郭沐濤， 周穗子， 邱前輝

過敏性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是當(dāng)機(jī)體接觸過敏原后主要由IgE介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性炎性疾病，典型的臨床癥狀包括鼻癢、打噴嚏、流鼻涕、眼癢和鼻塞[1]。如癥狀控制不佳不僅會(huì)增加哮喘的風(fēng)險(xiǎn)，還會(huì)降低學(xué)習(xí)、工作的效率，嚴(yán)重者還會(huì)引發(fā)睡眠質(zhì)量不佳及情緒低落等問題[1-2]。鼻腔黏液-纖毛系統(tǒng)是上呼吸道的第一道防線，主要通過黏液分泌和纖毛擺動(dòng)發(fā)揮清除功能。在正常呼吸過程中，空氣中被吸入的病原體會(huì)刺激鼻腔上皮細(xì)胞分泌黏液，隨后在鼻腔運(yùn)動(dòng)纖毛和黏液毯共同作用下將含有病原體的黏液排出，從而控制鼻腔炎癥的發(fā)生和發(fā)展[3]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，鼻腔黏液-纖毛系統(tǒng)損傷是AR的重要病理現(xiàn)象，使過敏原和病原體在上呼吸道停留時(shí)間延長(zhǎng)，加重AR癥狀及并發(fā)癥的嚴(yán)重程度[4]。然而在AR中，黏液-纖毛系統(tǒng)哪些成分損傷，損傷的分子表現(xiàn)及嚴(yán)重程度與AR的發(fā)生發(fā)展關(guān)系尚不清楚。通過文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，Mucin 5AC(MUC5AC)在蛋白水平上定位在呼吸道上皮杯狀細(xì)胞分泌黏液中最常見、最經(jīng)典的標(biāo)志物[5-6]。acetylated alpha-tubulin(acet. α-tubulin)是纖毛的微管結(jié)構(gòu)的標(biāo)志物，在蛋白水平上的表達(dá)水平直接反映了纖毛生長(zhǎng)情況[7-8]。鑒此，本研究旨在通過檢測(cè)黏液-纖毛系統(tǒng)的核心標(biāo)志物來闡明AR患者黏液、纖毛在分子水平上的損傷表現(xiàn)，并進(jìn)一步探究該系統(tǒng)的損傷與AR的發(fā)生發(fā)展關(guān)系，為改善AR癥狀的治療提供研究基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2021年3月至2022年3月期間在我院進(jìn)行鼻中隔偏曲手術(shù)的40例患者的下鼻甲黏膜組織。其中AR 21例(AR組)，男13例，女8例；年齡(31.76±9.44)歲；過敏源為塵螨17例，其他4例；纖毛染色陽性樣本21例，黏液染色陽性樣本21例。非AR患者(對(duì)照組)19例，男13例，女6例；年齡(39.58±12.50)歲；纖毛染色陽性樣本19例，黏液染色陽性樣本19例。AR的診斷參照國際變應(yīng)性鼻炎及其對(duì)哮喘的影響(Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma,ARIA)指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，并且根據(jù)皮膚點(diǎn)刺實(shí)驗(yàn)(Allergopharma,Reinbek,Germany)或血清敏篩過敏原檢測(cè)系統(tǒng)(Mediwiss Analytic GmbH,Moers,Germany)的結(jié)果對(duì)AR進(jìn)行診斷，排除哮喘病史，并且不伴有急慢性鼻竇炎癥狀者。本研究經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)附屬廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào)：KY-Z-2021-397-01)。

1.2免疫熒光染色方法 術(shù)中取鼻腔下鼻甲組織樣本，在室溫下用4%多聚甲醛固定液固定24 h以上，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，烘干。常規(guī)脫蠟后置樣本于95 ℃高溫水浴修復(fù)10 min，自然冷卻60 min。經(jīng)過打孔、封閉之后，滴加一抗[鼠抗人acet. α-tubulin單克隆抗體，clone ab24610(Abcam,Cambridge,MA)]和兔抗人MUC5AC多克隆抗體[H160:sc20118(Santa Cruz Biotechology)]，兩者的工作濃度都是1∶800，4 ℃孵育過夜。隔日漂洗后滴加二抗[熒光488-(抗鼠)和熒光594-(抗兔)，Life Technologies,Carlsbad,CA]。兩者的工作濃度均為1∶500。最后滴加4′6-二氨基-2-苯基吲哚(4′6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(Life Technologies,Carlsbad,CA)進(jìn)行細(xì)胞核染色，封片。置于熒光顯微鏡(Olympus IX51,Tokyo,Japan)下觀察，組織切片用400倍物鏡拍攝。

1.3黏液分泌程度和纖毛長(zhǎng)度、密度、脫落的評(píng)估方法 所有樣本先不分組，在400倍物鏡下單獨(dú)、隨機(jī)選取5個(gè)視野拍攝。由2個(gè)實(shí)驗(yàn)者用Image J軟件分別進(jìn)行評(píng)估。黏液用MUC5AC陽性染色進(jìn)行評(píng)估[6]。纖毛用acet. α-tubulin陽性染色進(jìn)行評(píng)估，指標(biāo)包括纖毛密度和長(zhǎng)度[3]、纖毛脫落[10]。(1)黏液分泌程度和纖毛密度：每個(gè)視野用對(duì)應(yīng)標(biāo)志物的總免疫熒光強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)估，取5個(gè)視野的熒光強(qiáng)度平均值為該樣本的黏液分泌程度和纖毛密度。(2)纖毛長(zhǎng)度：以20 μm(400倍物鏡下的比例尺)作為測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)。每個(gè)視野測(cè)量20次，取5個(gè)視野的平均測(cè)量值為該樣本的纖毛長(zhǎng)度。(3)纖毛脫落：參看相關(guān)文獻(xiàn)[11]，細(xì)胞標(biāo)志物陽性染色的截?cái)嘀翟O(shè)為70%。將>70%纖毛陽性染色的區(qū)域判定為纖毛完整，評(píng)為0分；≤70%纖毛陽性染色的區(qū)域判定為纖毛脫落，評(píng)為1分。5個(gè)視野評(píng)分的平均值為該樣本的纖毛脫落程度。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(下四分位數(shù)，上四分位數(shù))[M(P25，P75)]表示，對(duì)照組和AR組的纖毛和黏液的評(píng)估采用Mann-Whitney 2-tailed非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組黏液分泌情況比較 對(duì)照組和AR組患者的下鼻甲上皮黏膜組織中杯狀細(xì)胞分泌黏液形態(tài)見圖1。黏液的標(biāo)志物(MUC5AC)成顆粒狀分泌，形態(tài)、大小不固定，可存在于上皮杯狀細(xì)胞層以上，甚至在黏液分泌較多情況下會(huì)黏附于纖毛表面。對(duì)照組的黏液分泌排列較稀疏，形態(tài)較小并表達(dá)黯淡；AR組的黏液分泌排列緊密，形態(tài)肥厚、表達(dá)明亮并黏附于纖毛表面，其分泌量明顯高于對(duì)照組。對(duì)照組黏液分泌的總免疫熒光強(qiáng)度為2 536 685(1 643 296，5 059 862)，AR為3 750 531(2 263 503，6 435 619)。與對(duì)照組相比，AR組黏液分泌的總免疫熒光強(qiáng)度增加了32.365%。見圖2。由此可得，AR患者的黏液分泌相比對(duì)照組顯著增多(P<0.05)。

?對(duì)照組MUC5AC(黏液染色，比例尺為20 μm)；?對(duì)照組DAPI(細(xì)胞核染色)；?為??圖合并；?AR組MUC5AC(黏液染色)；?AR組DAPI(細(xì)胞核染色)；?為??圖合并

圖2 對(duì)照組與AR組黏液分泌量比較圖

2.2兩組纖毛長(zhǎng)度、脫落和密度情況比較 對(duì)照組和AR組的下鼻甲組織的纖毛形態(tài)見圖3。與對(duì)照組相比，AR組纖毛較短小、稀疏且脫落明顯，排列不整齊。對(duì)照組的纖毛長(zhǎng)度為3.931(2.876，4.341)μm；AR組的纖毛長(zhǎng)度為2.642(2.399，2.951)μm(見圖4?)。與對(duì)照組相比，AR組的纖毛長(zhǎng)度縮短了將近1/2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 1)(見圖4?)。對(duì)照組纖毛脫落評(píng)分為0(0，0.2)分，AR組為0.33(0，0.55)分，AR組的得分上升了將近3倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.032)(見圖4?)。對(duì)照組和AR組纖毛的總免疫熒光強(qiáng)度分別為25 753(16 147，33 563)和19 429(13 530，27 560)，AR組纖毛的總免疫熒光強(qiáng)度相比對(duì)照組下降了24.555%(見圖4?)。由此可得，AR患者的纖毛密度相比對(duì)照組降低。AR患者鼻上皮黏液-纖毛清除功能損傷模式見圖5。

?對(duì)照組acet. α-tubulin(纖毛染色，比例尺為20 μm)；?對(duì)照組DAPI(細(xì)胞核染色)；?為??圖合并，箭頭指代纖毛脫落；?AR組acet. α-tubulin(纖毛染色)；?AR組DAPI(細(xì)胞核染色)；?為??圖合并，箭頭指代纖毛脫落

圖4 對(duì)照組與AR組纖毛評(píng)估圖

圖5 AR患者鼻上皮黏液-纖毛清除功能損傷模式圖

3 討論

3.1黏液-纖毛清除功能是呼吸道固有免疫的重要組成部分，它由黏液、氣道表面液體、纖毛細(xì)胞表面的纖毛構(gòu)成[12]。黏液-纖毛清除系統(tǒng)通過分泌黏液捕獲入侵的過敏原和病原體，分泌炎癥介質(zhì)和免疫細(xì)胞募集的趨化因子，再通過有效的纖毛擺動(dòng)將包裹在黏液層的有害物質(zhì)排出呼吸道[13-15]。在健康人體中，正常的黏液-纖毛系統(tǒng)可以有效保護(hù)上下呼吸道，維持呼吸道的自凈功能，減少抗原刺激和疾病感染的風(fēng)險(xiǎn)[16-17]。然而，在AR患者中，黏液-纖毛清除功能損傷會(huì)增加過敏原的停留時(shí)間，加重鼻腔黏膜的炎癥浸潤狀態(tài)，加重AR的癥狀，甚至導(dǎo)致哮喘等一系列過敏性疾病，降低患者的生活質(zhì)量。

3.2臨床上評(píng)價(jià)黏液-纖毛清除功能主要通過糖精清除試驗(yàn)來檢測(cè)。本文主要研究AR分子水平的損傷表達(dá)。acet. α-tubulin是纖毛細(xì)胞的微管結(jié)構(gòu)的標(biāo)志物，它表達(dá)在纖毛細(xì)胞頂端，與纖毛生長(zhǎng)位置重合。Shah等[18]2009年發(fā)表在Science的研究中把a(bǔ)cet. α-tubulin作為氣道上皮纖毛標(biāo)志物。Kanamaru等[19]及Wang等[20]在2022年的研究報(bào)道中也沿用acet. α-tubulin作為纖毛運(yùn)動(dòng)的標(biāo)志物。MUC5AC是在氣道上皮中表達(dá)的主要分泌黏蛋白，它在N端和C端具有富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的糖蛋白，可通過二硫鍵聚合。Song等[21]研究發(fā)現(xiàn)，MUC5AC缺失會(huì)導(dǎo)致黏液纖毛運(yùn)輸受損和不協(xié)調(diào)，進(jìn)一步說明這種黏蛋白對(duì)氣道清除的重要性。Jiang等[22]報(bào)道了在AR小鼠模型及白細(xì)胞介素13(interleukin 13,IL-13)刺激體外分離的鼻上皮細(xì)胞中MUC5AC的表達(dá)上調(diào)。Wang等[23]采用低覆蓋率全基因組測(cè)序方法對(duì)漢族后裔AR患者的病例及其父母3人進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MUC5AC拷貝數(shù)與AR易感性相關(guān)。而Peng等[24]通過基因芯片測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組患者，AR患者鼻黏膜中纖毛基因表達(dá)廣泛下調(diào)，纖毛脫落增加，但纖毛長(zhǎng)度是否改變尚未被報(bào)道。本研究直接取AR組和對(duì)照組患者的鼻黏膜樣本，進(jìn)一步分析黏液蛋白MUC5AC、纖毛基因acet. α-tubulin的表達(dá)情況及纖毛長(zhǎng)度的變化，為后續(xù)探究AR黏液-纖毛功能損傷提供分子基礎(chǔ)。黏液-纖毛清除功能損傷是AR的重要病理現(xiàn)象。Song等[25]的研究結(jié)果表明，成年人AR癥狀綜合評(píng)分越高，癥狀越重，鼻腔黏液-纖毛清除時(shí)間也相對(duì)延長(zhǎng)。Mikolajczyk等[26]在兒童患者的研究中發(fā)現(xiàn)，黏液-纖毛清除時(shí)間與AR的嚴(yán)重程度以及鼻甲黏膜的嗜酸性細(xì)胞浸潤程度呈正相關(guān)。這些研究結(jié)果在宏觀上共同說明，AR病情越嚴(yán)重，黏液-纖毛清除功能損傷程度可能越高，清除病原體和過敏原所需的時(shí)間越長(zhǎng)。本研究結(jié)果進(jìn)一步提示黏液-纖毛清除功能損傷可能由黏液的分泌量顯著增加，纖毛長(zhǎng)度變短、排列不齊、稀疏以及脫落增加引起。本研究結(jié)果首次從分子水平上揭示了AR患者鼻腔的黏液-纖毛系統(tǒng)功能成分損傷的具體變化及嚴(yán)重程度，為進(jìn)一步探索黏液-纖毛清除功能損傷在AR發(fā)病的分子機(jī)制及作用的基因靶點(diǎn)提供研究基礎(chǔ)。

3.3越來越多的研究證據(jù)支持黏液-纖毛清除功能損傷是在發(fā)病機(jī)制上引起肺部慢性炎癥性疾病的重要因素。有學(xué)者在氣道上皮NA+通道過表達(dá)的小鼠模型上驗(yàn)證了NA+通道過度開放、氣道表面脫水可能是氣道黏液分泌過多導(dǎo)致黏液-纖毛清除功能受損，繼而引起早期過敏性哮喘等2型過敏性疾病的病理生理機(jī)制[27-29]。還有研究認(rèn)為，即使在沒有細(xì)菌感染情況下，氣道黏液分泌過多也可能會(huì)通過上皮缺氧壞死、潛在免疫調(diào)節(jié)作用等機(jī)制引起黏液-纖毛系統(tǒng)受損，觸發(fā)慢性氣道炎癥和肺部損傷的發(fā)生[30-31]。另外，Lam等[32]發(fā)現(xiàn)自噬依賴途徑可能與慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)中肺纖毛長(zhǎng)度縮短、黏液-纖毛清除功能受損有密切關(guān)系，該作用途徑有望成為COPD治療的新靶點(diǎn)。有研究證實(shí)香煙煙霧會(huì)直接影響呼吸道纖毛長(zhǎng)度，從而降低氣道的黏液-纖毛清除的能力，為長(zhǎng)期吸煙導(dǎo)致COPD的發(fā)病提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)[33-35]。本研究結(jié)果顯示鼻腔黏膜的黏液分泌過多及纖毛結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致黏液-纖毛清除功能損傷也可能是參與AR發(fā)病的重要原因，但其中的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。這將為我們未來深入研究黏液-纖毛功能損傷在AR等常見呼吸道疾病的發(fā)病機(jī)制中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及方向指引。

3.4Di Berardino等[36]的臨床研究表明，通過鼻腔沖洗來加強(qiáng)鼻腔黏液-纖毛清除功能的治療方法能有效緩解AR的癥狀。Mall和Galietta[37]在小鼠模型上驗(yàn)證了使用NA+通道抑制藥物(阿米洛利特)可改善氣道表面水化和加速黏液排出，提高呼吸道的自凈能力，緩解過敏原刺激引起的氣道反應(yīng)，如氣道嗜酸性細(xì)胞浸潤、IL-13分泌和氣道高反應(yīng)性。由此可見，改善鼻腔黏液-纖毛清除功能可以有效緩解AR的癥狀。恢復(fù)黏液-纖毛清除功能可能為AR患者，甚至哮喘等過敏性疾病患者群體提供潛在的治療機(jī)會(huì)。

3.5盡管我們已經(jīng)在AR患者下鼻甲黏膜組織發(fā)現(xiàn)了黏液分泌增加和纖毛結(jié)構(gòu)異?？赡苁菍?dǎo)致AR黏液-纖毛清除功能損傷的直接原因，但個(gè)體差異是不可避免的。同時(shí)，樣本量不足也可能是導(dǎo)致黏液和纖毛總免疫熒光強(qiáng)度未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的限制因素，但其表達(dá)上調(diào)及下調(diào)的趨勢(shì)與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)具有一致性，因此認(rèn)為其表達(dá)趨勢(shì)變化是真實(shí)可信的?；诖搜芯炕A(chǔ)，我們將用人鼻上皮干細(xì)胞模型以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這一結(jié)論，并延續(xù)性探究黏液-纖毛系統(tǒng)損傷導(dǎo)致AR的發(fā)病機(jī)制，為臨床上AR診斷及治療策略提供新穎、有效和安全的理論依據(jù)。

綜上所述，本研究從分子水平上揭示了AR黏液的分泌量增加，纖毛排列不齊、變短、稀疏以及脫落增加，是導(dǎo)致AR患者鼻腔黏膜黏液-纖毛清除功能減弱，繼而加重AR癥狀嚴(yán)重程度的分子依據(jù)。根據(jù)文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，黏液-纖毛系統(tǒng)的損傷可能是AR發(fā)病的重要原因。改善黏液-纖毛清除功能的治療有助于改善AR的癥狀嚴(yán)重性，可能為AR等過敏性疾病患者提供潛在的治療機(jī)會(huì)。