張磊 邵峰 李麗軍 杜章

結(jié)直腸癌是常見的胃腸道惡性腫瘤，也是腫瘤界的防治重點[1]。目前手術(shù)切除仍是治療結(jié)直腸癌的首要選擇，但如何降低術(shù)后死亡率以改善預(yù)后仍是臨床研究的重點。鈣調(diào)蛋白1（calmodulin 1，CALM1）是CALM 家族的一種鈣調(diào)蛋白，研究報道CALM1 能促進食管癌發(fā)展[2]，但其在結(jié)直腸癌中的表達及作用機制尚少有文獻報道。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一個蛋白受體酪氨酸激酶，EGFR 突變可導(dǎo)致基因活性異常而參與疾病發(fā)生，研究發(fā)現(xiàn)EGFR 突變與非小細胞肺癌的發(fā)生及預(yù)后緊密相關(guān)[3]，但其在結(jié)直腸癌中的突變情況及對預(yù)后的影響還需進一步探討。本次研究探討結(jié)直腸癌患者癌組織CALM1 基因表達水平和EGFR 突變情況及其與預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床改善結(jié)直腸癌的預(yù)后提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017 年2 月至2018 年11 月期間在東陽市人民醫(yī)院住院治療的結(jié)直腸癌患者100 例作為研究對象，其中男性57 例、女性43 例；年齡41～89 歲，平均（65.16±11.82）歲；腫瘤部位：結(jié)腸癌52 例、直腸癌48 例；最大腫瘤直徑：≤5 cm 46 例，＞5 cm 54 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53 例、未轉(zhuǎn)移47 例；Dukes 分 期：A 期20 例、B 期28 例、C 期52 例；高分化32 例、中分化48 例、低分化20 例。納入標準包括：①均接受手術(shù)治療且經(jīng)術(shù)后病理檢查確診的原發(fā)性結(jié)直腸癌；②術(shù)前均未接受放療、化療。排除：①嚴重心肝腎功能損傷者；②其他惡性腫瘤病史或其他結(jié)直腸疾病者；③嚴重精神疾病者；④高血壓等慢性病史者；⑤凝血功能或認知功能障礙者；⑥既往有腹部手術(shù)史者；⑦妊娠或哺乳婦女；⑧病灶廣泛侵襲鄰近組織無法切除者；⑨存在自身免疫性及感染性疾病者；⑩失訪患者；○1因其他疾病、意外等死亡的患者。本次研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 CALM1 基因表達水平檢測 收集患者手術(shù)切除癌組織和切緣正常組織標本，按TRIzol 裂解抽提法提取總RNA，檢測RNA 完整性，確定符合逆轉(zhuǎn)錄標準，根據(jù)CALM1-RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，條件：37 ℃30 min，98 ℃5 min，-20 ℃保存。應(yīng)用CALM1-RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對基因特異性引物進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)擴增，條件：95 ℃1 min，60 ℃1 min，75 ℃5 min，共35 個循環(huán)，所有試驗均至少重復(fù)3 次，采用2-△△Ct方法計算。本次研究以結(jié)直腸癌患者癌組織CALM1 基因平均表達水平作為分界線，將CALM1 基因≥平均表達水平記為高表達，＜平均表達水平記為低表達。

1.2.2 EGFR 突變檢測方法 將收集的癌組織及切緣正常組織放入液氮中研磨成粉，取50 mg 置入2 ml 離心管，用DNA 提取試劑盒提取DNA，采用ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀檢測EGFR 基因18～21 外顯子的共29 種突變類型，分析EGFR 突變情況，所有操作均嚴格按照試劑盒說明書。

1.2.3 跟蹤隨訪 所有患者術(shù)后均跟蹤隨訪3 年，通過電話、門診復(fù)查等方式隨訪患者生存情況，并進行生存分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)檢驗。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；CALM1 基因表達水平及EGFR 突變情況總生存率采用Kaplan-Meier法計算，繪制生存曲線并應(yīng)用Log-rank檢驗比較組間生存差異。設(shè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌癌組織和切緣正常組織CALM1 基因表達水平及EGFR突變情況比較見表1

表1 癌組織和切緣正常組織CALM1基因表達及EGFR突變情況比較

由表1 可見，結(jié)直腸癌癌組織CALM1 基因表達水平及EGFR 突變型比例高于切緣正常組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=28.09，χ2=17.36，P均＜0.05）。

2.2 不同臨床病理特征患者癌組織CALM1 基因表達水平及EGFR突變情況比較見表2

由表2 可見，不同性別、年齡、腫瘤部位、最大腫瘤直徑患者CALM1 基因高表達、EGFR 突變型比例比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2分別=0.44、0.26；1.99、3.15；2.62、2.67；2.69、3.18，P均＞0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes 分期C 期、低分化程度患者CALM1基因高表達、EGFR 突變型占比高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes 分期A～B 期、高/中分化程度患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2分別=11.79、7.70；7.96、6.18；7.30、8.24，P均＜0.05）。

表2 不同臨床病理特征患者癌組織CALM1基因表達水平及EGFR突變情況比較

2.3 隨訪期間，100 例結(jié)直腸癌患者中病死35 例，余65 例患者均存活，3年病死率為35.00%。

2.4 CALM1 基因高表達與低表達生存曲線和EGFR突變型與野生型生存曲線見圖1、圖2

圖1 CALM1基因高表達與低表達患者生存曲線

圖2 EGFR突變型與野生型患者生存曲線

由圖1、2 可見，CALM1 基因高表達和EGFR 突變型患者與CALM1 基因低表達和EGFR 野生型患者3年生存率（45.83%、42.42%vs82.69%、76.12%）比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2分別=14.85、13.27，P均＜0.05）。

3 討論

結(jié)直腸癌是生物學(xué)上高度異質(zhì)性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和病死率[4]。本次研究發(fā)現(xiàn)100 例結(jié)直腸癌患者3 年病死率為35.00%，略低于張微微等[5]研究報道的37.76%，可能與納入樣本量略有差異有關(guān)，但均可證實結(jié)直腸癌術(shù)后病死率較高。因此，探索影響結(jié)直腸癌患者手術(shù)預(yù)后的因素對臨床積極干預(yù)以提高生存率尤為重要。

CALM1 是CALM 家族的鈣結(jié)合受體蛋白，其表達水平與多種癌癥相關(guān)，參與癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移，在腫瘤發(fā)生中起到一定作用，研究發(fā)現(xiàn)CALM 家族基因在口腔癌中普遍表達[6]。EGFR 是受體蛋白酪氨酸激酶，在腫瘤細胞中分布廣泛，與特異性配體結(jié)合后，通過激活酪氨酸蛋白激酶途徑，參與腫瘤細胞增長、遷移、復(fù)發(fā)等過程[7]。本次研究發(fā)現(xiàn)癌組織CALM1 基因表達水平和EGFR 突變型比例均高于切緣正常組織，與韓秀娟等[8]和李美玲等[9]研究一致，均表明CALM1 基因表達上調(diào)和EGFR 突變參與腫瘤發(fā)生。另本次研究發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期C 期、低分化程度患者CALM1 基因高表達、EGFR 突變型比例高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes 分期A～B 期、高/中分化程度患者，提示CALM1 基因表達水平和EGFR 突變與結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征關(guān)系密切，可能對結(jié)直腸癌病情和預(yù)后具有評估價值。

本次研究還發(fā)現(xiàn)CALM1 基因高表達、EGFR 突變型患者3 年生存率低于低表達、野生型患者，提示CALM1 基因表達水平和EGFR 突變與結(jié)直腸癌患者的生存情況密切相關(guān)。CALM 家族基因分別存在于不同的染色體上，但其蛋白質(zhì)產(chǎn)物是完全相同的，鈣調(diào)蛋白系統(tǒng)均可參與癌組織和正常組織的生長和增殖。研究顯示CALM 家族成員基因表達上調(diào)與胰腺癌[10]、垂體腺瘤[11]等多種癌癥有關(guān)，并且可通過多種途徑促進腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵害，可根據(jù)其基因表達情況判斷患者生存情況。故在結(jié)直腸癌中CALM1 基因表達上調(diào)可促進癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移，增加患者預(yù)后不良和死亡風(fēng)險。EGFR 是一種跨模型生長因子受體，可將腫瘤生長信號分子從細胞傳遞到細胞內(nèi)，EGFR 突變會引起受體激活，導(dǎo)致機體正常組織細胞生物學(xué)特性改變，促進腫瘤細胞侵襲和增長，延緩腫瘤細胞凋亡，影響預(yù)后[12]。由此可見CALM1 基因高表達、EGFR 突變型在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起到協(xié)同作用，可共同促進腫瘤的發(fā)生，影響患者預(yù)后效果。臨床可通過早期檢測CALM1基因高表達和EGFR 突變型鑒別診斷結(jié)直腸癌患者病情，有利于進一步延長患者生存期，提高患者生存質(zhì)量。

綜上所述，結(jié)直腸癌癌組織CALM1基因表達水平及EGFR 突變型占比高于切緣正常組織，二者均與患者臨床病理特征和術(shù)后生存情況有關(guān)。本次研究不足之處在于樣本選取量較少，不足以代表全國患者的特點，需在今后研究中擴大樣本量，進行更廣泛的探索。