（homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF）技術(shù)，該方法是由細(xì)胞產(chǎn)生的天然 cAMP 與修飾的別藻藍(lán)蛋白染料標(biāo)記的 cAMP 之間的競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定。cAMP 檢測(cè)法可用于高通量藥物發(fā)現(xiàn)，靈敏度高，但受限于需要清楚偶聯(lián)機(jī)制，不利于篩選 oGPCR 的激動(dòng)劑或拮抗劑。在cAMP 分析中，篩查 Gs 偶聯(lián)受體通常較簡(jiǎn)單，而篩查 Gi/o偶聯(lián)受體則困難得多。

圖2 LANCE cAMP 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定原理[A：在胞內(nèi)待測(cè) cAMP 不充足的情況下，Eu 標(biāo)記的 cAMP 探針與抗 cAMP 特異性抗體結(jié)合，340 nm 的光脈沖激發(fā)示蹤劑的銪螯合物分子，導(dǎo)致能量轉(zhuǎn)移到熒光團(tuán)，熒光團(tuán)可在 665 nm 處產(chǎn)生熒光信號(hào)；B：隨著游離 cAMP（細(xì)胞 cAMP）濃度的增加，測(cè)試樣本中的 cAMP 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 cAMP 特異性抗體，導(dǎo)致熒光信號(hào)減弱]

此外，21 世紀(jì)初，BD Biosciences 有限公司開發(fā)了ACTOne 檢測(cè)法，這是一種可以實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) cAMP 水平變化的技術(shù)，該分析可以高通量進(jìn)行，無需細(xì)胞裂解步驟，這種檢測(cè)基于含專有外源性環(huán)核苷酸門控（CNG）通道的細(xì)胞系，可以對(duì)細(xì)胞內(nèi) cAMP 水平進(jìn)行終點(diǎn)和動(dòng)力學(xué)測(cè)量，并已成功用于測(cè)量 Gs 和 Gi 偶聯(lián) GPCR 活性[26]。

2.2 基于細(xì)胞內(nèi) Ca2+ 檢測(cè)法

在 GPCR 信號(hào)通路中，細(xì)胞內(nèi) Ca2+是 GPCR 信號(hào)傳導(dǎo)的另一個(gè)第二信使。該方法是基于 G 蛋白偶聯(lián) GPCR信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞內(nèi) Ca2+熒光進(jìn)行定量分析[27]。用于測(cè)量細(xì)胞中 Ca2+通量的 FLIPR 是 20 世紀(jì) 90年代早期的一項(xiàng)重要發(fā)明，在高通量藥物發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮了重要作用。該法主要用于分析 Gq 偶聯(lián)的 GPCR，但也可以通過嵌合 G 蛋白或混雜 G 蛋白的表達(dá)來檢測(cè) Gαi/o、Gαs 或 Gα12 偶聯(lián)的GPCR[28-30]。

自從 Tsien 及其同事在 1989年開發(fā)出熒光鈣指示劑fluo-3 以來，基于熒光的細(xì)胞內(nèi)鈣測(cè)定已變得越來越流行[31]，相繼開發(fā)出了 fluo-3 類似物 fluo-4。Fluo-4 由 Ca2+螯合劑和熒光素類似物組成，一旦與 Ca2+結(jié)合，熒光團(tuán)的電子性質(zhì)和光譜性質(zhì)就會(huì)發(fā)生改變，即可檢測(cè)到熒光[30]。為增加其細(xì)胞膜滲透性，fluo-4 以 fluo-4-AM（乙酰氧基甲基酯）的形式施用于細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞后 fluo-4-AM 被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解，導(dǎo)致細(xì)胞膜不可滲透性負(fù)電荷形式 fluo-45-的產(chǎn)生，fluo-45-與胞內(nèi) Ca2+結(jié)合從而能夠檢測(cè)到發(fā)光信號(hào)。然而一些細(xì)胞會(huì)表達(dá)某種有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，這會(huì)導(dǎo)致帶負(fù)電的 fluo-45-的丟失，從而導(dǎo)致信號(hào)降低，這種現(xiàn)象可以通過向細(xì)胞中添加丙磺舒（一種轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑）來防止（圖3）。

圖3 基于熒光鈣結(jié)合染料 fluo-4 的細(xì)胞內(nèi)鈣測(cè)定原理

Ca2+測(cè)定是活細(xì)胞的功能測(cè)定，也可用于高通量藥物篩選。這種方法可以用于檢測(cè)激動(dòng)劑、拮抗劑和變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，然而由于熒光很容易受到化合物的干擾，因此該法不利于反向激動(dòng)劑和慢結(jié)合激動(dòng)劑的篩選。

2.3 報(bào)告基因分析法

報(bào)告基因分析為篩選 GPCR 靶點(diǎn)提供了另一個(gè)穩(wěn)健且經(jīng)濟(jì)高效的高通量同質(zhì)分析平臺(tái)。GPCR 激活后通過第二信使的響應(yīng)元件改變基因轉(zhuǎn)錄。GPCR 的激活導(dǎo)致 G 蛋白 α 亞基與 βγ 二聚體亞基解離，進(jìn)而啟動(dòng)下游第二信使通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并最終通過 cAMP 反應(yīng)元件（CRE）、活化 T 細(xì)胞核因子響應(yīng)元件（NFAT-RE）、血清響應(yīng)元件（SRE）和血清反應(yīng)因子響應(yīng)元件（SRF-RE）等各種反應(yīng)元件誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄[32-33]（圖1）。常用的報(bào)告基因包括熒光素酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-內(nèi)酰胺酶和多種熒光蛋白。熒光素酶通常是首選的報(bào)告基因。例如，通過使用位于熒光素酶基因上游的 T 細(xì)胞反應(yīng)元件（NFAT-RE）監(jiān)測(cè)與 Gq 蛋白偶聯(lián)的受體的活性。受體的激活導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加，進(jìn)而激活蛋白激酶 C 使 NFAT-RE 結(jié)合蛋白磷酸化。當(dāng)磷酸化的 NFAT-RE 結(jié)合蛋白與 NFAT-RE 序列結(jié)合時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的熒光素酶濃度會(huì)增加，從而導(dǎo)致熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄率增加。該平臺(tái)屬于均相測(cè)定，需要較長(zhǎng)的孵育時(shí)間，并且測(cè)量的信號(hào)事件遠(yuǎn)離受體激活時(shí)間，這可能會(huì)導(dǎo)致大量假陽性，并且該法受限于需要了解耦合機(jī)制，因此不利于對(duì)孤兒 GPCR 的篩查。

2.4 共振能量轉(zhuǎn)移檢測(cè)法

共振能量轉(zhuǎn)移（resonance energy transfer，RET）是一種光物理過程，通過熒光供體將能量轉(zhuǎn)移到合適的熒光能量受體而檢測(cè)發(fā)光信號(hào)，它們?cè)诿枋龌罴?xì)胞中的 GPCR 激活和信號(hào)通路方面非常有價(jià)值。根據(jù)標(biāo)簽的不同，RET 傳感器可分為FRET 和 BRET[34-35]。FRET 的原理是熒光共振能量轉(zhuǎn)移，當(dāng)供體和受體彼此非常接近時(shí)，光子可以從一個(gè)受激發(fā)的熒光團(tuán)（供體）轉(zhuǎn)移到另一個(gè)熒光團(tuán)（受體）并使后者發(fā)光[36]。BRET 通常是基于發(fā)光酶——熒光素酶進(jìn)行生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（圖4）[37]。例如，G 蛋白 α（能量供體）和 γ（能量受體）亞單位可以用相應(yīng)的熒光蛋白標(biāo)記，GPCR 激活后即可獲得 BRET 信號(hào)[38-39]。BRET 已被用于研究融合到腎素?zé)晒馑孛福≧lu）的 GPCR 與融合到GFP 的細(xì)胞質(zhì)支架蛋白 β-arrestin 的相互作用，以及識(shí)別GPCR 的偏倚效應(yīng)、變構(gòu)和多譜關(guān)聯(lián)[40]。

圖4 FRET 和 BRET 檢測(cè)兩種蛋白質(zhì)之間的能量轉(zhuǎn)移[A：FRET 中有兩個(gè)熒光團(tuán)，當(dāng)供體和受體彼此靠近時(shí)，激光激發(fā)能量供體熒光團(tuán)，光子從該供體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)熒光團(tuán)（受體）并使后者發(fā)光；B：BRET 中當(dāng)兩個(gè)熒光團(tuán)靠近時(shí)，熒光素酶（供體）與底物反應(yīng)發(fā)出的熒光可以激發(fā)受體上的 GFP 熒光團(tuán)，GFP 隨后發(fā)出更高波長(zhǎng)的可檢測(cè)信號(hào)。其中 FRET 需要外部激光激發(fā)，而 BRET 是采用生物發(fā)光]

根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體情況，RET 傳感器可以根據(jù)標(biāo)記單位的不同分為幾種表達(dá)方式，如 GPCR/G 蛋白信號(hào)功能測(cè)定、GPCR/β-arrestin 信號(hào)功能測(cè)定[41]、分子內(nèi)構(gòu)象 GPCR傳感器和分子內(nèi)構(gòu)象 GPCR 二聚化傳感器[42]。FRET 和BRET 的實(shí)際應(yīng)用取決于具體的實(shí)驗(yàn)情況，F(xiàn)RET 測(cè)定提供了更高的空間和時(shí)間分辨率，熒光探針的高度多樣性提供了廣泛的探針對(duì)，但是這種技術(shù)需要外部光源來激發(fā)供體，并且高背景會(huì)導(dǎo)致信噪比降低。相比之下，BRET 檢測(cè)是基于酶促反應(yīng)，不需要額外的激發(fā)光，更容易量化結(jié)果[36]。

2.5 G 蛋白非依賴的 β-arrestin 招募法

基于 β-arrestin 的分析方法是一種不依賴于 G 蛋白的測(cè)定方法，特別適用于 oGPCR 的分析和篩選。研究發(fā)現(xiàn)，有些 GPCRs 的配體在激活信號(hào)通路時(shí)呈現(xiàn)出一種“不平衡效應(yīng)”，它們能夠誘導(dǎo)受體選擇性地偶聯(lián)不同類型的 G 蛋白亞基或與非 G 蛋白調(diào)控因子 β-arrestin 直接作用[43-45]，從而使胞內(nèi)的信號(hào)偏向某一通路，這種配體稱為“偏向性配體”或“偏倚配體”[17]。因此針對(duì)一種 G 蛋白的特殊信號(hào)通路的功能性藥物篩選分析可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)這種偏倚配體的忽略。此外，通過異源二聚體的受體串?dāng)_可使受體信號(hào)通路更加復(fù)雜[46]。

最近開發(fā)了多種基于 β-arrestin 招募的藥物篩選分析方法，可以通過聯(lián)合 BRET、PathHunterTM技術(shù)和 TangoTM技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。BRET 是最早用于監(jiān)測(cè) GPCR-β-arrestin 相互作用的分析方法之一[47]，該技術(shù)的分析原理是將 GPCR的 C 端和 β-arrestin 分別用海腎熒光素酶（RLuc）和熒光蛋白標(biāo)簽（eGFP2、GFP10 或 YFP）標(biāo)記[48]，當(dāng) β-arrestin被招募時(shí)，這兩個(gè)標(biāo)簽彼此非常接近，RLuc 反應(yīng)發(fā)出的光激發(fā)熒光蛋白，然后熒光蛋白發(fā)出更高波長(zhǎng)的用于信號(hào)檢測(cè)（圖5A）。BRET 已應(yīng)用于包括趨化因子、阿片類、多巴胺和前列腺素受體等在內(nèi)的 GPCR 靶向藥物篩選[49-50]。在PathHunterTM檢測(cè)中，β-arrestin 與無催化活性的 β-半乳糖苷酶缺失突變體融合，在 GPCR 的 C 端用 β-半乳糖苷酶N 端缺失序列的另一個(gè)小片段標(biāo)記，GPCR-β-arrestin 相互作用后，β-半乳糖苷酶的兩個(gè)部分緊密靠近而活化，導(dǎo)致底物裂解并產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)（圖5B）[51]。

圖5 β-arrestin 招募分析（A：BRET 實(shí)驗(yàn)；B：PathHunterTM 實(shí)驗(yàn)）

2.6 NanoBiT 熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)

最近，熒光素酶雙亞基系統(tǒng)新技術(shù)開發(fā)成功。NanoLuc二元技術(shù)（NanoBiT）包括一個(gè) 18 kD 的大亞基片段 LgBiT和一個(gè) 1.3 kD 的小亞基片段 SmBiT，該系統(tǒng)可用于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的檢測(cè)。LgBiT 和 SmBiT 亞基分別與靶蛋白融合[52]，這兩個(gè)亞基之間的內(nèi)在親和力極低（Kd= 190 μmol/L），當(dāng)目的蛋白表達(dá)時(shí)，蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interactions，PPI）使兩個(gè)亞基靠近而形成一種功能性酶，進(jìn)而能夠催化底物產(chǎn)生明亮的發(fā)光信號(hào)[53-54]。在 NanoBiT 系統(tǒng)的開發(fā)中，鑒定出另一種不同于SmBiT 的小互補(bǔ)肽-HiBiT，它是一個(gè)僅有 11 個(gè)氨基酸的序列，對(duì) LgBiT 具有非常高的親和力（Kd= 700 pmol/L)。由于 LgBiT 是細(xì)胞不可滲透的，因此 HiBiT-LgBiT 互補(bǔ)系統(tǒng)提供了一種區(qū)分內(nèi)化蛋白質(zhì)和保留在細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)的方法（圖6）。

圖6 NanoBiT 熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)[A：蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用檢測(cè)（將目的蛋白 A 和 B 分別與 LgBiT 和 SmBiT 融合，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。融合蛋白的相互作用導(dǎo)致 LgBiT 與 SmBiT 的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)，形成可產(chǎn)生明亮發(fā)光信號(hào)的有功能的酶）；B：Nano-Glo HiBiT 細(xì)胞外檢測(cè)系統(tǒng)（將目的蛋白標(biāo)記 HiBiT 標(biāo)簽并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，當(dāng)外源性加入 LgBiT 蛋白和底物后，兩者結(jié)合形成復(fù)合物產(chǎn)生明亮的發(fā)光酶，通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度，可判斷細(xì)胞膜表面或分泌到胞質(zhì)的 HiBiT 標(biāo)記的目的蛋白量）]

NLuc 系統(tǒng)用途廣泛，已用于生物醫(yī)學(xué)研究的若干領(lǐng)域，包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、遺傳調(diào)節(jié)和細(xì)胞信號(hào)、監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和分子成像等。據(jù)報(bào)道，NLuc 已經(jīng)成功地監(jiān)測(cè)了 G 蛋白偶聯(lián)松弛素家族肽受體（RXFP3）的內(nèi)化，通過在 HEK 293T 細(xì)胞中表達(dá) NLuc 標(biāo)記的 RXFP3，利用生物發(fā)光來量化檢測(cè)結(jié)果[55]。此外，已有研究通過基因組編輯技術(shù)將 HiBiT 標(biāo)簽標(biāo)記到程序性死亡配體 1（PD-L1）的 C 端，并在肺腺癌細(xì)胞系 PC9-KI 中，用藥物篩選鑒定調(diào)節(jié) PD-L1 表達(dá)的化合物[56]。

NLuc 技術(shù)與其他系統(tǒng)相比具有多種優(yōu)點(diǎn)。首先，它將成為更準(zhǔn)確的 PPI 生物學(xué)模型。LgBiT 和SmBiT 都是較小的蛋白標(biāo)記物，對(duì)目標(biāo)蛋白的構(gòu)象干擾極微弱。第二，NanoBiT 具有更高的靈敏度和信噪比[57-58]。第三，由于LgBiT 和 SmBiT 之間的相互作用是可逆的，該系統(tǒng)還可用于檢測(cè)結(jié)合后快速分離的蛋白質(zhì)。第四，NanoBiT 檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，無需特定過濾器或進(jìn)樣器，用普通發(fā)光檢測(cè)器即可檢測(cè)，并且試劑穩(wěn)定性高。第五，該法可調(diào)節(jié)放大測(cè)試通量，適用于 96 孔、384 孔和 1536 孔板的高通量檢測(cè)，以用于藥物開發(fā)[59-60]。此外，該方法不受特定 G 蛋白類型的限制，可用于篩選 Gαs 和 Gαi/o 以及任何其他相偶聯(lián)的 G 蛋白亞家族。

2.7 其他新興藥物篩選技術(shù)

近年來，通過高分辨率熒光顯微鏡和自動(dòng)圖像分析使GPCR 可視化的高內(nèi)涵篩選（high-content screening，HCS）成為另一種重要的藥物篩選分析方法[61-62]。HCS 主要用于細(xì)胞毒性、受體調(diào)節(jié)劑和活性物質(zhì)釋放等影響細(xì)胞功能方面的研究。在藥物篩選方面，HCS 也發(fā)揮了重要作用。與傳統(tǒng)的細(xì)胞分析法相比，HCS 可以識(shí)別每個(gè)細(xì)胞中的個(gè)體反應(yīng)，從而獲得細(xì)胞周期階段、細(xì)胞轉(zhuǎn)染率或自然變異性的可靠數(shù)據(jù)。目前，許多制藥和生物技術(shù)公司已將 TransFluor 檢測(cè)法確認(rèn)為 HCS 金標(biāo)準(zhǔn)分析。據(jù)報(bào)道，Ross 等[63]已利用TransFluor 技術(shù)通過檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱與分布及其變化對(duì)GPCR 進(jìn)行高內(nèi)涵篩選。

無標(biāo)簽技術(shù)極大地推進(jìn)了 GPCR 全細(xì)胞分析手段，該方法使用生物傳感器，將配體誘導(dǎo)的活細(xì)胞變化總和轉(zhuǎn)換為光學(xué)、電學(xué)、量熱、聲學(xué)、磁性或其他可量化信號(hào)，可以用于檢測(cè)包括細(xì)胞黏附、增殖、遷移和死亡的特征性變化。目前基于光學(xué)的儀器包括 BindTM（SRU 生物系統(tǒng)）和 EpicTM（康寧公司）系統(tǒng)，這兩個(gè)系統(tǒng)都已成功地用于研究細(xì)胞形態(tài)變化和 GPCR 信號(hào)通路[64]。但無標(biāo)簽全細(xì)胞分析也容易出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果[65]。

基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)長(zhǎng)期以來在藥物發(fā)現(xiàn)中發(fā)揮著重要作用，尤其是對(duì)于具有酶靶點(diǎn)的藥物。目前，基于 GPCR結(jié)晶學(xué)的最新突破[66-67]，發(fā)現(xiàn) 44 種不同的 GPCR 結(jié)構(gòu)和196 種配體-受體復(fù)合物可用于人類 GPCR 研究，這為虛擬篩選和細(xì)胞非依賴發(fā)現(xiàn)新藥物提供了重要依據(jù)[68-69]。例如，最近針對(duì) μ 阿片受體結(jié)構(gòu)的對(duì)接實(shí)驗(yàn)確定了一種 Gi 蛋白偏向的激動(dòng)劑 PZM21，其療效與嗎啡相似，但減少了對(duì)小鼠的不良反應(yīng)[70]。與傳統(tǒng)分析方法相結(jié)合，這些新興的藥物篩選平臺(tái)在 GPCR 藥物篩選和開發(fā)中有著廣闊的發(fā)展前景。

3 小結(jié)

GPCR 靶向藥物是學(xué)術(shù)界和制藥界最廣泛的研究焦點(diǎn)。GPCR 蛋白家族在糖尿病、肥胖、阿爾茨海默癥等為代表的疾病中具有重要臨床用藥價(jià)值。此外，一些孤兒受體已鎖定為多種適應(yīng)證的新靶點(diǎn)，這為該領(lǐng)域的藥物研發(fā)工作提供了強(qiáng)大動(dòng)力。由于 X 射線晶體學(xué)、蛋白質(zhì)工程和生物物理技術(shù)的發(fā)展，GPCR 先導(dǎo)化合物的開發(fā)技術(shù)正在逐漸迭代更新，新的分析方法更加高效和多維，例如 3D 晶體學(xué)結(jié)構(gòu)分析、無標(biāo)記熒光分析和虛擬篩選等。

盡管如此，讓 GPCR 靶向藥物真正服務(wù)于臨床仍然是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作，這對(duì)高通量篩選技術(shù)的工藝優(yōu)化和新技術(shù)開發(fā)提出了更高的要求。展望未來，基于結(jié)構(gòu)和傳感器的方法與傳統(tǒng)的 HTS 相結(jié)合，可能會(huì)為 GPCR 藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域帶來新的機(jī)遇，從而擴(kuò)大潛在靶向界面范圍，為更精準(zhǔn)的藥物治療提供可能性。