夏德菊，袁柳鳳，周潛，許四宏，尹躍平

梅毒是由梅毒螺旋體（treponema pallidum，TP）感染引起的慢性、系統(tǒng)性性傳播疾病[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全球每年有近兩千萬的梅毒新發(fā)感染者，隨著我國經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人口遷移的加快，從2005 - 2014年，梅毒病例增加了近三倍[2]。梅毒可由受感染的孕婦傳給胎兒，威脅下一代健康；系統(tǒng)性的梅毒也增加了其他病原體感染的機(jī)會(huì)，如人類免疫缺陷病毒[3-4]。及時(shí)診斷和治療對于減少梅毒發(fā)病率以及梅毒螺旋體向性伴侶和新生兒的傳播至關(guān)重要，通過早期發(fā)現(xiàn)母體感染并及時(shí)治療幾乎可以完全預(yù)防先天性梅毒[5]。在資源有限且難以進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室或梅毒篩查的地區(qū)，快速床旁（POC）檢測可以增加檢測人數(shù)，并為臨床服務(wù)提供同期治療的機(jī)會(huì)。此方法衍生的快檢試劑可以在室溫下儲(chǔ)存，操作時(shí)不需要任何設(shè)備，并且可以使用通過手指穿刺獲得的全血直接檢測，目前在發(fā)展中國家以及快速檢測應(yīng)用場景中有獨(dú)特優(yōu)勢[6-8]。

目前，我國已有超三十個(gè)企業(yè)研制出了 TP 抗體快速檢測試劑，此類試劑是以膠體金或硒為標(biāo)記物、以硝酸纖維素膜為載體、以層析形式進(jìn)行固相免疫測定的技術(shù)為原理而制備的。如此多的 TP 快檢試劑一方面為梅毒的即時(shí)檢測提供便利，但另一方面由于各生產(chǎn)單位所用抗原不同、工藝不同等，其產(chǎn)品的質(zhì)量也可能不同，而且前期一項(xiàng)研究表明，梅毒螺旋體抗體檢測試劑對不同臨床時(shí)期梅毒感染樣本的檢測靈敏度有顯著性差異[0]，因此為客觀評價(jià) TP 抗體快速試劑質(zhì)量水平以及比較各試劑之間的質(zhì)量差異，本研究選用前期本科室研制的梅毒螺旋抗體快速試劑國家參考品以及商品化的血清轉(zhuǎn)化盤和不同臨床時(shí)期的梅毒樣本對目前市面主要使用的 TP 抗體快速檢測試劑進(jìn)行性能評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 評價(jià)樣本 梅毒螺旋體抗體快速試劑國家參考品由中國食品藥品檢定研究院傳染病診斷試劑二室制備并提供，批號為 370035-201801。該套參考品由 10 份陽性樣本，20 份陰性樣本，3 份最低檢出限樣本及 1 份精密度樣本組成。梅毒血清轉(zhuǎn)換盤購自 SeraCare 公司，是于 2012年從美國一位 41 歲女性采集的 9 支樣本（分別在第0、5、10、13、31、45、48、52 和 59 天采集），該轉(zhuǎn)換盤所有樣本未經(jīng)稀釋，未加防腐劑，為梅毒自然進(jìn)程中的原始樣本。不同臨床時(shí)期的梅毒樣本由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院提供，一期梅毒樣本 8 份，二期梅毒樣本 10 份，三期梅毒樣本5 份，潛伏期梅毒樣本 12 份，梅毒治愈后樣本16 份，共計(jì) 51 份樣本，均為檢驗(yàn)科剩余樣本。1.1.2 評價(jià)試劑 待評價(jià)試劑為 2020年國家藥品醫(yī)療器械監(jiān)督抽檢中梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒（免疫層析法）項(xiàng)目各地區(qū)抽樣試劑，基本覆蓋了市面上普遍使用的梅毒螺旋體抗體快速試劑，共計(jì) 34 批次，來源于國內(nèi) 14 個(gè)生產(chǎn)企業(yè)，分布在北京、福建、浙江、廣州等省市，其中 A 廠家11 批次，B 廠家 8 批次，C、D 和 E 廠家各 2 批次，其余廠家均 1 批次，涉及的 TP 抗體快速試劑方法學(xué)有乳膠法和膠體金法。

1.2 方法

1.2.1 操作和結(jié)果判定 嚴(yán)格按照各試劑的說明書進(jìn)行樣本檢測和結(jié)果判定。本次試驗(yàn)由 2 人完成，一人負(fù)責(zé)加樣，一人負(fù)責(zé)結(jié)果判讀以保證不同試劑之間評價(jià)的一致性。對于梅毒螺旋體抗體快速試劑國家參考品按照參考品使用說明書進(jìn)行檢測，即待參考品完全融化，并混合均勻后作為待測樣品使用；如有必要可離心去除沉淀及雜質(zhì)。參考品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為：①陰性參考品：陽性反應(yīng)不得多于2 份，陰性參考品符合率應(yīng) ≥ 18/20；②陽性參考品：陰性反應(yīng)不得多于 1 份，陽性參考品符合率應(yīng) ≥ 9/10；③最低檢出限參考品，L1 應(yīng)檢出陽性，L2 可檢出陽性或陰性；L3 應(yīng)檢出陰性；④重復(fù)性參考品：平行檢測 10 次，應(yīng)均為陽性反應(yīng)且顯色度均一。血清轉(zhuǎn)換盤每支樣本檢測 1 次，然后統(tǒng)計(jì)每一批試劑檢測血清轉(zhuǎn)換盤的陽轉(zhuǎn)天數(shù)（即檢測結(jié)果開始出現(xiàn)陽性對應(yīng)樣本的采樣時(shí)間）。選取2 批次 A 廠家試劑，2 批次 B 廠家試劑，其余廠家各 1 批次，共 16 批次試劑對 51 份臨床樣本進(jìn)行檢測，若樣本不夠全部試劑檢測，原則為保證每個(gè)廠家檢測一批次產(chǎn)品。

1.2.2 試劑評分方法 按照滿分 100 分分配給三個(gè)項(xiàng)目，即檢測梅毒螺旋體抗體快速試劑國家參考品項(xiàng)目 40 分，檢測血清轉(zhuǎn)換盤項(xiàng)目 30 分，檢測 51 份臨床樣本項(xiàng)目 30 分。其中檢測梅毒螺旋體抗體快速試劑國家參考品中的陰性參考品、陽性參考品、最低檢出限參考品、重復(fù)性參考品各10 分，如果陰性參考品、陽性參考品有任一樣本檢測不符合扣 1 分，最低檢出限參考品 L1 和 L2均為陽性為 10 分，L1 陽性而 L2 陰性判 8 分。檢測血清轉(zhuǎn)換盤陽轉(zhuǎn)天數(shù)為 31 d 為滿分 30 分，第45、48、52 和 59 天分?jǐn)?shù)依次遞減 2 分。試劑檢測 51 份臨床樣本的陽性率乘以本項(xiàng)目基礎(chǔ)分 30 分為最終試劑檢測臨床樣本項(xiàng)目分?jǐn)?shù)。最終將三個(gè)項(xiàng)目得分相加為本次評價(jià)試劑的分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果

2.1 34 批次 TP 抗體快速試劑檢測梅毒螺旋體抗體快速試劑國家參考品

34 批次試劑檢測國家參考品中的陰性參考品、最低檢出限參考品和精密度參考品均滿足質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。其中有 24 批試劑檢測 20 份陰性參考品均為陰性，10 批試劑檢測結(jié)果有 1 份樣本假陽性。最低檢出限參考品有 21 批試劑檢測結(jié)果 L1 和L2 均為陽性，13 批試劑僅檢出 L1 陽性。對于10 份陽性參考品，有 20 批試劑均檢出陽性，9 批試劑檢出 9 份陽性，均符合參考品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但有 5 批試劑僅檢測 8 份陽性，不符合參考品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。其中 A 廠家和 B 廠家生產(chǎn)的不同批次試劑檢測同一套國家參考品的陰性參考品、陽性參考品和最低檢出限參考品結(jié)果出現(xiàn)不一致情況，具體結(jié)果見表1。

表1 34 批次 TP 抗體快速試劑檢測國家參考品結(jié)果Table 1 Results of 34 batches of TP antibody rapid reagent testing national reference

2.2 34 批次 TP 抗體快速試劑檢測血清轉(zhuǎn)換盤

34 批次試劑中有 3 批試劑最快出現(xiàn)陽轉(zhuǎn)，均在第31 天，有 6 批次試劑最晚出現(xiàn)陽轉(zhuǎn)，均在第59 天，中間相差 4 周時(shí)間。陽轉(zhuǎn)天數(shù)為 52、45 和 48 d 的分別有 10、8 和 7 批次試劑。其中同為 A 廠家生產(chǎn)的 11 批次試劑，有 3 批次陽轉(zhuǎn)天數(shù)為第59 天，1 批次陽轉(zhuǎn)天數(shù)為第31 天。具體結(jié)果見圖1。

圖1 34 批次 TP 抗體快速試劑檢測血清轉(zhuǎn)換盤陽轉(zhuǎn)天數(shù)（A1 ～ 11：A 廠家生產(chǎn)的 11 批次試劑；B1 ～ 8：B 廠家生產(chǎn)的8 批次試劑；C1 ～ 2：C 廠家的 2 批次試劑；D1 ～ 2：D 廠家生產(chǎn)的 2 批次試劑；E1 ～ 2：E 廠家生產(chǎn)的 2 批次試劑）Figure 1 Days of positive conversion of 34 batches of TP antibody rapid reagents detection serum conversion disk (A1 - 11: 11 batches of reagents produced by manufacturer A; B1 - 8: 8 batches of reagents produced by manufacturer B; C1 - 2: 2 batches of reagents produced by manufacturer C; D1 - 2: 2 batches of reagents produced by manufacturer D; E1 - 2: 2 batches of reagents produced by manufacturer E)

2.3 16 批次 TP 抗體快速試劑檢測不同臨床時(shí)期樣本

分別選取 A、B 廠家檢測血清轉(zhuǎn)換盤性陽轉(zhuǎn)天數(shù)最早和最晚的 A1、A11 和 B1、B8 各 2 批次試劑，其余廠家各 1 批次試劑檢測臨床樣本。對于 8 份一期樣本，除了 3、6、8 號樣本所有檢測試劑均檢出陽性外，其余 5 份樣本均有試劑未檢出，尤其是 1、2 號樣本 16 批試劑僅有 4 批和5 批試劑檢出陽性。4、5、7 號樣本分別有 6、6、4 批樣本檢為陰性。對于 10 份二期樣本，除了1、2 號樣本有 1、3 批樣本漏檢外，其余樣本所有檢測試劑均檢出陽性。5 份三期樣本以及 16 份治愈后樣本所有檢測試劑均檢出陽性。12 份潛伏期樣本，有一份樣本有 2 批次試劑檢為陰性，其余所有試劑檢測該期樣本均為陽性。16 批次試劑檢測 51 份臨床樣本的陽性率為 84.3% ～ 100%，具體結(jié)果見表2。

表2 16 批次 TP 抗體快速試劑檢測不同臨床時(shí)期樣本結(jié)果Table 2 Results of 16 batches of TP antibody rapid reagents for testing samples of different clinical stages

2.4 試劑評分結(jié)果

按照擬定的評分方法對檢測試劑進(jìn)行評分，由于只有 16 批次試劑檢測了臨床樣本，因此表3列出了 16 批次試劑的評分結(jié)果?？偡肿罡叩臑锳 廠家的 A11 試劑，為 99.4 分，其次為 D 廠家和 L 廠家試劑，分別為 99.0 和 98.0 分?？偡肿畹偷臑?A 廠家的 A1 試劑，為 83.3 分，其次是B 廠家的 B1 試劑和 H 廠家試劑，分別為 84.5和 85.2 分。

表3 16 批次 TP 抗體快速試劑評分結(jié)果Table 3 16 Batch TP antibody rapid reagents scoring results

3 討論

基于免疫層析法研制的 TP 抗體快速試劑是近幾年發(fā)展的一種十分簡便、快速的梅毒診斷血清學(xué)方法，適用于性病門診的快速檢測、街頭無償獻(xiàn)血者的篩查以及緊急用血，尤其在資源匱乏地區(qū)有很高的經(jīng)濟(jì)學(xué)效益[10-11]。由于此類試劑技術(shù)門檻較低，國內(nèi)眾多企業(yè)研制出 TP 抗體快速試劑。2019年之前并無相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)品和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對此類試劑進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)管，長期以來我國對于該類試劑僅執(zhí)行注冊檢驗(yàn)，且均為使用企業(yè)參考品進(jìn)行注冊檢驗(yàn)評價(jià)，試劑質(zhì)量差異很大。因此，我們于 2019年研制出梅毒螺旋體抗體快速試劑國家參考品，用于此類試劑的注冊檢驗(yàn)，以加強(qiáng)試劑的質(zhì)量監(jiān)管。從2020年監(jiān)督抽檢的 34 批次試劑檢測國家參考品結(jié)果來看，85.3% 的試劑符合國家參考品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，不符合批次的不合格項(xiàng)目均為陽性參考品符合率，集中表現(xiàn)為對弱滴度樣本的漏檢，一方面可能是因?yàn)橛捎诳焖贆z測試劑采用膠體金或硒標(biāo)記，并用層析技術(shù)進(jìn)行檢測，因此該類試劑的靈敏度確實(shí)低于酶聯(lián)免疫法和化學(xué)發(fā)光法試劑，另一方面可能和試劑未正規(guī)評價(jià)過早期梅毒感染者樣本有關(guān)。

典型的梅毒感染進(jìn)程為先在生殖器出現(xiàn)原發(fā)皮損，即硬性下疳，臨床稱為一期梅毒，下疳?？勺匀挥?，2 ～ 3 個(gè)月無癥狀的隱伏期后進(jìn)入二期梅毒，此期的主要表現(xiàn)為全身皮膚黏膜出現(xiàn)梅毒疹，二期梅毒因治療不當(dāng)，經(jīng)過 5年或更久的反復(fù)發(fā)作而進(jìn)入三期，主要表現(xiàn)為皮膚黏膜的潰瘍性損害或內(nèi)臟器官的肉芽腫樣病變。但大部分梅毒患者并沒有典型的皮損表現(xiàn)，即表現(xiàn)為隱性梅毒感染。一、二期梅毒又統(tǒng)稱為早期梅毒，此期傳染性強(qiáng)，但病程短、破壞性小。三期梅毒又稱為晚期梅毒，該期傳染性弱，但病程長、破壞性大。隱性梅毒也具有傳染性，但病程不明確，跨度很大。梅毒患者經(jīng)過有效正規(guī)的驅(qū)梅治療后其非特異性抗體滴度轉(zhuǎn)為陰性即為梅毒治愈患者，但特異性抗體終身維持陽性。我國在 20 世紀(jì)經(jīng)歷了梅毒大流行，目前處于梅毒治愈和隱性期感染人數(shù)較多，又考慮到早期梅毒感染者病程短，樣本不易收集，因此梅毒檢測試劑注冊前的臨床試驗(yàn)選用早期感染樣本較少，所以 TP 抗體快速試劑對早期梅毒感染樣本的檢測情況并未有效評估，一定程度上影響了試劑的研發(fā)。本研究對血清轉(zhuǎn)換盤的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)34 批次試劑的檢測陽轉(zhuǎn)天數(shù)相差高達(dá) 4 周時(shí)間，間接證實(shí)了部分試劑對早期感染樣本的檢測靈敏度較低。對不同臨床時(shí)期梅毒感染樣本的檢測結(jié)果也可以證實(shí)，TP 抗體快速試劑對三期、隱性期及治愈后梅毒感染樣本的檢測靈敏度較高，一方面是因?yàn)榇似跇颖镜募膊∵M(jìn)程較長，抗體滴度較高，另一方面也說明了由于樣本易獲得，試劑研發(fā)廠家對此期樣本驗(yàn)證考核較多。但 TP 抗體快速試劑對一期梅毒感染樣本檢測靈敏度較低，本研究中處于一期梅毒感染的 1、2 號樣本 16 批試劑僅有 4 和5 批試劑檢出陽性，還有 3 份樣本也有試劑出現(xiàn)漏檢，16 批試劑對 51 份臨床樣本的檢出率最低僅達(dá)到 84.3%，因此亟需提高 TP 抗體快速試劑對早期梅毒感染者的檢出，以有效阻斷傳播源，控制梅毒流行。

16 批次 TP 抗體快速試劑評分為 83.3 ～99.4 分，90 分以下有 4 家試劑，分?jǐn)?shù)跨度較大，跨度最大的兩個(gè)試劑來自于同一個(gè)生產(chǎn)廠家，一定程度反映了目前國內(nèi) TP 抗體快速試劑的質(zhì)量良莠不齊，而且部分廠家試劑的工藝穩(wěn)定性也有待改進(jìn)。所以臨床使用時(shí)要嚴(yán)格對檢測試劑質(zhì)量進(jìn)行評估，重點(diǎn)關(guān)注對早期樣本的檢測能力。如果未有效評估不同臨床時(shí)期樣本的檢測情況，建議此類試劑主要用于緊急篩查以及資源匱乏地區(qū)，有醫(yī)療條件的地區(qū)可以選用靈敏度更高的梅毒螺旋體血清學(xué)試驗(yàn)。

TP 抗體快速試劑對不同臨床時(shí)期樣本檢測差異可能還和不同臨床時(shí)期梅毒樣本的抗體譜變化有關(guān)，前期我們使用商品化的 WB 試劑對不同臨床時(shí)期梅毒樣本進(jìn)行檢測，分析不同樣本對 TP 外膜蛋白中的 TP15、TP17、TP45 和 TP47 蛋白的反應(yīng)強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)抗 TPN45 的抗體在各個(gè)時(shí)期的反應(yīng)強(qiáng)度均很高，而其余三種抗體在梅毒一期、二期、三期、治愈后的疾病進(jìn)程中呈現(xiàn)上升再下降的變化，梅毒早期感染樣本 TP15 抗體的反應(yīng)強(qiáng)度要高于 TP17 和 TP47 抗體[9]，這些變化提示 TP 抗體快速試劑在研發(fā)設(shè)計(jì)時(shí)要選擇合適的抗原種類以及濃度配比。

綜上所述，我國梅毒螺旋體抗體快速試劑在對早期梅毒感染樣本檢測能力方面需要提高，一方面需要選取覆蓋所有疾病進(jìn)程的樣品對試劑進(jìn)行評價(jià)，另一方面需要維持不同批次試劑的工藝穩(wěn)定性以及運(yùn)輸穩(wěn)定性，最后要關(guān)注梅毒疾病進(jìn)程中梅毒螺旋體的免疫應(yīng)答模式，加強(qiáng) TP 抗體快速試劑的基礎(chǔ)研究，從源頭提高試劑質(zhì)量。