姜鵬飛，于文靜，朱凱悅，李 雙，董秀萍，溫成榮，鮑志杰，孫 娜

（國家海洋食品工程技術(shù)研究中心 大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 遼寧大連 116034）

羅非魚 （Oreochromis niloticus） 是一種淡水魚，作為世界水產(chǎn)業(yè)重點培養(yǎng)的養(yǎng)殖魚類，被譽為未來動物性蛋白質(zhì)的主要來源之一。 我國現(xiàn)已發(fā)展成為全球最大的羅非魚生產(chǎn)國和出口國[1]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計，2019年我國羅非魚產(chǎn)量為164.17 萬t[2]。 羅非魚生長速度快、產(chǎn)量高、肌肉加工性能好，極具市場潛力，作為魚糜生產(chǎn)的主要淡水魚來源之一[3]。 目前，有文獻報道未漂洗魚糜存在凝膠強度差，凝膠易劣化等問題，國內(nèi)外研究者已開展較多的研究工作，通過優(yōu)化加工工藝（超高壓、微波、超聲輔助等）[4-5]或添加外源物，如某些非肌肉蛋白質(zhì)[6]、淀粉、鹽類[7-8]和酶制劑[9]等來改善魚糜凝膠品質(zhì)。

多糖是地球上極為豐富的天然生物高聚物，通常具有顯著的流變學(xué)特性，如增稠性、穩(wěn)定性和膠凝性。由于其具有無毒、廣泛的可獲得性和可再生性等特點，因此作為食品品質(zhì)改良劑，將其越來越多地應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域[10-11]。 研究顯示，與單一蛋白質(zhì)凝膠體系相比，多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合凝膠通常具有更優(yōu)異的成膠性能和更穩(wěn)定的凝膠結(jié)構(gòu)[12-13]。因此，多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合凝膠被廣泛應(yīng)用于魚糜加工。然而，多糖種類繁多、結(jié)構(gòu)性質(zhì)各異，根據(jù)帶電性的不同可分為陽離子多糖（殼聚糖）、陰離子多糖（如卡拉膠、結(jié)冷膠等）和中性多糖（如可得然膠、魔芋膠等）[14]。 不同離子型的多糖結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同，與蛋白質(zhì)的復(fù)合成膠性能也存在差異，將導(dǎo)致最終產(chǎn)品品質(zhì)的不同。 本研究以羅非魚為研究對象，分別加入不同添加量的卡拉膠、魔芋膠和殼聚糖3 種離子型多糖，制備多糖-未漂洗羅非魚魚糜。利用物性學(xué)、流變學(xué)、低場核磁共振技術(shù)、顯微成像技術(shù)等方法，探究3 種多糖對未漂洗羅非魚魚糜凝膠的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

冷凍羅非魚片，海南翔泰漁業(yè)有限公司；卡拉膠、魔芋膠、殼聚糖，北京寶希迪有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

測色儀（UltraScan PRO），美國HunterLab 公司；物性儀（TA.XT.plus），英國SMS；核磁共振成像分析儀（MesoQMR23-060H），蘇州紐邁電子科技有限公司；雙目生物顯微鏡（WF10X），揚州精輝試驗機械有限公司；流變儀（CP5000），常州德杜精密儀器有限公司； 傅里葉變換紅外光譜儀 （FTIR-650S），天津港東科技股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理方法 冷凍羅非魚片于4 ℃的冷藏冰箱緩化12 h，使用斬拌機將羅非魚肉進行第1 次斬拌，時間為5 min，加入3%的NaCl，再進行第2 次斬拌，時間為5 min，以使魚肉中的鹽溶性蛋白充分溶出，添加不同的多糖后，最后再斬拌5 min。 整個試驗過程溫度需在10 ℃環(huán)境中，將斬拌好的魚糜灌入直徑26 mm、 長度50 mm 的膠原蛋白腸衣，用棉線封口。 熟制采用兩段加熱法，分別是40 ℃加熱30 min，90 ℃加熱20 min。 加熱完成后置于冰水中冷卻至室溫，4 ℃冰箱中放置過夜，以備后續(xù)試驗。

1.3.2 白度的測定 將樣品切成直徑2.5 mm、高25 mm 的圓柱體。 采用色差計測定樣品的L*、a*和b*值，每組樣品平行測定3 次，計算其白度值，按公式（1）計算：

1.3.3 持水特性 （Water holding capacity，WHC）測定 參照尚珊等[15]的方法，將5 g（W0）的樣品用濾紙包裹，使用離心機于6 500×g、10 ℃下離心10 min，離心后樣品去除濾紙后稱重，記W1。 每組樣品測定4 次，取平均值。 按公式（2）計算：

式中，WHC——持水率（%）；W0——樣品的原始質(zhì)量（g）；W1——樣品離心后的質(zhì)量（g）。

1.3.4 低場核磁共振技術(shù) （Low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）測定 將4 g（直徑25 mm，高10 mm） 的樣品放入40 mm 的核磁管內(nèi)，測定樣品的自旋-自旋弛豫時間（T2），參數(shù)設(shè)置為P1=23 μs，P2=44 μs，SW=100 kHz，Tw=3 000，NECH=10 000，利用核磁共振弛豫時間反演擬合軟件得到T2圖像。

1)掌握機插秧齡，做到分批次育秧，及時栽插。把握栽插密度，栽插行距25厘米，株距14～15厘米，對于連續(xù)缺穴3穴以上應(yīng)及時進行人工補苗。

1.3.5 魚糜凝膠的核磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI） 采用T2加權(quán)成像，通過成像軟件中的多層自旋回波（SE）序列來實現(xiàn)。 T2加權(quán)成像的重復(fù)時間TR=2 000 ms，回波時間TE=20 ms。

1.3.6 質(zhì)地剖面分析 參考Jiao 等[16]方法稍作修改，樣品大小為直徑25 mm、高10 mm，探頭選取P50，參數(shù)設(shè)置為：測前速率為1 mm/s，測試速率為1 mm/s，測后速率為1 mm/s，下壓比例為50%，觸發(fā)力為5 g，2 次壓縮間隔時間為5 s，每個樣品測6 次，取平均值。

1.3.7 凝膠強度測定 凝膠強度測試選取P/5s球形探頭，參數(shù)設(shè)置為：測前速率為1 mm/s，測試速率為1 mm/s，測后速率為1 mm/s，下壓比例為50%，觸發(fā)力為5 g，每個樣品測6 次，取平均值。

1.3.8 流變特性測定 參照黃穎等[17]的方法，采用魚糜糊進行測定，測試條件為變溫掃描：振蕩頻率1 Hz，在1%應(yīng)變下，溫度從25 ℃升溫到40 ℃，40 ℃保持30 min，溫度從40 ℃升溫到90 ℃，90 ℃保持20 min，升溫速率為1 ℃/min，測定頻率掃描過程中儲能模量（G′）和耗能模量（G″）的變化。

1.3.9 傅里葉紅外光譜 （Fourier infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析 根據(jù)Oujifard 等[18]的方法，先將樣品冷凍干燥，然后將其研磨至粉末，取粉末與無水溴化鉀按照質(zhì)量比1 ∶100 充分研磨混勻，再于壓片機下壓成透明薄片，最后使用FTIR 進行樣品掃描并采集圖譜，采集完成后使用軟件OMNIC 8.2.0.387 對圖譜進行分析。

1.3.10 切片染色觀察 參照梁峰[19]的方法稍作修改，將魚糜凝膠修整為π25 mm2×10 mm 的圓柱，放入一次性塑料包埋框中并固定，將其經(jīng)過質(zhì)量分數(shù)80%，95%，100%的乙醇進行梯度脫水，再分別用二甲苯/無水乙醇混合液和二甲苯進行透明。 在烘箱中倒入預(yù)熔的石蠟，進行浸蠟操作，待其冷卻后將蠟塊修整，然后使用切片機切片，切成厚約7 μm 的蠟帶，隨后進行脫蠟，洗脫，采用蘇木素-伊紅（HE）溶液染色90 s，隨后在顯微鏡下觀察拍照。

1.3.11 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoreses，SDS-PAGE）測定 稱取樣品2 g，加入18 mL 的5%SDS 溶液，在10 000 r/min 的勻漿機下均質(zhì)1 min，放入85 ℃水浴鍋保溫1 h。 樣品冷卻后用離心機在4 ℃，6 100×g 條件下離心15 min，取上清液。 電泳條件為：分離膠濃度15%，濃縮膠4%。 上樣量為10 μL，時間1.5 h。 電極緩沖液：Tris 3.0 g，甘氨酸14.4 g，SDS 1.0 g，加去離子水定容到1 000 mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種多糖對羅非魚魚糜凝膠白度的影響

隨著多糖添加量的提升，羅非魚魚糜凝膠的白度均呈先增加后降低趨勢，在添加量為1%時白度最大。與空白組樣品相比，當(dāng)添加不同量的卡拉膠和殼聚糖時，白度值均顯著增加，可能是由于多糖極易填充到魚糜凝膠縫隙中，使得光線在通過凝膠結(jié)構(gòu)時發(fā)生折射，進而影響羅非魚魚糜凝膠白度[20]。 而添加魔芋膠后，與空白樣品相比，在添加量為0.5%時變化不顯著（P>0.05），繼續(xù)增大添加量，在1%時白度最大，而在添加量為2%與1%時差異不顯著（P>0.05），對魚糜凝膠白度的影響較小，這可能是因為魔芋膠本身顏色較淺，對魚糜凝膠白度影響不大。在添加量相同的組間，卡拉膠的白度均大于其它2 種多糖，這可能是因為加入卡拉膠之后凝膠強度較好，從而形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較致密，導(dǎo)致光的散射增大，因此白度較大[21]。 上述結(jié)果表明，添加卡拉膠后對改善羅非魚魚糜凝膠色澤的效果最好。

圖1 不同添加量下3 種多糖羅非魚魚糜凝膠的白度值Fig.1 The whiteness value of three kinds of polysaccharide tilapia surimi gel under different supplemental levels

2.2 3 種多糖對羅非魚魚糜凝膠持水性的影響

如圖2 所示，添加不同多糖的羅非魚魚糜凝膠持水性趨勢各有不同。 與空白組相比，添加0.5%～2.0%卡拉膠的魚糜凝膠持水性均顯著升高（P<0.05），而且隨著添加量的增加，魚糜凝膠持水性呈先增加后降低的趨勢，在添加量為1%時，呈現(xiàn)最大的持水性。卡拉膠是親水膠體，分子結(jié)構(gòu)中存在許多親水基團，這些基團可以與水結(jié)合聚集到凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對水分的保持與魚糜凝膠的強度呈正相關(guān)[22]。 對于添加魔芋膠的魚糜凝膠來說，隨著魔芋膠添加量的增加，魚糜凝膠持水性的增加速率呈先較平緩而后變大的趨勢，且在添加量為1%時持水性達到最高；這與Jian 等[3]研究結(jié)果較為一致，其研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)魔芋膠添加量超過1.5%后，魚糜凝膠的保水性增加不顯著。添加殼聚糖后，魚糜凝膠持水性與空白組差異不顯著（P>0.05）。 由此可見，添加卡拉膠后，羅非魚魚糜凝膠持水性最高，其次是魔芋膠，最低的是殼聚糖。

圖2 不同添加量3 種多糖羅非魚魚糜凝膠的持水性Fig.2 Water holding capacity of tilapia surimi gel with different polysaccharide contents

2.3 3 種多糖對羅非魚魚糜凝膠水分分布及組成的影響

LF-NMR 能夠反映熱誘導(dǎo)魚糜凝膠水分內(nèi)部的流動性[23]。 由圖3 觀察可知，添加3 種多糖的羅非魚魚糜凝膠在T2弛豫時間分布均出現(xiàn)了3 個峰，T21、T22和T23，分別對應(yīng)著結(jié)合水、不易流動水和自由水。T21（0.1～1 ms）代表能與大分子表面極性基團相結(jié)合的單層水，T22（10～300 ms）代表束縛在凝膠網(wǎng)絡(luò)中的水，T23（300～1 000 ms）代表存在于魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以外的可以任意流動的自由水[24]。3 種多糖的P21、P22和P23的峰面積比例如表1 所示。

表1 卡拉膠對羅非魚魚糜凝膠峰面積比例的影響Table 1 Effect of κ-carrageenan on the proportion of gel peak area of tilapia surimi

圖3 不同添加量3 種多糖羅非魚魚糜凝膠的水分分布Fig.3 Water distribution of surimi gels of three kinds of polysaccharides in tilapia with different supplemental levels

凝膠持水性結(jié)果顯示，添加卡拉膠與魔芋膠均可提高魚糜凝膠的持水性，而添加殼聚糖后魚糜凝膠持水性不存在明顯差異，因此為了避免使用離心法對魚糜凝膠持水性測定所造成的誤差，通過核磁共振技術(shù)來預(yù)測魚糜凝膠保水性，測定其T2值，觀察其水分分布及組成[25]。 結(jié)果表明：數(shù)據(jù)中顯示P21弛豫峰的峰面積不存在顯著性差異，并且所占的比例幾乎可以忽略，因此對魚糜凝膠持水性影響較小。而影響最大的是P22弛豫峰峰面積，從表中可以看出卡拉膠的不易流動水含量較高，表明其凝膠網(wǎng)絡(luò)更致密、有序，其次是魔芋膠，而殼聚糖的不易流動水含量較低，自由水含量較高，可能是由于不易流動水轉(zhuǎn)化成了自由水。魚糜凝膠水分分布和組成分析結(jié)果表明，卡拉膠可以有效改善凝膠品質(zhì)。

表2 殼聚糖對羅非魚魚糜凝膠峰面積比例的影響Table 2 Effect of chitosan on the proportion of gel peak area of tilapia surimi

表3 魔芋膠對羅非魚魚糜凝膠峰面積比例的影響Table 3 Effect of konjac gum on the proportion of gel peak area of tilapia surimi

2.4 3 種多糖對羅非魚魚糜凝膠樣品水質(zhì)子密度（偽彩色圖像）的影響

核磁共振成像是在強磁場中利用氫原子激發(fā)射頻脈沖所產(chǎn)生的磁共振現(xiàn)象，通過空間編碼技術(shù)對氫原子發(fā)出的射頻信號相關(guān)的質(zhì)子密度、弛豫時間等參數(shù)進行變換，最終由計算機生成圖像的技術(shù)[26]。圖像中紅色越深，表明質(zhì)子密度越高[27]。圖4 為羅非魚魚糜凝膠樣品的MRI 圖像，通過觀察其顏色分布，可以直觀比較T2的水分分布情況。從圖中可以觀察到空白組樣品體積分布不均，魚糜呈現(xiàn)的孔洞較大，水分保持較差。隨著多糖添加量的增加，魚糜凝膠中的紅色部分面積逐漸縮小，表示氫質(zhì)子的信號強度逐漸下降，其中殼聚糖的水分質(zhì)子密度最低，并且體積在縮小，水分減少趨勢是由外向內(nèi)減少。 而添加卡拉膠和魔芋膠的試驗組魚糜凝膠水分質(zhì)子密度相對較高，這可能與魚糜凝膠的含水量有關(guān)，一般來說，含水率與水分質(zhì)子密度呈正比[28]，此MRI 結(jié)果與上述的持水性結(jié)果一致。

圖4 不同添加量3 種多糖羅非魚魚糜凝膠樣品水質(zhì)子密度Fig.4 Sub-density of water quality of three kinds of polysaccharide surimi gel samples of tilapia

2.5 3 種多糖對羅非魚魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

質(zhì)構(gòu)特性是評價魚糜凝膠感官品質(zhì)的重要參數(shù)，它可以間接反映出蛋白質(zhì)基質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性以及與其它成分的結(jié)合狀態(tài)[29]。3 種多糖的添加均影響了羅非魚魚糜凝膠的質(zhì)構(gòu)特性，而彈性特性無明顯變化，見圖5c。 硬度及咀嚼性的變化如圖5a、5b 所示。 與未添加多糖的空白組相比，添加卡拉膠能夠顯著增加魚糜凝膠硬度（P<0.05），當(dāng)添加量為0.5%，1%，2%時，硬度分別增加了155.44，1 168.21，2 252.2 g； 咀嚼性依次增加了93.53，700.99，1 108.22，說明不同添加量的卡拉膠均能顯著提高魚糜的硬度及咀嚼性。 而添加殼聚糖與魔芋膠時，在添加量為0.5%時，并沒有提高魚糜的硬度及咀嚼性，在添加量為1%時，硬度及咀嚼性分別增加了281.14，336.43 g 和172.86，333.14；添加量為2%時，分別增加了1 006.46，617.45 g 和712.91，427.16。 這表明多糖的加入使得魚糜在發(fā)生相同形變時所產(chǎn)生的應(yīng)力增大[30]，并保持魚糜凝膠結(jié)構(gòu)的緊密連接，口感得以改善，且多糖添加量≥1%能顯著提高魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)特性。 由數(shù)據(jù)可知，加入卡拉膠后，羅非魚魚糜凝膠硬度、咀嚼度的提升效果最佳。

圖5 不同添加量3 種多糖羅非魚魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)Fig.5 Gelation of tilapia surimi with different amounts of polysaccharide

2.6 3 種多糖對羅非魚魚糜凝膠強度的影響

從圖6a 可以看出，添加3 種多糖后，羅非魚魚糜凝膠的破斷力出現(xiàn)顯著變化，均隨著添加量的增加逐漸增加，尤其是添加卡拉膠后，其破斷力顯著增強。與空白組相比，添加卡拉膠的魚糜凝膠破斷力顯著高于其它2 種多糖（P<0.05），在2%時達到最大值（490.60 g），其次是殼聚糖（409.27 g），最低為魔芋膠（268.51 g）。 不同多糖對魚糜凝膠破斷距離的影響略有不同，見圖6b，不同添加量下的卡拉膠和殼聚糖的破斷距離均高于空白組樣品，而魔芋膠組隨著添加量的增加，破斷距離呈不斷下降趨勢。Zhang 等[31]研究結(jié)果表明當(dāng)多糖濃度較高時，可能會發(fā)生熱力學(xué)不相容的現(xiàn)象，會與魚糜凝膠中的蛋白出現(xiàn)相分離，分為多糖相和蛋白相，最終導(dǎo)致魚糜凝膠破斷距離下降。凝膠強度是破斷力和破斷距離的乘積，是評價魚糜制品凝膠特性的重要指標(biāo)[32]。 圖6c 顯示了3 種多糖對魚糜凝膠強度的影響。 與未添加多糖的空白組樣品比較，卡拉膠和殼聚糖的凝膠強度都有顯著的提高（P<0.05）。 不同添加量的魔芋膠并未引起凝膠強度的增加（P>0.05）。賈麗娜[33]研究發(fā)現(xiàn)無論哪一種加熱溫度，分子質(zhì)量為923.8 ku 的魔芋膠與肌原纖維蛋白形成的復(fù)合凝膠凝膠強度顯著低于空白組，可能由于魔芋膠的添加，魔芋膠與肌原蛋白發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白間的相互作用變?nèi)酢?在添加量相同的組間，添加量為0.5%時，不同多糖的魚糜凝膠強度之間的差異不顯著（P>0.05），而繼續(xù)增加多糖，卡拉膠的凝膠強度表現(xiàn)出較大的提升，并且與空白組樣品1 585.54 g·mm 的凝膠強度相比，添加量為2%的魚糜凝膠達到3 765.35 g·mm，凝膠強度顯著提高（P<0.05）。 3 種多糖，添加卡拉膠凝膠強度最大，與質(zhì)構(gòu)的研究結(jié)果一致。

圖6 不同添加量3 種多糖羅非魚魚糜凝膠強度Fig.6 Gelation strength of tilapia surimi with three polysaccharides added at different levels

2.7 3 種多糖對羅非魚魚糜凝膠流變性質(zhì)的影響

流變學(xué)特性是指在外力作用下魚糜的黏彈性變化，通常儲能模量G' 可以作為魚糜凝膠形成的指標(biāo)，能反映魚糜凝膠形成過程中三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成[34]。由圖7 可以看出，魚糜中的損耗模量G"隨溫度變化的增速慢于儲能模量G'，而趨勢基本一致，因此主要以分析彈性特性為主。在相同的溫度范圍內(nèi)，所有試驗組的G' 值的變化趨勢基本保持一致，均出現(xiàn)先上升后下降再升高的趨勢。從圖7（1a）、（2a）、（3a）中可以看出，與空白值（3 959.41 Pa）相比，添加3 種多糖后均能提高羅非魚糜凝膠最終的儲能模量，說明多糖的添加可以提高未漂洗魚糜的流變學(xué)特性。 而由圖7（1b）可以看出，相對于空白組，在升溫過程中只有添加2%卡拉膠才能使魚糜G'提高。一般來說，G'值越大，凝膠強度越強，這與凝膠強度的測試結(jié)果一致。 由圖7（2b）可得不同殼聚糖魚糜凝膠G' 均低于空白組。 然而，隨著溫度G' 的升高，2%的殼聚糖明顯高于其它兩種多糖組與空白組，這說明高溫更有利于魚糜形成凝膠。 由圖7（3b）可以看出添加魔芋膠的試驗組與其它多糖組趨勢一致，然而其G' 與空白組較為接近，說明直接添加魔芋膠并不利于凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)的形成。 原因可能是因為黏性很強的魔芋膠易于填充在魚糜蛋白間，導(dǎo)致與魚糜蛋白接觸機會減少，從而阻礙凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成[35]。

圖7 3 種多糖對羅非魚魚糜凝膠流變性質(zhì)的影響。 （a）升溫過程；（b）恒溫過程-前30 min 為40 ℃，后20 min 為90 ℃Fig.7 Effect of three kinds of polysaccharides on rheological properties of tilapia surimi gel.（a） the heating process；（b） constant temperature process- 40 ℃for the first 30 min and 90 ℃for the second 20 min

2.8 3 種多糖對羅非魚魚糜凝膠蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的常用方法之一就是傅里葉紅外光譜技術(shù)。 由圖8a 可以看出，添加不同多糖的魚糜凝膠吸收峰的位置差異較小，而特征峰形存在一定變化。 其中二級結(jié)構(gòu)中最有研究意義的區(qū)域是酰胺Ⅰ帶，包括β-折疊（1 610～1 640 cm-1）、無規(guī)則卷曲（1 640～1 650 cm-1）、α-螺旋（1 650～1 658 cm-1）和β-轉(zhuǎn)角（1 660～1 670 cm-1）。圖8 中的柱狀圖是不同波長所對應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)以及根據(jù)各特征峰的面積計算出的二級結(jié)構(gòu)的含量。

添加多糖后，魚糜凝膠的蛋白構(gòu)象發(fā)生了變化。 由圖8（1b）可知，魚糜樣品在卡拉膠添加量為0.5%和1%，α-螺旋含量為0%，與空白組相比，β-折疊含量依次增加了2.63%和6.43%，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量依次增加了0.85%和3.87%，β-轉(zhuǎn)角含量依次減少了6.06%和13.25%。由于β-折疊的穩(wěn)定性高于α-螺旋，因此含有較高β-折疊含量的凝膠及其質(zhì)構(gòu)特性更好。 2%的卡拉膠魚糜凝膠蛋白質(zhì)相對含量與空白組差異不顯著，說明2%卡拉膠加入并沒有改變蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。 圖8（2b）可以發(fā)現(xiàn)0.5%～1%的殼聚糖魚糜凝膠蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與空白組相比無明顯差異，繼續(xù)增加添加量，α-螺旋的相對含量變?yōu)?%，原因可能是蛋白質(zhì)受熱變性之后破壞了蛋白內(nèi)部的螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)由不穩(wěn)定變?yōu)榉€(wěn)定，從而使α-螺旋的含量降低，β-折疊含量增加[36]。 在圖8（3b）中添加魔芋膠魚糜凝膠蛋白質(zhì)與空白相比，α-螺旋和β-折疊相對含量呈現(xiàn)減少趨勢，β-轉(zhuǎn)角增加，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)無明顯差異。整體來說，添加魔芋膠對魚糜凝膠的二級結(jié)構(gòu)影響差異不顯著。在所有處理組中，多糖的加入改變了魚糜蛋白的構(gòu)象，添加卡拉膠更有利于形成凝膠強度更強和持水性更高的魚糜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖8 不同添加量3 種多糖羅非魚魚糜凝膠蛋白二級結(jié)構(gòu)Fig.8 Secondary structure of gelatinous protein of tilapia surimi with different dosage of three polysaccharides

2.9 3 種多糖在羅非魚魚糜凝膠中的空間分布

伊紅是一種生物染料，染色后可以使細胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)呈紅色。 魚糜樣品經(jīng)過伊紅染色之后，紅色部分是由肌肉蛋白質(zhì)所形成的部分，而添加多糖之后呈無色。在加熱過程中，多糖可能會與肌肉蛋白相結(jié)合，然而當(dāng)濃度較高時，多糖自身會吸水溶脹，并與肌肉蛋白出現(xiàn)相分離[19]。 因此，此法可以用來觀察魚糜凝膠中蛋白相和多糖相的分布。隨著3 種多糖添加量的增加，未染色區(qū)域面積逐漸增多且逐漸增大，空白組樣品未染色區(qū)域很少，并且比較均勻，僅有一些小孔隙可能與樣品處理中的氣泡有關(guān)。 3 種多糖中，添加卡拉膠后紅色區(qū)域結(jié)構(gòu)較均勻，孔洞數(shù)量較少，微觀結(jié)構(gòu)較致密，而多糖相部分隨著添加量的增加而增大。添加殼聚糖后微觀結(jié)構(gòu)中存在孔洞，隨著添加量的增多，未染色區(qū)域逐漸增大。添加魔芋膠后未染色區(qū)域面積最大且最多，此外紅色區(qū)域呈現(xiàn)的蛋白相結(jié)構(gòu)不均一，網(wǎng)格孔隙較大，這也導(dǎo)致添加魔芋膠后，魚糜凝膠的破斷力和凝膠強度顯著降低。也有可能是水分的變化影響羅非魚魚糜凝膠結(jié)構(gòu)，在凝膠形成的過程中，加入多糖后會與原本魚糜凝膠中的水分相結(jié)合，這可能也是導(dǎo)致魚糜凝膠持水性變化的原因[19]。

2.10 多糖對羅非魚魚糜凝膠SDS-PAGE 電泳圖譜的影響

魚糜以肌球蛋白重鏈 （MHC） 和肌動蛋白（Actin）為主要蛋白[37]。一般而言，魚糜凝膠能力與其主要蛋白的含量呈正相關(guān)，蛋白條帶顏色的深淺代表了蛋白含量的高低。圖10 顯示了添加不同量卡拉膠的羅非魚魚糜凝膠電泳圖譜。 從圖中可以看出，空白組和試驗組的MHC 和Actin 條帶顏色均未發(fā)生明顯的變化，說明卡拉膠不會影響魚糜凝膠的蛋白組分，推測卡拉膠可能是以填充劑的形式存在魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，對于蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)和聚集影響較小[22]。湯嘉慧[22]的研究結(jié)果顯示添加卡拉膠和卡拉膠+KCl 凝膠體系的魚糜蛋白電泳條帶跟空白對照組一樣，加熱均導(dǎo)致了MHC 條帶的消失。 說明卡拉膠和卡拉膠+KCl 凝膠體系的添加對蛋白質(zhì)的聚合和降解沒有影響，不能抑制蛋白質(zhì)的降解。 王聰[20]研究了不同含量羥丙基淀粉添加后白鰱魚糜的凝膠電泳圖譜，研究結(jié)果顯示淀粉的添加未使蛋白條帶發(fā)生明顯變化，說明淀粉可能以填充劑的形式存在于魚糜凝膠結(jié)構(gòu)中，對于蛋白組分影響不大。

圖9 不同添加量3 種多糖在羅非魚魚糜凝膠中的空間分布Fig.9 Spatial distribution of three polysaccharides with different supplemental levels in tilapia surimi gel

圖10 不同添加量卡拉膠羅非魚魚糜凝膠蛋白SDS-PAGE 電泳圖譜Fig.10 SDS-PAGE electrophoresis of gelatine protein of tilapia surimi with different levels of carrageenan

3 結(jié)論

不同多糖及其添加量對羅非魚魚魚糜的凝膠特性具有顯著影響，3 種多糖均可改善魚糜的凝膠強度、持水性、白度、質(zhì)構(gòu)，且卡拉膠在改善魚糜凝膠特性方面具有更好的效果。 在魚糜凝膠水分分布的研究中顯示卡拉膠的添加能充分吸收羅非魚魚糜凝膠中的水分，提高魚糜凝膠的持水性。動態(tài)流變特性測定結(jié)果表明，在升溫階段添加卡拉膠的羅非魚魚糜G'值最大。二級結(jié)構(gòu)的結(jié)果顯示添加卡拉膠的羅非魚魚糜二級結(jié)構(gòu)以穩(wěn)定的β-折疊結(jié)構(gòu)為主，微觀結(jié)構(gòu)結(jié)果表明添加卡拉膠后的羅非魚魚糜凝膠具有較好的凝膠網(wǎng)格，組織結(jié)構(gòu)致密，因此卡拉膠的添加能有效增強羅非魚魚糜凝膠特性。然而，SDS-PAGE 電泳結(jié)果顯示卡拉膠的添加對羅非魚魚糜凝膠蛋白組分影響較小。該研究結(jié)果可作為后續(xù)試驗的基礎(chǔ)，并為魚糜產(chǎn)品新原料的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。