高薇薇， 王 梟， 關(guān) 鵬(綜述)， 高萬朋(審校)

膿毒癥是指因感染引起的宿主反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙[1]。而腸道被描述為膿毒癥和器官衰竭的“發(fā)動機”[2]。雖然膿毒癥的發(fā)病機制復(fù)雜，但許多研究表明腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cells，IECs)凋亡增加由促炎細(xì)胞因子和干擾素[3]的分泌增強所致，并最終導(dǎo)致腸屏障功能障礙，造成腸道菌群失調(diào)可引起腸道黏膜屏障受損，內(nèi)毒素及致病菌可入血，引起機體產(chǎn)生炎性介質(zhì)釋放誘發(fā)人體一系列炎癥和免疫反應(yīng)[4]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)了一種新的胞質(zhì)DNA傳感器環(huán)鳥苷酸腺苷酸合酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthetase,cGAS)以及干擾素基因的刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)。越來越多的研究表明，該信號通路的激活對于宿主抵御病毒、細(xì)菌感染以及癌癥至關(guān)重要，特別是與腸道穩(wěn)態(tài)有關(guān)，過度激活可以導(dǎo)致腸屏障功能障礙[5]。因此，深入了解膿毒癥發(fā)生時cGAS-STING信號通路激活及作用機制，對于改善膿毒癥腸屏障功能障礙具有重要意義。本文就cGAS-STING信號通路的激活、cGAS-STING信號通路與膿毒癥腸道炎癥反應(yīng)和cGAS-STING信號通路對腸屏障功能的影響作一綜述。

1 cGAS-STING信號通路的激活

STING是一種參與對細(xì)菌產(chǎn)物先天免疫應(yīng)答的適配器蛋白，存在于各種細(xì)胞類型中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，包括上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。在膿毒癥期間，病原體相關(guān)分子模式蛋白(pathogen-associated molecular pattern molecules,PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)表達在入侵的組織器官上，并且以受體識別模式(pattern recognition receptors,PRRs)的方式被腸道識別并激活STING信號，將微生物的胞質(zhì)傳感與宿主細(xì)胞的效應(yīng)功能聯(lián)系起來。除了微生物感應(yīng)之外，STING也能被宿主自身脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)激活[6]。刺激STING信號環(huán)二核苷酸(cyclic dinucleotides,CDNs)是重要的細(xì)菌代謝產(chǎn)物，而DNA存在于大多數(shù)微生物中，在核DNA(nuclear DNA,nDNA)損傷或線粒體斷裂后，nDNA或線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，這兩種微生物被cGAS及其第二信使環(huán)鳥苷酸腺苷酸(cyclic GMP-AMP,cGAMP)識別[7-8]。cGAMP可通過體積調(diào)節(jié)的陰離子通道或縫隙連接易位到鄰近細(xì)胞，導(dǎo)致鄰近細(xì)胞的STING激活[9]。在與cGAMP結(jié)合后，STING通過高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基中間室運輸，最終轉(zhuǎn)移到核周區(qū)域的囊泡中。激活的STING隨后招募TANK結(jié)合激酶1(TANK- binding kinase 1,TBK1)，并磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)和核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)。這些轉(zhuǎn)錄因子能夠從細(xì)胞質(zhì)易位到細(xì)胞核，誘導(dǎo)先天免疫基因轉(zhuǎn)錄，有助于最終產(chǎn)生Ⅰ型干擾素(interferon-Ⅰ,IFN-Ⅰ)和其他炎性細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)。cGAS-STING介導(dǎo)的炎癥、IFN-Ⅰ反應(yīng)和細(xì)胞死亡可能導(dǎo)致或加重膿毒癥和膿毒性休克的發(fā)病[10]。

2 cGAS-STING信號通路與膿毒癥腸道炎癥反應(yīng)

膿毒癥的急性期表現(xiàn)為對感染的炎癥反應(yīng)以及過度釋放促炎介質(zhì)。因此，抑制免疫反應(yīng)的關(guān)鍵炎癥調(diào)節(jié)因子可能有助于治療膿毒癥。cGAS-STING途徑的不當(dāng)激活或過度激活可產(chǎn)生大量IFN-Ⅰ，釋放至細(xì)胞外的IFN-Ⅰ能夠以自分泌或旁分泌的方式，結(jié)合自身或者周圍細(xì)胞上的IFN-Ⅰ受體(IFN α receptor,IFNAR)，進一步激活其下游JAK-STAT通路，誘導(dǎo)數(shù)百個干擾素刺激基因(IFN- stimulated genes,ISGs)的表達，導(dǎo)致自身炎癥和自身免疫性疾病[11-12]。Aden等[13]表明，IECs中激活的STING信號可誘導(dǎo)強烈的TNF-α和ISGs反應(yīng)，從而導(dǎo)致過度的回腸炎癥和廣泛的上皮細(xì)胞壞死。有研究認(rèn)為，由cGAS觸發(fā)的IFN-Ⅰ也可以通過干擾素受體信號再次誘導(dǎo)cGAS的表達，IFN-Ⅰ過度激活導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂[14]。而STING激動劑可以激活STING，加重了膿毒癥大鼠的腸黏膜損傷，證明了STING信號的激活加重了膿毒癥腸道損傷和腸道屏障紊亂[12]。此外，研究證實NF-κB具有調(diào)控復(fù)雜的炎癥細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的重要作用，NF-κB由STING激活后，進入細(xì)胞核，調(diào)控TNF-α和IL-1等炎癥介質(zhì)的基因表達，進一步作用于巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生大量IL-6、IL-8等繼發(fā)性細(xì)胞因子和介質(zhì)。與此同時，STING可以誘發(fā)釋放IL-10等抗炎細(xì)胞因子[15]，進一步激活NF-κB，從而形成正反饋的級聯(lián)放大效應(yīng)，產(chǎn)生過度的炎癥反應(yīng)，加重組織和細(xì)胞的損害。因此，需要表達免疫負(fù)調(diào)控因子準(zhǔn)確、適時地調(diào)整胞內(nèi)信號通路的激活，避免發(fā)生過強的免疫反應(yīng)，從而保證機體免疫平衡。對cGAS-STING通路的負(fù)向調(diào)控還可減少其他炎癥因子如IL-6、TNF-α表達，減輕細(xì)胞因子風(fēng)暴及組織損傷程度[16]，這為治療膿毒癥腸道炎癥損傷提供了新的思路。

3 cGAS-STING信號通路對腸屏障功能的影響

3.1cGAS-STING信號通路對腸道通透性的影響 腸道的內(nèi)部是由IECs構(gòu)成，IECs可以起到隔絕內(nèi)部組織與外界接觸的作用，并且可以吸收食物中的營養(yǎng)物質(zhì)，與腸道內(nèi)的微生物接觸，并且清除病原體、內(nèi)毒素和抗原物質(zhì)。當(dāng)這個過程受到干擾，腸道的穩(wěn)態(tài)被破壞繼而引發(fā)疾病。相鄰的IECs通過緊密連接(tight junctions,TJs)銜接，形成細(xì)胞旁密封以防止親水分子的混合物進入并能夠通過PRRs的方式識別細(xì)菌，通過分泌趨化因子將這些信息傳遞給免疫系統(tǒng)的細(xì)胞[17]。TJs是由完整的膜蛋白，包括閉鎖蛋白(claudins)、胞質(zhì)附著蛋白(occludin)、連接黏附分子(junctional adhesion molecules,JAMs)和閉鎖小帶蛋白-1(zonula occluden-1,ZO-1)組成的多蛋白復(fù)合物連接到肌動蛋白細(xì)胞骨架。TJs在調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞通透性中發(fā)揮著重要作用。STING的激活啟動IRF3和NF-κB，導(dǎo)致IFN-Ⅰ和炎癥細(xì)胞因子的表達增強[11]。其中TNF-α是膿毒癥最重要的炎癥因子，而IECs是其攻擊的主要靶細(xì)胞。TNF-α通過與IECs上表達的TNF受體2結(jié)合，誘導(dǎo)炎癥過程中的肌球輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)上調(diào)，可以使肌球蛋白鉛磷酸化導(dǎo)致細(xì)胞骨架收縮和中斷，上調(diào)ZO-1、occludin受阻，并且導(dǎo)致黏液層的破壞，TJs改變，使得上皮通透性增加，導(dǎo)致細(xì)菌易位[18]。在Hu等[12]的研究中，膿毒癥大鼠模型，STING敲除組相對于膿毒癥組的ZO-1和claudins水平顯著升高，并且發(fā)現(xiàn)了TJs改善，證明了cGAS-STING信號可以造成TJs改變，導(dǎo)致腸道通透性增加，最終造成腸道菌群易位。

3.2細(xì)胞死亡 在膿毒癥急性期，不受控制的程序性細(xì)胞死亡導(dǎo)致多器官衰竭或免疫抑制的發(fā)展[19]。細(xì)胞死亡(包括凋亡、焦亡和壞死性凋亡)，是調(diào)節(jié)細(xì)菌感染的膿毒癥反應(yīng)的關(guān)鍵。細(xì)胞死亡是組織發(fā)育和平衡的關(guān)鍵過程，以消除多余的、損傷的或老化的細(xì)胞，是急性或慢性損傷后穩(wěn)態(tài)重建的關(guān)鍵，限制炎癥刺激的傳播，以防止組織功能的喪失，這對胃腸道特別重要。因此，上皮細(xì)胞的更新和細(xì)胞死亡需要被嚴(yán)格調(diào)控，不適當(dāng)?shù)募?xì)胞死亡反應(yīng)會導(dǎo)致疾病發(fā)展。這種穩(wěn)態(tài)功能反映了受損或衰老細(xì)胞的消除以及死亡細(xì)胞暴露或釋放激活免疫反應(yīng)的DAMPs的能力[20]。有研究表明，STING不僅介導(dǎo)細(xì)胞死亡，而且在識別和放大死亡細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用[21]。

3.2.1 凋亡 細(xì)胞凋亡被定義為依賴半胱氨酸蛋白酶(caspase)激活的程序性死亡過程。IECs凋亡被認(rèn)為是腸道屏障功能障礙的關(guān)鍵加速劑之一。最近的研究評估了STING信號通路在凋亡激活中的新作用。Diner等[22]證明cGAS依賴的免疫信號進一步誘導(dǎo)caspase-3的激活，通過激活STING-TBK1-IRF3通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。mtDNA尤其可能通過STING信號在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。mtDNA的釋放，從而激活cGAS-STING通路，促進IFNs的產(chǎn)生，繼而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]。在膿毒癥小鼠模型中，mtDNA水平的升高可誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞中STING依賴性的凋亡[12]。STING介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的機制主要與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后產(chǎn)生的標(biāo)志物以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣信號通路增強了細(xì)胞對凋亡的敏感性相關(guān)[24]。綜上，STING1-IRF3通路既參與凋亡來源的免疫反應(yīng)，也參與凋亡誘導(dǎo)。該通路可被caspase調(diào)控，而STING、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與凋亡之間的相互作用和反饋機制肯定是復(fù)雜的。

3.2.2 焦亡 焦亡是一種主要依賴caspase-11激活的程序性細(xì)胞死亡類型[25]，在炎癥和免疫中起核心作用。過度激活的焦亡可能導(dǎo)致膿毒癥、膿毒性休克以及器官功能障礙。免疫細(xì)胞內(nèi)的炎癥小體為促炎因子(IL-1β和IL-18)的成熟和產(chǎn)生提供了分子平臺。特別是炎癥小體招募caspase-1的過程有助于caspase-1的激活以及炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生和焦亡的啟動[26]。在其機制方面，可能有3種途徑參與了STING依賴的炎癥小體的激活和焦亡：(1)炎癥小體的轉(zhuǎn)錄上調(diào)需要STING介導(dǎo)的IRF3；(2)STING可以直接結(jié)合并促進炎癥小體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的定位，從而抑制炎癥小體的泛素降解[27]；(3)在對人髓系細(xì)胞中胞質(zhì)DNA的反應(yīng)中，cGAS-STING通路通過STING介導(dǎo)的溶酶體細(xì)胞死亡激活鉀外排介導(dǎo)的炎癥小體。這些表明cGAS-STING通路觸發(fā)與細(xì)胞質(zhì)DNA相關(guān)的焦亡和促炎反應(yīng)。

3.2.3 壞死性凋亡 壞死性凋亡是一種受調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡機制，由多種死亡受體、模式識別受體和細(xì)胞因子共同驅(qū)動，在許多炎癥和疾病狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。這種凋亡最初被報道與受體相互作用蛋白激酶(receptor interacting protein kinase,RIPK)1和RIPK3有關(guān)。刺激后，RIPK1和RIPK3被壞死體復(fù)合體中的自身磷酸化激活。隨后，混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)被招募并被RIPK3磷酸化，導(dǎo)致MLKL寡聚。寡聚MLKL轉(zhuǎn)運到細(xì)胞膜上，促進質(zhì)膜通透性，從而引發(fā)壞死性凋亡。RIPK3和MLKL目前被認(rèn)為是介導(dǎo)這種形式死亡的主要靶點，表明STING-IRF3-RIPK3-MLKL通路通過磷酸化機制驅(qū)動壞死性凋亡。此外，TNF-α的產(chǎn)生也參與了STING介導(dǎo)的壞死。Li等[16]的研究發(fā)現(xiàn)IFN-Ⅰ控制細(xì)胞凋亡、壞死和壞死性凋亡信號的關(guān)鍵介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。Zhang等[5]的研究揭示mtDNA介導(dǎo)的STING信號通過IFN-Ⅰ和TNF-α信號的協(xié)同作用觸發(fā)腸道細(xì)胞壞死性凋亡。cGAS-STING的激活可導(dǎo)致RIPK3介導(dǎo)的壞死性凋亡，這需要STING依賴的IFN-Ⅰ和TNF-α的產(chǎn)生?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，STING信號通路通過至少兩種機制觸發(fā)壞死，即誘導(dǎo)MLKL表達或MLKL磷酸化。此外，壞死性凋亡誘導(dǎo)的RIPK3釋放可能作為腸道損傷的生物標(biāo)志物[28]。

3.3自噬機制 自噬是抵御微生物侵襲的天然免疫防御機制，可通過抑制促炎復(fù)合物或增強受損細(xì)胞器的清除來保護IECs免受過度的炎癥刺激[29]，在細(xì)胞和組織的動態(tài)平衡中起重要作用，是一種有益的生命過程。自噬異常可導(dǎo)致腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡和慢性腸道炎性疾病的發(fā)生。有研究表明，STING激活伴隨著明顯促進的脂質(zhì)過氧化損傷，這也表明在這一時期發(fā)生了自噬的抑制[30]。隨著膿毒癥的發(fā)展，自噬活性逐漸下降[31]。因此，STING激活介導(dǎo)的自噬變化是臨床預(yù)后不良的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點。STING激活以IFN-Ⅰ依賴的方式干擾溶酶體酸化，而不影響自噬小體的生物發(fā)生或融合。然而，過度STING激活引起的副作用的機制仍有待進一步研究。循環(huán)中的mtDNA被巨噬細(xì)胞的STING途徑識別，導(dǎo)致溶酶體酸化功能障礙，并阻礙自噬是膿毒癥中遠(yuǎn)處器官損傷的另一種機制，與致病菌引起的感染性損傷同時發(fā)生[32]。beclin-1自噬蛋白與cGAS的直接相互作用不僅抑制STING信號，減少胞質(zhì)DNA刺激下的IFNs分泌，而且促進自噬介導(dǎo)的胞質(zhì)DNA降解，以防止cGAS過度激活。同樣，參與自噬機制的關(guān)鍵基因可以抑制STING-TBK1-IRF3通路，有效抑制持續(xù)免疫反應(yīng)和過度炎癥[11]。這些發(fā)現(xiàn)為通過誘導(dǎo)自噬或抑制STING途徑減輕膿毒癥腸道損傷，改善腸屏障功能提供了新的見解。

3.4NLRP3炎癥小體 NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體是先天免疫系統(tǒng)的重要中介途徑。NLRP3炎癥小體成分主要包括3個成員：凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein,ASC)、NLRP3和凋亡細(xì)胞蛋白酶原(procaspase)-1[33]。硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)是一種內(nèi)源性活性氧(reactive oxygen species,ROS)抑制劑清除蛋白，當(dāng)細(xì)胞受到PAMPs和DAMPs誘導(dǎo)的ROS挑戰(zhàn)時，它將與TXNIP-硫氧還蛋白(TXNIP-thioredoxin,Trx)復(fù)合物分離，并與NLRP3結(jié)合。隨后，NLRP3/TXNIP復(fù)合物招募其他2個成員(ASC和procaspase-1)，形成NLRP3炎癥小體，促進caspase-1的激活，IL-18和IL-1β的產(chǎn)生，以及炎癥和細(xì)胞焦亡的啟動[34]。然而，STING在膿毒癥腸屏障功能障礙中的作用及其對NLRP3的潛在調(diào)控作用至今尚未得到很好的研究。NLRP3的表達可以通過STING-IRF3依賴的方式被激活，Li等[35]研究了STING通過激活NLRP3信號通路導(dǎo)致脂多糖誘導(dǎo)的組織功能障礙、炎癥、凋亡和焦亡。此外，抑制cGAS也阻斷了STING和NLRP3炎癥小體的激活。膿毒癥狀態(tài)下，機體NLRP3炎癥小體及下游分子高表達，通過增加促炎因子的成熟釋放及誘導(dǎo)凋亡反應(yīng)，參與調(diào)控膿毒癥免疫反應(yīng)，與器官功能障礙及不良預(yù)后密切相關(guān)。

4 結(jié)語

cGAS-STING信號通路在腸道穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。在膿毒癥中，CDNs和mtDNA激活cGAS-STING通路誘導(dǎo)的過度炎癥反應(yīng)，造成TJs破壞、IECs死亡、阻斷自噬以及誘導(dǎo)炎癥小體形成，導(dǎo)致腸屏障完整性損傷，腸道通透性增加以及菌群易位，最終造成腸屏障功能障礙。這些過程不僅放大了STING信號通路的激活，還可以誘導(dǎo)嚴(yán)重的全身炎癥反應(yīng)，兩者都可能導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴和加重膿毒癥多臟器功能障礙。因此，阻斷cGAS-STING信號通路可能是調(diào)節(jié)膿毒癥過度炎癥反應(yīng)和腸道屏障功能障礙的潛在治療方法和作用靶點。這可能為膿毒癥的發(fā)病機制及治療提供新的思路。