王 倩， 葉 力， 王 捷， 周 波， 覃秋珍， 詹妤婕， 劉 欣， 劉 潔， 梁 浩

獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)是由人類(lèi)免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染引起機(jī)體免疫功能?chē)?yán)重受損的重大傳染性疾病，易導(dǎo)致機(jī)會(huì)性感染的發(fā)生[1-2]。據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委統(tǒng)計(jì)，2021年我國(guó)共報(bào)告新發(fā)AIDS 60 154例，死亡19 623例，報(bào)告死亡數(shù)居乙類(lèi)傳染病之首[3]，防治形勢(shì)仍十分嚴(yán)峻。目前，高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy,HAART)是針對(duì)HIV/AIDS患者最有效的治療手段，但在HAART治療過(guò)程中易產(chǎn)生一系列不良反應(yīng)[4]，且會(huì)出現(xiàn)耐藥性[5]等問(wèn)題，在一定程度上限制了患者治療的依從性和臨床療效。我國(guó)有豐富的中草藥資源，近30年來(lái)，中醫(yī)藥在緩解艾滋病患者HAART不良反應(yīng)[6]、降低耐藥風(fēng)險(xiǎn)[7]及促進(jìn)機(jī)體免疫功能恢復(fù)[8]等方面取得了長(zhǎng)足發(fā)展。芒果葉是漆樹(shù)科芒果屬植物MangiferaindicaL.的葉片，在我國(guó)廣西、云南等地分布較廣[9]。有研究顯示，芒果葉提取物有廣泛的生物活性，包括免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等，其乙醇提取物能通過(guò)抑制淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等的氧化應(yīng)激來(lái)發(fā)揮免疫保護(hù)作用[10-12]。不少研究發(fā)現(xiàn)具有抗氧化作用的中草藥物具有抗HIV-1功能[13-15]。鑒此，本研究通過(guò)TZM-bl-HIV-1ⅢB和MT-2-HIV-1ⅢB兩種細(xì)胞-病毒感染模型探討芒果葉乙醇提取物的抗HIV-1活性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1芒果葉提取物制備 芒果葉乙醇提取物由廣西醫(yī)科大學(xué)制藥廠制備。制備方法：稱(chēng)取芒果葉100 g，加入30%乙醇1 000 ml，加熱回流2 h，加熱溫度65～75 ℃。取殘?jiān)僦貜?fù)提取2次，1.5 h/次，共提取3次。收集全部提取液過(guò)濾，濾液靜置24 h，取上清液濃縮，濃縮溫度60～75 ℃。真空度-0.05～-0.08 MPa。收集濃縮液進(jìn)一步于65～75 ℃環(huán)境下干燥至浸膏，即得芒果葉提取物。

1.2細(xì)胞和病毒株 TZM-bl細(xì)胞、MT-2細(xì)胞及HIV-1ⅢB毒株均在本課題組實(shí)驗(yàn)室保存，病毒活性實(shí)驗(yàn)在廣西醫(yī)科大學(xué)生物安全三級(jí)(BSL-3)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，具備相關(guān)資質(zhì)。

1.3主要實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM高糖培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和胰蛋白酶-EDTA(0.25%，含酚紅)購(gòu)自Gibco公司。1×PBS液(pH7.2～7.4)、100×青霉素-鏈霉素混合液購(gòu)自Solarbio公司。CellTiter-Glo? Luminescent Cell Viability試劑、Bright-Glo Luciferase Assay試劑購(gòu)自Promega公司。齊多夫定(azidothymidine，AZT)購(gòu)自Sigma公司。

1.4儀器設(shè)備 生物安全柜(Thermo公司)、恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)、全功能酶標(biāo)儀(BioTek，Synergy H1，美國(guó)BioTek公司)、普通倒置顯微鏡(日本Nikon公司)、全自動(dòng)細(xì)胞成像儀(EVOSTMFL Auto 2 Imaging System，Thermo公司)等。

1.5三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)法測(cè)定芒果葉提取物的體外細(xì)胞毒性

1.5.1 TZM-bl細(xì)胞體外毒性實(shí)驗(yàn) 取調(diào)整濃度為1×105cells/ml的TZM-bl細(xì)胞接種至96孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)組分別加入梯度稀釋的芒果葉提取物(272.00 μg/ml、54.40 μg/ml、10.88 μg/ml、2.18 μg/ml、0.44 μg/ml、0.09 μg/ml、0.02 μg/ml)和AZT(10.00 μM、2.00 μM、0.40 μM、0.08 μM、0.016 μM、0.003 2 μM、0.000 64 μM)，對(duì)照組不加藥物，只加入同體積DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入CellTiter-Glo?試劑，應(yīng)用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)化學(xué)發(fā)光數(shù)值(RLU值)。相對(duì)細(xì)胞活性(%)=(實(shí)驗(yàn)孔發(fā)光數(shù)值-空白背景孔發(fā)光數(shù)值)/(細(xì)胞對(duì)照孔發(fā)光數(shù)值-空白背景孔發(fā)光數(shù)值)×100%。當(dāng)相對(duì)細(xì)胞活性<80%時(shí)可認(rèn)為藥物存在細(xì)胞毒性。

1.5.2 MT-2細(xì)胞體外毒性實(shí)驗(yàn) 取調(diào)整濃度為2×105cells/ml的MT-2細(xì)胞接種至96孔板，采用1640培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，其余操作步驟同方法1.5.1。

1.6測(cè)定芒果葉提取物的體外抗HIV-1病毒活性

1.6.1 TZM-bl-HIV-1ⅢB細(xì)胞模型 取調(diào)整濃度為1×105cells/ml的TZM-bl細(xì)胞接種至96孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后加入HIV-1ⅢB病毒稀釋液(MOI=0.01)以及梯度濃度的芒果葉提取物和AZT，陽(yáng)性對(duì)照組僅加入病毒稀釋液，陰性對(duì)照組只加入同體積DMEM培養(yǎng)液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入Bright-Glo試劑在多功能酶標(biāo)儀上檢測(cè)化學(xué)發(fā)光數(shù)值(RLU值)。相對(duì)病毒水平(%)=(實(shí)驗(yàn)孔發(fā)光數(shù)值-陰性對(duì)照孔發(fā)光數(shù)值)/(陽(yáng)性對(duì)照孔發(fā)光數(shù)值-陰性對(duì)照孔發(fā)光數(shù)值)×100%。

1.6.2 MT-2-HIV-1ⅢB細(xì)胞模型 取調(diào)整濃度為2×105cells/ml的MT-2細(xì)胞，加入HIV-1ⅢB病毒液(MOI=0.01)混勻后接種至96孔板，根據(jù)組別設(shè)置分別加入梯度濃度的芒果葉提取物和AZT，培養(yǎng)72 h后吸取上清液轉(zhuǎn)移至提前1 d接種好TZM-bl細(xì)胞的孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，余下操作和步驟同方法1.6.1。

1.7HIV-1誘導(dǎo)細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE)的抑制作用觀察 取方法1.6.2培養(yǎng)72 h后的96孔板(MT-2細(xì)胞+HIV-1ⅢB毒株)，使用全自動(dòng)細(xì)胞成像儀觀察不同濃度的芒果葉提取物處理后HIV-1誘導(dǎo)的CPE，并拍照記錄。CPE的判斷標(biāo)準(zhǔn)[16]：視野內(nèi)無(wú)細(xì)胞病變?yōu)殛幮?-)，有25%細(xì)胞病變?yōu)槿蹶?yáng)性(+)，50%細(xì)胞病變?yōu)殛?yáng)性(++)，75%細(xì)胞病變?yōu)閺?qiáng)陽(yáng)性(+++)，100%細(xì)胞病變?yōu)槌瑥?qiáng)陽(yáng)性(++++)。

2 結(jié)果

2.1芒果葉提取物在TZM-bl-HIV-1ⅢB模型中的體外細(xì)胞毒性和抗HIV-1活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在TZM-bl-HIV-1ⅢB模型中，芒果葉提取物的最大無(wú)毒性濃度為54.40 μg/ml，在安全濃度范圍內(nèi)能抑制HIV-1的復(fù)制，相對(duì)病毒水平隨著藥物的濃度升高而降低，呈劑量依賴性(見(jiàn)圖1)。陽(yáng)性對(duì)照藥物AZT在最大實(shí)驗(yàn)濃度下對(duì)TZM-bl的細(xì)胞活性幾乎不產(chǎn)生影響，相對(duì)病毒水平隨AZT的濃度升高呈下降趨勢(shì)，呈劑量依賴性(見(jiàn)圖2)。該模型的CC50和IC50見(jiàn)表1。

圖1 芒果葉提取物在TZM-bl-HIV-1ⅢB模型中的體外細(xì)胞毒性和抗HIV-1活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

圖2 AZT在TZM-bl-HIV-1ⅢB模型中的體外細(xì)胞毒性和抗HIV-1活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

2.2芒果葉提取物在MT-2-HIV-1ⅢB模型中的體外細(xì)胞毒性和抗HIV-1活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在MT-2-HIV-1ⅢB模型中，芒果葉提取物的最大無(wú)毒性濃度為54.40 μg/ml，在安全濃度范圍內(nèi)能抑制HIV-1的復(fù)制，相對(duì)病毒水平隨著藥物的濃度升高而降低，呈劑量依賴性(見(jiàn)圖3)。陽(yáng)性對(duì)照藥物AZT在最大實(shí)驗(yàn)濃度下對(duì)MT-2的細(xì)胞活性幾乎不產(chǎn)生影響，相對(duì)病毒水平隨AZT的濃度升高呈下降趨勢(shì)，呈劑量依賴性(見(jiàn)圖4)。該模型的CC50和IC50見(jiàn)表1?？傮w來(lái)看，芒果葉提取物和AZT在TZM-bl-HIV-1ⅢB模型中的抗病毒效果較在MT-2-HIV-1ⅢB模型中更為顯著。

圖3 芒果葉提取物在MT-2-HIV-1ⅢB模型中的體外細(xì)胞毒性和抗HIV-1活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

圖4 AZT在MT-2-HIV-1ⅢB模型中的體外細(xì)胞毒性和抗HIV-1活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

表1 兩種細(xì)胞-病毒模型中芒果葉提取物和AZT的CC50、IC50和SI

2.3芒果葉提取物抑制HIV-1誘導(dǎo)CPE的情況 在MT-2-HIV-1ⅢB模型中，當(dāng)芒果葉提取物的濃度為54.40 μg/ml時(shí)，可觀察到MT-2細(xì)胞內(nèi)僅有極少的合胞體形成(見(jiàn)圖5?)；當(dāng)濃度為10.88 μg/ml時(shí)，能觀察到少量的合胞體(見(jiàn)圖5?)。而未加入藥物的陽(yáng)性對(duì)照孔可見(jiàn)大量的合胞體(見(jiàn)圖5?)；未加入HIV-1ⅢB和藥物的陰性對(duì)照孔則無(wú)合胞體形成(見(jiàn)圖5?)。見(jiàn)表2，圖5。

表2 不同干預(yù)組HIV-1誘導(dǎo)的CPE情況

?芒果葉提取物濃度為272.00 μg/ml，大部分細(xì)胞死亡，CPE陰性(-)；?芒果葉提取物濃度為54.40 μg/ml，CPE弱陽(yáng)性(+)；?芒果葉提取物濃度為10.88 μg/ml，CPE陽(yáng)性(++)；?芒果葉提取物濃度為0.44 μg/ml，CPE強(qiáng)陽(yáng)性(+++)；?芒果葉提取物濃度為0.09 μg/ml，CPE超強(qiáng)陽(yáng)性(++++)；?陽(yáng)性對(duì)照孔，CPE超強(qiáng)陽(yáng)性(++++)；?陰性對(duì)照孔，CPE陰性(-)

3 討論

3.1聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署(United Nations Programme on HIV/AIDS，UNAIDS)報(bào)告顯示，2021年全球AIDS/HIV新發(fā)感染約150萬(wàn)例，死亡約65萬(wàn)例，現(xiàn)存HIV感染者約3 840萬(wàn)例[17]。AIDS仍是威脅全人類(lèi)生命安全的嚴(yán)重傳染性疾病之一，提高患者的HAART治療效果和生活質(zhì)量是目前關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。我國(guó)學(xué)者通過(guò)對(duì)中藥材庫(kù)進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了一些具有抑制HIV活性的藥物，包括黃連、金銀花、紫草、女貞子、肉桂等[18]。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這些提取物在抑制HIV活性或增強(qiáng)HIV/AIDS患者免疫功能方面均能起到一定的作用，如思茅松松塔提取物對(duì)HIV-1有很強(qiáng)的活性抑制作用[19]；黃芪提取物可降低HIV-1的感染能力[20]；鴉膽子提取物可通過(guò)上調(diào)抗HIV天然免疫因子蛋白的表達(dá)而發(fā)揮抑制HIV的作用[21]。芒果葉作為我國(guó)傳統(tǒng)的中草藥，不僅具有悠久的使用歷史，而且具有安全性好、原料易得、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)[22]。藥理研究表明，芒果葉有抗菌、抗腫瘤、抗氧化及抗炎等作用[23]，具有潛在的抗HIV藥物開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

3.2TZM-bl細(xì)胞和MT-2細(xì)胞均能穩(wěn)定表達(dá)HIV-1感染的相關(guān)受體，包括CD4、CXCR4等。TZM-bl細(xì)胞基因組內(nèi)攜帶了HIV-1長(zhǎng)末端重復(fù)序列(long terminal repeat，LTR)啟動(dòng)的熒光素酶和β-半乳糖苷酶的報(bào)告基因，在HIV-1感染時(shí)，受HIV-1 tat原件調(diào)控的熒光素酶報(bào)告基因能被激發(fā)表達(dá)，由此可以反映HIV-1感染和復(fù)制水平[24]。MT-2細(xì)胞是人類(lèi)T淋巴細(xì)胞白血病病毒Ⅰ型轉(zhuǎn)化的人淋巴瘤細(xì)胞，被合胞體誘導(dǎo)型(即SI型)毒株HIV-1ⅢB感染后，細(xì)胞之間可發(fā)生融合，形成多核巨細(xì)胞(合胞體)[25]，能直觀地體現(xiàn)病毒誘導(dǎo)的CPE。本研究采用TZM-bl-HIV-1ⅢB和MT-2-HIV-1ⅢB兩種細(xì)胞-病毒感染模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，芒果葉提取物在TZM-bl和MT-2兩種細(xì)胞中的CC50分別為320.00 μg/ml、174.13 μg/ml，均高于董宜旋和李靜[26]研究的三葉青提取物。在兩種細(xì)胞-病毒感染模型中，芒果葉提取物的最大無(wú)毒性濃度均為54.40 μg/ml，高于莫雨曉等[27]研究的石見(jiàn)穿乙醇提取物和謝磊等[28]研究的補(bǔ)骨脂乙醇提取物，說(shuō)明芒果葉提取物具有良好的安全劑量范圍。芒果葉提取物在兩種細(xì)胞-病毒感染模型中對(duì)HIV-1ⅢB的IC50均處于較低濃度水平，分別為8.86 μg/ml、15.23 μg/ml。雖然SI值受多種因素的影響，但通常情況下，化合物的SI值>10，則可認(rèn)為藥物具有較高的安全性[29]。本研究中，芒果葉提取物在兩種模型中的SI值均>10，以在TZM-bl-HIV-1ⅢB模型中的作用更為顯著，SI值=36.14，高于高麗娜等[30]研究的野棉花、木藤蓼等6種中草藥提取物。在兩種細(xì)胞模型中芒果葉提取物對(duì)抗HIV-1活性存在差異，但均能反映其對(duì)HIV的抑制效果，對(duì)于差異的產(chǎn)生可能是由于TZM-bl細(xì)胞和MT-2細(xì)胞本身增殖能力不同而造成的，這在以往的研究[31-32]中也有發(fā)現(xiàn)。此外，鏡下觀察可見(jiàn)芒果葉提取物能有效抑制HIV-1誘導(dǎo)的CPE，且呈劑量依賴性。綜上結(jié)果提示，芒果葉提取物具有潛在的抗HIV-1應(yīng)用價(jià)值。

3.3有研究顯示，芒果葉提取物在體外可抑制T細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，從而提高T細(xì)胞的存活率[33]，同時(shí)其主要成分芒果苷也可通過(guò)抑制淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的氧化應(yīng)激而發(fā)揮免疫保護(hù)作用[10]，由此推測(cè)其抗HIV-1活性可能與抗氧化及免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。芒果葉提取物抗HIV-1的機(jī)制仍需進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，芒果葉提取物具有顯著抗HIV-1活性，且安全性較好，在AIDS/HIV-1新藥研發(fā)中具有應(yīng)用前景，后續(xù)可進(jìn)一步提純分析，探討其具體的作用機(jī)制，以充分發(fā)揮中草藥資源的應(yīng)用價(jià)值。