田爽，倪朝輝，趙雪利，胡治，羅建良，宋柏杉，楊欣，黃紅蘭

細菌黏附材料表面并形成生物膜，可造成植入物的失敗或患者感染。目前，多釆用添加傳統(tǒng)抗菌劑來制備抗菌材料，例如，抗生素、金屬及其鹽、季銨鹽化合物、聚六亞甲基雙胍等，而這些方法存在一定的弊端。比如浸出的抗生素和重金屬，被摻入到聚合物表面逐漸釋放，增加微生物對抗菌劑的耐受性；次致死劑量的抗生素加劇生物膜的形成；生物大分子和死亡微生物聚集在聚合物表面，阻止抗菌功能團發(fā)揮作用等。因此，需要尋找一種新型的抗菌材料或抗菌改性方法。

多聚長效抗菌膜液材（敷）料是一種新型復方生物材料，是通過多元接枝改性技術合成的第七代季銨鹽聚合物產品。區(qū)別于臨床現(xiàn)有的一過性殺菌產品，通過生物工程的接枝改性技術，對原有各成分的化學結構進行了修飾，各組分通過多次的基團替換和關聯(lián)嫁接，改變了原有各成分的屬性和關系，優(yōu)化了分子結構，使其具有長效抗菌的能力，很好地阻斷創(chuàng)面病原微生物的侵襲與定植，用于皮膚及黏膜創(chuàng)面感染的預防和輔助治療，促進創(chuàng)面愈合[1]。

細菌的生物膜是一些細菌附著并包埋于創(chuàng)面，與細胞外基質等形成的一種膜性結構，是創(chuàng)面難愈或不愈的一種新機制[2]。本研究觀察了多聚長效抗菌膜液材（敷）料對臨床分離的鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、大腸埃希菌、白念珠菌形成的生物膜的裂解作用，為臨床治療細菌生物膜感染提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥物 由太信太德生物醫(yī)學工程（湖南）有限公司生產的多聚長效抗菌膜液材（敷）料，商品名：捷克信；產品批號：202104271-1。銀離子抑菌劑（生產批號：20122113）和碘伏（生產批號：200621）作為陽性對照藥物，購自長春希凱科技發(fā)展有限公司。

1.1.2 試驗菌株 鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、大腸埃希菌、白念珠菌均自臨床標本中分離，由吉林大學基礎醫(yī)學院病原生物學實驗室保存。

1.1.3 儀器設備 SW-CJ-1F 型凈化工作臺購自蘇州凈化設備有限公司；YA28X-4T/10JL 高壓蒸汽滅菌器購自上海博訊實業(yè)有限公司；DHP060 型電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海實驗儀器廠有限公司；PC5515R 臺式高速離心機和 AX223ZH 型分析天平購自奧豪斯儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化 將金黃色葡萄球菌、MRSA、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、白念珠菌、金黃色葡萄球菌 + 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌 + 銅綠假單胞菌，接種于肉湯培養(yǎng)基中，置于 37 ℃ 恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，160 r/min 4 h，使細菌濃度達到 9 × 108CFU/ml[3]。

1.2.2 最小抑菌濃度（MIC）測定 采用倍比稀釋法測定捷克信、碘伏、銀離子的 MIC[4]。無細菌生長的藥物最高稀釋度為最小抑菌濃度（MIC）。

1.2.3 細菌生物膜形成周期測定 將稀釋后的菌液加入到放有細胞爬片的 6 孔板中，37 ℃ 培養(yǎng)，每 24 小時換液一次。通過結晶紫染色測定 12、24、36、48 h 每種菌生物膜的形成情況[5]。

1.2.4 裂解細菌生物膜試驗 將稀釋后的菌液加入到放有細胞爬片的 6 孔板中。肺炎克雷伯菌37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng) 48 h，其余菌連續(xù)培養(yǎng) 24 h。在已形成生物膜的 6 孔板中加入 2 ×MIC 濃度的碘伏、捷克信、銀離子，37 ℃ 培養(yǎng)8 h。通過結晶紫染色以及活菌計數(shù)觀察碘伏、捷克信、銀離子裂解已形成的生物膜的能力[5]。

2 結果

2.1 多聚長效抗菌膜液材（敷）料對細菌的最小抑菌濃度

采用倍比稀釋法測定多聚長效抗菌膜液材（敷）料對臨床分離的金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、白念珠菌以及金黃色葡萄球菌與大腸埃希菌混合液、金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌混合液的 MIC，銀離子與碘伏作為陽性對照，如表1 所示。

表1 多聚長效抗菌膜液材（敷）料對細菌的最小抑菌濃度（MIC）（mg/L）Table 1 The MIC of JEK SUNG against bacteria (mg/L)

2.2 細菌生物膜形成周期測定

細菌在六孔板上形成生物膜的情況如圖1 所示，金黃色葡萄球菌、MRSA、大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、白念珠菌、金黃色葡萄球菌 + 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌 + 銅綠假單胞菌的生物膜在 24 h 時形成的形態(tài)最好，肺炎克雷伯菌的生物膜在 48 h 時形成的形態(tài)最好。

2.3 裂解細菌生物膜結果

2.3.1 結晶紫染色觀察 向已培養(yǎng)的生物膜樣品中加入 2 × MIC 濃度的碘伏、捷克信、銀離子，37 ℃ 培養(yǎng) 8 h。結晶紫染色顯示，捷克信可以有效裂解已形成的生物膜（圖1）。對金黃色葡萄球菌、MRSA、大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌 + 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌 + 銅綠假單胞菌形成的生物膜裂解效果較明顯。

圖1 捷克信裂解細菌生物膜Figure 1 JEK SUNG lytic bacterial biofilm

2.3.2 活菌計數(shù)觀察 將細胞爬片洗脫的菌液做倍比稀釋后，涂布于 NA 固體平板上，37 ℃ 培養(yǎng)18 ～ 20 h，取菌落數(shù)為 30 ～ 300 之間的平板計算活菌數(shù)。結果如圖2 所示，捷克信可以有效裂解生物膜中的細菌，其中裂解金黃色葡萄球菌、MRSA、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌 + 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌 + 銅綠假單胞菌的效果顯著，與細菌對照組比較，差異顯著。

圖2 捷克信裂解細菌生物膜（活菌計數(shù)）Figure 2 JEK SUNG lytic bacterial biofilm (viable count)

3 討論

多聚長效抗菌膜液材（敷）料是一種新型復方生物材料，是通過多元接枝改性技術對原有各成分的化學結構進行修飾，優(yōu)化了分子結構，起到了多組分聚合協(xié)同增效的作用，從而全面提升了產品的臨床療效[6]。

前期研究顯示，多聚長效抗菌膜液材（敷）料對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌有抑制作用[1]。在此基礎上，本研究探討了多聚長效抗菌膜液材（敷）料裂解細菌生物膜的作用。

通過形態(tài)學和生物膜內活菌計數(shù)顯示，多聚長效抗菌膜液材（敷）料對金黃色葡萄球菌、MRSA、大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌與大腸埃希菌混合感染以及金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌混合感染形成的生物膜裂解效果較明顯。其中，對金黃色葡萄球菌、MRSA 以及金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌混合感染形成的生物膜裂解效果，與陽性對照藥物銀離子比較，差異顯著。

多聚長效抗菌膜液材（敷）料中，有機硅季銨鹽以化學鍵方式附著和固定在組織的表面，通過有機硅的接枝聚合形成交聯(lián)膜，改變細菌胞壁的通透性，使菌體內的酶、輔酶和代謝中間產物溢出，致使微生物發(fā)生“接觸死亡”；聚季銨鹽-1 破壞細菌細胞膜，導致細胞內容物滲出；殼聚糖季銨鹽破壞細菌細胞壁的結構和功能，改變菌體的 pH 環(huán)境[7]，從而殺死生物膜中的細菌。

多聚長效抗菌膜液材（敷）料在體外實驗中裂解細菌生物膜的形成，為臨床上使用細菌生物膜感染的防治提供了理論依據(jù)。