莊曉旭， 曾苑嫻， 冼中任， 劉安琪， 胡國艷

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率居女性惡性腫瘤的首位，且近年來的發(fā)病率呈逐漸增高的趨勢[1]。早期乳腺癌可行手術(shù)切除聯(lián)合放化療治療，總體治愈率為90%左右；但對(duì)于晚期患者，其5年生存率尚不足40%[2]。因此，早期診斷乳腺癌并及時(shí)治療對(duì)改善患者預(yù)后，提高生存率至關(guān)重要。目前乳腺癌的篩查技術(shù)主要有：乳腺查體、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、X線攝影、超聲檢查、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、正電子發(fā)射斷層顯像術(shù)(positron emission computed tomography，PET)、醫(yī)學(xué)影像引導(dǎo)細(xì)胞學(xué)穿刺檢查、影像基因組學(xué)和微波成像等[3]。組織病理檢查仍是乳腺癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但臨床上尚缺乏一種可早期診斷乳腺癌的分子標(biāo)志物。目前應(yīng)用最廣泛的乳腺癌腫瘤標(biāo)志物是癌抗原153(cancer antigen 153，CA153)和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)，但特異度不理想[4]。環(huán)狀RNA(circular ribonucleic acid, circRNA)是一類特殊的非編碼RNA分子，隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，人們?cè)谡婧思?xì)胞發(fā)現(xiàn)了大量circRNA[5]，且某些circRNA可以發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA的作用來調(diào)控基因表達(dá)，還可以作為microRNA(miRNA)海綿來影響基因的調(diào)控和表達(dá)[6-8]。由于circRNA沒有3＇端、5＇端和poly A尾，為封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可以避免核酸外切酶和核糖核酸酶的降解作用，因此更加保守和穩(wěn)定。張艷娜等[9]研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001785的表達(dá)與乳腺癌增殖、轉(zhuǎn)移有關(guān)。鑒此，本文通過檢測乳腺癌及乳腺良性腫瘤患者血清中的hsa_circ_0001785表達(dá)水平，探討hsa_circ_0001785作為乳腺癌診斷標(biāo)志物的應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選擇2021年9月至2022年3月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院甲乳外科收治的乳腺癌患者43例(乳腺癌組)，年齡20～79(52.00±12.00)歲；乳腺良性腫瘤患者54例(良性腫瘤組)，年齡18～63(35.00±11.00)歲，均經(jīng)病理檢查明確診斷。收集同期于健康體檢中心接受健康體檢的健康者45名(健康對(duì)照組)，年齡19～72(36.00±11.00)歲。通過醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)收集乳腺癌組患者的臨床資料。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(KY01-2022-02-09)，研究對(duì)象知情同意。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)乳腺癌組：符合《中國抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌診治指南與規(guī)范(2019年版)》[10]中關(guān)于乳腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)良性腫瘤組：經(jīng)影像學(xué)或組織病理學(xué)檢查確診為良性腫瘤；(3)健康對(duì)照組：①無乳腺功能障礙性疾??；②無良惡性腫瘤病史；③免疫腫瘤標(biāo)志物CEA、CA153、癌抗原125(cancer antigen 125，CA125)結(jié)果在正常參考范圍值內(nèi)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)腫瘤廣泛全身性轉(zhuǎn)移；(2)合并其他部位腫瘤；(3)合并嚴(yán)重器官功能障礙；(4)預(yù)計(jì)生存期<3個(gè)月；(5)妊娠期婦女；(6)已進(jìn)行腫瘤治療。

1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

1.3.1 實(shí)驗(yàn)儀器 微量分光光度計(jì)(型號(hào)：Nano-300，ALLSHENG杭州奧盛儀器有限公司)，羅氏Cobas e801全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光分析儀，基因擴(kuò)增儀[規(guī)格型號(hào)：TC-96/G/H(b)C]，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(規(guī)格型號(hào)：Cobas z480，美國)，離心管、渦旋震蕩器，離心機(jī)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)試劑 游離RNA提取試劑盒[GSPureTM Cell-Free RNA(cf RNA) l solation Kit，吉賽生物，中國]，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Hifair Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit，YEASEN Biotech Co.)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)試劑盒(AceQ? qPCR SYBR Green Master Mix，諾唯贊生物)。CEA、CA153、CA125檢測試劑盒(羅氏診斷公司，電化學(xué)發(fā)光法)。

1.4血清CEA、CA153、CA125檢測 收集研究對(duì)象外周血4 ml，3 000 r/min離心5 min，收集血清，-20 ℃保存?zhèn)錂z。通過電化學(xué)發(fā)光法檢測血清CEA、CA153、CA125表達(dá)水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5hsa_circ_0001785水平檢測 使用游離RNA提取試劑盒提取研究對(duì)象血清樣本的總RNA，并用分光光度計(jì)檢測其純度。通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行qPCR，反應(yīng)體系為：cDNA 3 μl，上、下游引物各0.4 μl，2×SYBR Green Master Mix 10 μl，dH2O 6.2 μl。qPCR條件為：95 ℃預(yù)變性反應(yīng)5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 32 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。根據(jù)2-ΔΔCt法，以U6為內(nèi)參計(jì)算hsa_circ_0001785相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1三組血清hsa_circ_0001785表達(dá)水平比較 qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三組血清hsa_circ_0001785表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.926，P=0.003)。乳腺癌組血清hsa_circ_0001785表達(dá)水平顯著高于良性腫瘤組和健康對(duì)照組(P<0.05)，良性腫瘤組和健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

乳腺癌組 vs 良性腫瘤組，*P=0.027；乳腺癌組 vs 健康對(duì)照組，**P=0.006；良性腫瘤組 vs 健康對(duì)照組，P=0.821

2.2血清hsa_circ_0001785與腫瘤標(biāo)志物CEA、CA125、CA153診斷乳腺癌的效能分析結(jié)果 納入乳腺癌患者(乳腺癌組)和非乳腺癌患者(良性腫瘤組+健康對(duì)照組)數(shù)據(jù)進(jìn)行ROC曲線分析，結(jié)果顯示，血清hsa_circ_0001785、CEA、CA125均具有良好的乳腺癌診斷效能(P<0.05)，且以hsa_circ_0001785診斷效能最佳(AUC=0.780)。見圖2，表2。

圖2 血清hsa_circ_0001785與腫瘤標(biāo)志物CEA、CA125、CA153診斷乳腺癌的ROC曲線圖

表2 血清hsa_circ_0001785與腫瘤標(biāo)志物CEA、CA125、CA153診斷乳腺癌的ROC曲線分析結(jié)果

2.3乳腺癌患者血清hsa_circ_0001785與腫瘤標(biāo)志物CEA、CA125、CA153的相關(guān)性分析結(jié)果 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，乳腺癌患者血清hsa_circ_0001785與腫瘤標(biāo)志物CEA、CA125、CA153均無顯著相關(guān)性(r=-0.126，P=0.303；r=-0.140，P=0.271；r=-0.131，P=0.305)。

2.4乳腺癌患者血清hsa_circ_0001785表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 43例乳腺癌患者血清hsa_circ_0001785的表達(dá)水平與其年齡、腫瘤類型、TNM分期、淋巴結(jié)受累、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)、人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)均無顯著關(guān)聯(lián)(P>0.05)。見表3。

表3 乳腺癌患者血清hsa_circ_0001785表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果[M(P25，P75)]

3 討論

3.1乳腺癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，在世界范圍內(nèi)每年約有140萬例患者被確診為乳腺癌，因乳腺癌死亡的女性患者達(dá)50萬例[11]。近年來，隨著診斷和治療策略的不斷發(fā)展，乳腺癌的死亡率逐年下降，但乳腺癌仍是導(dǎo)致女性癌癥死亡的主要原因[12]。乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展是多因素共同作用的結(jié)果。研究表明，circRNA的異常表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[13]。血液腫瘤標(biāo)志物的檢測樣本易于獲得，且采樣創(chuàng)傷小，目前應(yīng)用較多的乳腺癌腫瘤標(biāo)志物有CEA、CA125、CA153等，但其特異性和靈敏性均不夠理想。本研究結(jié)果也顯示CEA、CA125、CA153診斷乳腺癌的特異度高，但靈敏度低，對(duì)乳腺癌的早期診斷價(jià)值不大。

3.2circRNA是一類高度穩(wěn)定的非編碼RNA，circRNA的共價(jià)環(huán)狀閉合結(jié)構(gòu)使其不易被核酸酶降解，不僅生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，而且具有時(shí)空特異性、生物進(jìn)化保守性等優(yōu)點(diǎn)[14]。circRNA可以作為miRNA“海綿”，通過競爭性結(jié)合miRNA，降低miRNA對(duì)其靶基因的抑制作用，從而調(diào)節(jié)基因和蛋白的表達(dá)，參與多種生理和病理過程[15]。隨著基因芯片和高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)包括circRNA在內(nèi)的非編碼RNA的差異表達(dá)有望成為乳腺癌早期篩查的生物標(biāo)志物及潛在的治療靶點(diǎn)[16]。研究表明，大部分circRNA來源于編碼基因和全外顯子，可以翻譯并編碼蛋白質(zhì)[17]。circRNA的功能包括：(1)充當(dāng)miRNA“海綿”。circRNA上存在miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，可以與miRNA結(jié)合從而調(diào)控腫瘤的生長發(fā)育過程。(2)調(diào)控宿主基因的表達(dá)。circRNA通過與RNA相互作用，參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。(3)翻譯蛋白質(zhì)。雖然大多數(shù)circRNA不具有結(jié)合核糖體進(jìn)行翻譯的能力，但研究數(shù)據(jù)顯示少數(shù)內(nèi)源性circRNA可以通過N6-甲基腺苷修飾或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry site，IRES)被翻譯成蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)而發(fā)揮作用[18]。

3.3由于circRNA呈閉合環(huán)狀，故在生物體內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性[14]，有較好的臨床應(yīng)用前景。越來越多的研究表明circRNA與多種腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，并在乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)了多種有差異表達(dá)的circRNA[19]。Zhou等[20]通過對(duì)乳腺癌組織和癌旁組織進(jìn)行高通量RNA測序發(fā)現(xiàn)有85個(gè)circRNAs在乳腺癌組織中表達(dá)升高，67個(gè)circRNAs在乳腺癌組織中表達(dá)降低；且沉默hsa_circ_0011946可以抑制復(fù)制因子C亞基3(replication factor C subunit 3，RFC3)的表達(dá)，沉默hsa_circ_0011946可以抑制乳腺癌細(xì)胞MCF7的遷移和侵襲。Wang等[21]通過對(duì)乳腺癌組織和癌旁組織進(jìn)行微陣列芯片分析發(fā)現(xiàn)circRNA-000911在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯降低，作為miR-449a的“分子海綿”，circRNA-000911通過“吸收”miR-449a從而調(diào)控miR-449a對(duì)Notch1基因的抑制作用，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。Tang等[22]發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001982在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)水平明顯升高，下調(diào)hsa_circ_0001982可以提高miR-143的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。Liang等[23]發(fā)現(xiàn)circ-ABCB10在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著升高，沉默circ-ABCB10可以上調(diào)miR-1271的表達(dá)進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞MCF7細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。

3.4hsa_circ_0001785是最近新發(fā)現(xiàn)的癌癥相關(guān)circRNA。Yin等[24]通過對(duì)乳腺癌患者和健康志愿者的血漿樣本進(jìn)行circRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0001785在乳腺癌患者血漿中表達(dá)異常，且與患者的組織學(xué)分級(jí)(P=0.013)、TNM分期(P=0.008)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.016)存在顯著關(guān)聯(lián)，可以作為診斷乳腺癌的生物標(biāo)志物(AUC=0.784)。本研究結(jié)果也顯示，hsa_circ_0001785在乳腺癌患者血清中呈高表達(dá)，且具有診斷乳腺癌的應(yīng)用價(jià)值(AUC=0.780)，且診斷效能較CEA、CA125、CA153更優(yōu)。值得注意的是，本研究中CEA、CA125、CA153對(duì)乳腺癌的診斷特異度達(dá)100%。但在常規(guī)腫瘤篩查中，CEA、CA125、CA153并不是乳腺癌的特異性指標(biāo)，其結(jié)果異常并不能排除其他腫瘤的發(fā)生。因此，可以考慮將hsa_circ_0001785與CEA、CA125、CA153進(jìn)行聯(lián)合檢測，從而提高早期乳腺癌的檢出率。

3.5有研究顯示circRNA的表達(dá)與乳腺癌的腫瘤分期、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、ER陽性密切相關(guān)[24]。但在本研究中，血清hsa_circ_0001785的表達(dá)水平并未顯示出與乳腺癌患者年齡、腫瘤類型、TNM分期、淋巴結(jié)受累、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、ER、PR、HER2等臨床特征具有顯著關(guān)聯(lián)。這可能與本研究為回顧性研究，部分患者的臨床指標(biāo)信息缺失等有關(guān)，而且本研究納入分析的病例數(shù)較少，這也對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果造成了一定的影響，故仍需繼續(xù)擴(kuò)大樣本量通過前瞻性研究來進(jìn)一步驗(yàn)證hsa_circ_0001785與患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性。

綜上所述，血清高水平表達(dá)的hsa_circ_0001785與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，其在乳腺惡性腫瘤患者和良性腫瘤患者間的表達(dá)亦存在差異，這使hsa_circ_0001785有望成為診斷乳腺癌的新標(biāo)志物，但關(guān)于hsa_circ_0001785在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。