王 倩， 葉 力， 王 捷， 周 波， 覃秋珍， 詹妤婕， 劉 欣， 劉 潔， 梁 浩

獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染引起機體免疫功能嚴重受損的重大傳染性疾病，易導致機會性感染的發(fā)生[1-2]。據(jù)國家衛(wèi)生健康委統(tǒng)計，2021年我國共報告新發(fā)AIDS 60 154例，死亡19 623例，報告死亡數(shù)居乙類傳染病之首[3]，防治形勢仍十分嚴峻。目前，高效抗逆轉錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy,HAART)是針對HIV/AIDS患者最有效的治療手段，但在HAART治療過程中易產(chǎn)生一系列不良反應[4]，且會出現(xiàn)耐藥性[5]等問題，在一定程度上限制了患者治療的依從性和臨床療效。我國有豐富的中草藥資源，近30年來，中醫(yī)藥在緩解艾滋病患者HAART不良反應[6]、降低耐藥風險[7]及促進機體免疫功能恢復[8]等方面取得了長足發(fā)展。芒果葉是漆樹科芒果屬植物MangiferaindicaL.的葉片，在我國廣西、云南等地分布較廣[9]。有研究顯示，芒果葉提取物有廣泛的生物活性，包括免疫調節(jié)、抗氧化等，其乙醇提取物能通過抑制淋巴細胞和巨噬細胞等的氧化應激來發(fā)揮免疫保護作用[10-12]。不少研究發(fā)現(xiàn)具有抗氧化作用的中草藥物具有抗HIV-1功能[13-15]。鑒此，本研究通過TZM-bl-HIV-1ⅢB和MT-2-HIV-1ⅢB兩種細胞-病毒感染模型探討芒果葉乙醇提取物的抗HIV-1活性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1芒果葉提取物制備 芒果葉乙醇提取物由廣西醫(yī)科大學制藥廠制備。制備方法：稱取芒果葉100 g，加入30%乙醇1 000 ml，加熱回流2 h，加熱溫度65～75 ℃。取殘渣再重復提取2次，1.5 h/次，共提取3次。收集全部提取液過濾，濾液靜置24 h，取上清液濃縮，濃縮溫度60～75 ℃。真空度-0.05～-0.08 MPa。收集濃縮液進一步于65～75 ℃環(huán)境下干燥至浸膏，即得芒果葉提取物。

1.2細胞和病毒株 TZM-bl細胞、MT-2細胞及HIV-1ⅢB毒株均在本課題組實驗室保存，病毒活性實驗在廣西醫(yī)科大學生物安全三級(BSL-3)實驗室開展，具備相關資質。

1.3主要實驗試劑 DMEM高糖培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和胰蛋白酶-EDTA(0.25%，含酚紅)購自Gibco公司。1×PBS液(pH7.2～7.4)、100×青霉素-鏈霉素混合液購自Solarbio公司。CellTiter-Glo? Luminescent Cell Viability試劑、Bright-Glo Luciferase Assay試劑購自Promega公司。齊多夫定(azidothymidine，AZT)購自Sigma公司。

1.4儀器設備 生物安全柜(Thermo公司)、恒溫CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)、全功能酶標儀(BioTek，Synergy H1，美國BioTek公司)、普通倒置顯微鏡(日本Nikon公司)、全自動細胞成像儀(EVOSTMFL Auto 2 Imaging System，Thermo公司)等。

1.5三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)法測定芒果葉提取物的體外細胞毒性

1.5.1 TZM-bl細胞體外毒性實驗 取調整濃度為1×105cells/ml的TZM-bl細胞接種至96孔板，細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h。實驗組分別加入梯度稀釋的芒果葉提取物(272.00 μg/ml、54.40 μg/ml、10.88 μg/ml、2.18 μg/ml、0.44 μg/ml、0.09 μg/ml、0.02 μg/ml)和AZT(10.00 μM、2.00 μM、0.40 μM、0.08 μM、0.016 μM、0.003 2 μM、0.000 64 μM)，對照組不加藥物，只加入同體積DMEM培養(yǎng)液，每組設置3個重復孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入CellTiter-Glo?試劑，應用多功能酶標儀檢測化學發(fā)光數(shù)值(RLU值)。相對細胞活性(%)=(實驗孔發(fā)光數(shù)值-空白背景孔發(fā)光數(shù)值)/(細胞對照孔發(fā)光數(shù)值-空白背景孔發(fā)光數(shù)值)×100%。當相對細胞活性<80%時可認為藥物存在細胞毒性。

1.5.2 MT-2細胞體外毒性實驗 取調整濃度為2×105cells/ml的MT-2細胞接種至96孔板，采用1640培養(yǎng)液進行細胞培養(yǎng)，其余操作步驟同方法1.5.1。

1.6測定芒果葉提取物的體外抗HIV-1病毒活性

1.6.1 TZM-bl-HIV-1ⅢB細胞模型 取調整濃度為1×105cells/ml的TZM-bl細胞接種至96孔板，細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24 h后加入HIV-1ⅢB病毒稀釋液(MOI=0.01)以及梯度濃度的芒果葉提取物和AZT，陽性對照組僅加入病毒稀釋液，陰性對照組只加入同體積DMEM培養(yǎng)液，每組設置3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入Bright-Glo試劑在多功能酶標儀上檢測化學發(fā)光數(shù)值(RLU值)。相對病毒水平(%)=(實驗孔發(fā)光數(shù)值-陰性對照孔發(fā)光數(shù)值)/(陽性對照孔發(fā)光數(shù)值-陰性對照孔發(fā)光數(shù)值)×100%。

1.6.2 MT-2-HIV-1ⅢB細胞模型 取調整濃度為2×105cells/ml的MT-2細胞，加入HIV-1ⅢB病毒液(MOI=0.01)混勻后接種至96孔板，根據(jù)組別設置分別加入梯度濃度的芒果葉提取物和AZT，培養(yǎng)72 h后吸取上清液轉移至提前1 d接種好TZM-bl細胞的孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，余下操作和步驟同方法1.6.1。

1.7HIV-1誘導細胞病變效應(cytopathic effect,CPE)的抑制作用觀察 取方法1.6.2培養(yǎng)72 h后的96孔板(MT-2細胞+HIV-1ⅢB毒株)，使用全自動細胞成像儀觀察不同濃度的芒果葉提取物處理后HIV-1誘導的CPE，并拍照記錄。CPE的判斷標準[16]：視野內無細胞病變?yōu)殛幮?-)，有25%細胞病變?yōu)槿蹶栃?+)，50%細胞病變?yōu)殛栃?++)，75%細胞病變?yōu)閺婈栃?+++)，100%細胞病變?yōu)槌瑥婈栃?++++)。

2 結果

2.1芒果葉提取物在TZM-bl-HIV-1ⅢB模型中的體外細胞毒性和抗HIV-1活性實驗結果 在TZM-bl-HIV-1ⅢB模型中，芒果葉提取物的最大無毒性濃度為54.40 μg/ml，在安全濃度范圍內能抑制HIV-1的復制，相對病毒水平隨著藥物的濃度升高而降低，呈劑量依賴性(見圖1)。陽性對照藥物AZT在最大實驗濃度下對TZM-bl的細胞活性幾乎不產(chǎn)生影響，相對病毒水平隨AZT的濃度升高呈下降趨勢，呈劑量依賴性(見圖2)。該模型的CC50和IC50見表1。

圖1 芒果葉提取物在TZM-bl-HIV-1ⅢB模型中的體外細胞毒性和抗HIV-1活性實驗結果圖

圖2 AZT在TZM-bl-HIV-1ⅢB模型中的體外細胞毒性和抗HIV-1活性實驗結果圖

2.2芒果葉提取物在MT-2-HIV-1ⅢB模型中的體外細胞毒性和抗HIV-1活性實驗結果 在MT-2-HIV-1ⅢB模型中，芒果葉提取物的最大無毒性濃度為54.40 μg/ml，在安全濃度范圍內能抑制HIV-1的復制，相對病毒水平隨著藥物的濃度升高而降低，呈劑量依賴性(見圖3)。陽性對照藥物AZT在最大實驗濃度下對MT-2的細胞活性幾乎不產(chǎn)生影響，相對病毒水平隨AZT的濃度升高呈下降趨勢，呈劑量依賴性(見圖4)。該模型的CC50和IC50見表1。總體來看，芒果葉提取物和AZT在TZM-bl-HIV-1ⅢB模型中的抗病毒效果較在MT-2-HIV-1ⅢB模型中更為顯著。

圖3 芒果葉提取物在MT-2-HIV-1ⅢB模型中的體外細胞毒性和抗HIV-1活性實驗結果圖

圖4 AZT在MT-2-HIV-1ⅢB模型中的體外細胞毒性和抗HIV-1活性實驗結果圖

表1 兩種細胞-病毒模型中芒果葉提取物和AZT的CC50、IC50和SI

2.3芒果葉提取物抑制HIV-1誘導CPE的情況 在MT-2-HIV-1ⅢB模型中，當芒果葉提取物的濃度為54.40 μg/ml時，可觀察到MT-2細胞內僅有極少的合胞體形成(見圖5?)；當濃度為10.88 μg/ml時，能觀察到少量的合胞體(見圖5?)。而未加入藥物的陽性對照孔可見大量的合胞體(見圖5?)；未加入HIV-1ⅢB和藥物的陰性對照孔則無合胞體形成(見圖5?)。見表2，圖5。

表2 不同干預組HIV-1誘導的CPE情況

?芒果葉提取物濃度為272.00 μg/ml，大部分細胞死亡，CPE陰性(-)；?芒果葉提取物濃度為54.40 μg/ml，CPE弱陽性(+)；?芒果葉提取物濃度為10.88 μg/ml，CPE陽性(++)；?芒果葉提取物濃度為0.44 μg/ml，CPE強陽性(+++)；?芒果葉提取物濃度為0.09 μg/ml，CPE超強陽性(++++)；?陽性對照孔，CPE超強陽性(++++)；?陰性對照孔，CPE陰性(-)

3 討論

3.1聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署(United Nations Programme on HIV/AIDS，UNAIDS)報告顯示，2021年全球AIDS/HIV新發(fā)感染約150萬例，死亡約65萬例，現(xiàn)存HIV感染者約3 840萬例[17]。AIDS仍是威脅全人類生命安全的嚴重傳染性疾病之一，提高患者的HAART治療效果和生活質量是目前關注的熱點問題。我國學者通過對中藥材庫進行篩選，發(fā)現(xiàn)了一些具有抑制HIV活性的藥物，包括黃連、金銀花、紫草、女貞子、肉桂等[18]。經(jīng)實驗驗證，這些提取物在抑制HIV活性或增強HIV/AIDS患者免疫功能方面均能起到一定的作用，如思茅松松塔提取物對HIV-1有很強的活性抑制作用[19]；黃芪提取物可降低HIV-1的感染能力[20]；鴉膽子提取物可通過上調抗HIV天然免疫因子蛋白的表達而發(fā)揮抑制HIV的作用[21]。芒果葉作為我國傳統(tǒng)的中草藥，不僅具有悠久的使用歷史，而且具有安全性好、原料易得、價格低等優(yōu)點[22]。藥理研究表明，芒果葉有抗菌、抗腫瘤、抗氧化及抗炎等作用[23]，具有潛在的抗HIV藥物開發(fā)利用價值。

3.2TZM-bl細胞和MT-2細胞均能穩(wěn)定表達HIV-1感染的相關受體，包括CD4、CXCR4等。TZM-bl細胞基因組內攜帶了HIV-1長末端重復序列(long terminal repeat，LTR)啟動的熒光素酶和β-半乳糖苷酶的報告基因，在HIV-1感染時，受HIV-1 tat原件調控的熒光素酶報告基因能被激發(fā)表達，由此可以反映HIV-1感染和復制水平[24]。MT-2細胞是人類T淋巴細胞白血病病毒Ⅰ型轉化的人淋巴瘤細胞，被合胞體誘導型(即SI型)毒株HIV-1ⅢB感染后，細胞之間可發(fā)生融合，形成多核巨細胞(合胞體)[25]，能直觀地體現(xiàn)病毒誘導的CPE。本研究采用TZM-bl-HIV-1ⅢB和MT-2-HIV-1ⅢB兩種細胞-病毒感染模型進行實驗，結果顯示，芒果葉提取物在TZM-bl和MT-2兩種細胞中的CC50分別為320.00 μg/ml、174.13 μg/ml，均高于董宜旋和李靜[26]研究的三葉青提取物。在兩種細胞-病毒感染模型中，芒果葉提取物的最大無毒性濃度均為54.40 μg/ml，高于莫雨曉等[27]研究的石見穿乙醇提取物和謝磊等[28]研究的補骨脂乙醇提取物，說明芒果葉提取物具有良好的安全劑量范圍。芒果葉提取物在兩種細胞-病毒感染模型中對HIV-1ⅢB的IC50均處于較低濃度水平，分別為8.86 μg/ml、15.23 μg/ml。雖然SI值受多種因素的影響，但通常情況下，化合物的SI值>10，則可認為藥物具有較高的安全性[29]。本研究中，芒果葉提取物在兩種模型中的SI值均>10，以在TZM-bl-HIV-1ⅢB模型中的作用更為顯著，SI值=36.14，高于高麗娜等[30]研究的野棉花、木藤蓼等6種中草藥提取物。在兩種細胞模型中芒果葉提取物對抗HIV-1活性存在差異，但均能反映其對HIV的抑制效果，對于差異的產(chǎn)生可能是由于TZM-bl細胞和MT-2細胞本身增殖能力不同而造成的，這在以往的研究[31-32]中也有發(fā)現(xiàn)。此外，鏡下觀察可見芒果葉提取物能有效抑制HIV-1誘導的CPE，且呈劑量依賴性。綜上結果提示，芒果葉提取物具有潛在的抗HIV-1應用價值。

3.3有研究顯示，芒果葉提取物在體外可抑制T細胞內產(chǎn)生的氧化應激，從而提高T細胞的存活率[33]，同時其主要成分芒果苷也可通過抑制淋巴細胞、中性粒細胞和巨噬細胞中的氧化應激而發(fā)揮免疫保護作用[10]，由此推測其抗HIV-1活性可能與抗氧化及免疫調節(jié)作用有關。芒果葉提取物抗HIV-1的機制仍需進一步進行實驗驗證。

綜上所述，芒果葉提取物具有顯著抗HIV-1活性，且安全性較好，在AIDS/HIV-1新藥研發(fā)中具有應用前景，后續(xù)可進一步提純分析，探討其具體的作用機制，以充分發(fā)揮中草藥資源的應用價值。