張 菡, 韋 丹, 蔡美婷, 尹富強(qiáng), 劉 夏
鼻咽癌是一種源于鼻咽部的鱗狀上皮細(xì)胞癌,在我國(guó)南方地區(qū)和東南亞國(guó)家的發(fā)病率較高。2018年全世界報(bào)告鼻咽癌病例約12.9萬(wàn)例[1]。鼻咽癌的臨床治療方法主要有放療以及放療聯(lián)合化療[2],但鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移極大地降低了晚期鼻咽癌患者的生存率[3]。因此,亟需尋找能夠抑制癌細(xì)胞遷移與侵襲的新化療藥物。氧雜蒽酮類化合物是一類含氧雜環(huán)化合物,具有廣泛的生物活性,具有抗癌[4]、抗艾滋病毒[5]、抗菌[6]等作用,在藥物化學(xué)領(lǐng)域具有重要的意義。近年來(lái)的研究顯示,氧雜蒽酮類化合物可以抑制鼻咽癌、乳腺癌、胰腺癌等癌細(xì)胞的增殖[7-8]。Garcinone C是從藥用植物山竹(GarciniamangostanaL)中提取的一種氧雜蒽酮類天然化合物,有報(bào)道顯示其在結(jié)腸癌[9]和鼻咽癌[7]具有抗腫瘤活性,但對(duì)鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響作用研究未見(jiàn)報(bào)道。鑒此,本研究從細(xì)胞層面,以鼻咽癌細(xì)胞系HK1和HONE1作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的Garcinone C對(duì)細(xì)胞衰老、遷移及侵襲能力,以及對(duì)鐵死亡的影響,探討Garcinone C對(duì)鼻咽癌的作用機(jī)制,為鼻咽癌治療藥物的研發(fā)提供候選先導(dǎo)化合物。
1.1主要實(shí)驗(yàn)試劑 Garcinone C(分子式為C23H26O7),由課題組從山竹GarciniamangostanaL果皮中提取、分離并純化[7]。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)、杜氏磷酸緩沖鹽溶液(Dulbecco′s phosphate buffered saline,D-PBS)均購(gòu)自加拿大WISENT公司。胰蛋白酶、抗生素-青霉素鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Gibco Life Technologies公司。蛋白定量BCA試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光液均購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific Pierce公司。β-半乳糖苷酶衰老試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。無(wú)基質(zhì)膠Transwell小室、含基質(zhì)膠Transwell小室均購(gòu)自美國(guó)Corning公司。0.1%結(jié)晶紫溶液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。30%丙烯酰胺、電泳緩沖液、印跡膜轉(zhuǎn)印緩沖液、預(yù)染蛋白Marker均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Merck Millipore公司。一抗E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑2(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 2,TIMP2)蛋白、鐵蛋白重鏈1(ferritin heavy chain 1,FTH1)、胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白xCT、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)以及HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(Anti-rabbit IgG)均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。
1.2主要儀器 倒置熒光顯微鏡(Olympus,BX53),恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific,3111),低溫高速離心機(jī)(Eppendorf,5424R),-80 ℃超低溫冰箱(Haier,DW-86L628),低速離心機(jī)(湘儀,TD5A-WS),全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo Scientific,Multiskan GO),BD電泳儀(Bio Rad,PowerPac Basic),化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(中國(guó)賽智創(chuàng)業(yè)公司,MiniChemi 610Plus型)。
1.3細(xì)胞培養(yǎng) 鼻咽癌細(xì)胞株HK1和HONE1受贈(zèng)于中山大學(xué)腫瘤防治中心錢朝南教授。HK1和HONE1細(xì)胞均使用含有10% FBS、1% 100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基,在5% CO2、37 ℃的飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%~85%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.4HONE1細(xì)胞衰老檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HONE1細(xì)胞接種于12孔板中,每孔600個(gè)細(xì)胞,設(shè)置3個(gè)平行孔。16 h后用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋Garcinone C母液,并設(shè)置4個(gè)濃度梯度(0 μM、2.50 μM、3.75 μM、5.00 μM)以及一個(gè)空白對(duì)照。培養(yǎng)11 d后吸除孔中的舊培養(yǎng)液,D-PBS洗1遍后用β-半乳糖苷酶固定液室溫固定15 min,每孔500 μl。吸除固定液,以D-PBS洗3遍后加入β-半乳糖苷酶染色工作液,每孔500 μl,置于37 ℃恒溫箱中孵育過(guò)夜。第2天取出12孔板,在普通光學(xué)顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)并拍照。β-半乳糖苷酶染色液染色后的衰老陽(yáng)性細(xì)胞呈藍(lán)色,陰性細(xì)胞無(wú)著色。
1.5HK1和HONE1細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK1和HONE1細(xì)胞,常規(guī)消化、離心,重懸細(xì)胞時(shí)使用不含F(xiàn)BS的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基,將HK1細(xì)胞懸液稀釋成5×105cells/ml,HONE1為4×105cells/ml。將細(xì)胞接種于Transwell小室的上室中,每孔500 μl,分別設(shè)3個(gè)藥物濃度梯度(HK1細(xì)胞組為5.00 μmol/L、7.50 μmol/L、10.00 μmol/L;HONE1組為3.75 μmol/L、5.00 μmol/L、7.50 μmol/L)和一個(gè)空白對(duì)照。Transwell小室的下室加入含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基,每孔750 μl。作用24 h后,取出Transwell小室,吸除小室內(nèi)的培養(yǎng)液,用D-PBS洗2遍后加入4%多聚甲醛750 μl固定20 min,D-PBS洗2遍,0.1%結(jié)晶紫染色20 min,D-PBS洗2遍后用濕潤(rùn)的棉簽擦去上室中未遷移的細(xì)胞,在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。使用Image J軟件計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞數(shù),細(xì)胞遷移比例=藥物處理組遷移細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)×100%。
1.6HK1和HONE1細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法與上述的細(xì)胞遷移能力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法(方法1.5)相似。不同的是,Transwell小室的基底膜上有一層Matrigel基質(zhì)膠,小室在使用前要先經(jīng)水化:分別向小室的上、下室加入無(wú)FBS的DMEM培養(yǎng)基500 μl,在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中水化2 h。細(xì)胞處理24 h后,取出小室,先用濕潤(rùn)的棉簽將上室中未穿過(guò)基底膜的細(xì)胞擦去,再固定、染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照,使用Image J軟件計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù),細(xì)胞侵襲比例=藥物處理組侵襲細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù)×100%。
1.7HK1和HONE1細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白及鐵死亡相關(guān)蛋白檢測(cè) 通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK1和HONE1細(xì)胞,接種于10 cm的培養(yǎng)皿中,16 h后分別加入Garcinone C(5.00 μmol/L、7.50 μmol/L、10.00 μmol/L),每組設(shè)一個(gè)空白對(duì)照。分別作用24 h、48 h后用RIPA裂解液裂解細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白。BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,將蛋白濃度調(diào)至相同后加熱變性。通過(guò)10% SDS-PAGE凝膠電泳90 min分離蛋白質(zhì),恒壓90 V轉(zhuǎn)膜3 h,5%脫脂奶粉液封閉1 h,4 ℃孵育一抗過(guò)夜(N-cadherin、E-cadherin、TIMP2、FTH1、xCT均以1∶1 000稀釋),第2天孵育二抗(1∶5 000)1 h,加入ECL化學(xué)發(fā)光液,應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光顯影,拍照記錄,以GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
2.1Garcinone C誘導(dǎo)HONE1細(xì)胞衰老實(shí)驗(yàn)結(jié)果 β-半乳糖苷酶染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,梯度濃度Garcinone C(2.50 μmol/L、3.75 μmol/L、5.00 μmol/L)處理HONE1細(xì)胞11 d后,衰老細(xì)胞染色率較空白對(duì)照組(0 μmol/L Garcinone C)顯著上升,且有藥物濃度依賴性,四組衰老細(xì)胞染色率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 253.695,P<0.001)。見(jiàn)圖1。
光學(xué)顯微鏡下所見(jiàn)(β-半乳糖苷酶染色×200)及四組衰老細(xì)胞染色率比較,與空白對(duì)照組比較,aP<0.05;與2.50 μmol/L Garcinone C組比較,bP<0.05;與3.75 μmol/L Garcinone C組比較,cP<0.05
2.2Garcinone C抑制HK1和HONE1細(xì)胞的遷移能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同濃度的Garcinone C分別處理HK1和HONE1細(xì)胞24 h后,與空白對(duì)照組相比,藥物干預(yù)組中穿過(guò)基底膜的細(xì)胞比例顯著減少,且呈劑量依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HK1細(xì)胞:F=201.208,P<0.001;HONE1細(xì)胞:F=397.185,P<0.001)。見(jiàn)圖2。
?HK1細(xì)胞鏡下所見(jiàn)(結(jié)晶紫染色,×200)及四組穿過(guò)基底膜的細(xì)胞比例比較。與0 μmol/L Garcinone C組比較,aP<0.05;與5.00 μmol/L Garcinone C組比較,bP<0.05;與7.50 μmol/L Garcinone C組比較,cP<0.05;?HONE1細(xì)胞鏡下所見(jiàn)(結(jié)晶紫染色,×200)及四組穿過(guò)基底膜的細(xì)胞比例比較。與0 μmol/L Garcinone C組比較,aP<0.05;與3.75 μmol/L Garcinone C組比較,bP<0.05;與5.00 μmol/L Garcinone C組比較,cP<0.05
2.3Garcinone C抑制HK1和HONE1細(xì)胞的侵襲能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同濃度的Garcinone C分別處理HK1和HONE1細(xì)胞24 h后,與空白對(duì)照組相比,藥物干預(yù)組中侵襲的細(xì)胞比例顯著減少,且呈劑量依賴性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HK1細(xì)胞:F=166.242,P<0.001;HONE1細(xì)胞:F=84.964,P<0.001)。見(jiàn)圖3。
?HK1細(xì)胞鏡下所見(jiàn)(結(jié)晶紫染色,×200)及四組穿過(guò)含基質(zhì)膠基底膜的細(xì)胞比例比較,與0 μmol/L Garcinone C組比較,aP<0.05;與5.00 μmol/L Garcinone C組比較,bP<0.05;?HONE1細(xì)胞鏡下所見(jiàn)(結(jié)晶紫染色,×200)及四組穿過(guò)含基質(zhì)膠基底膜的細(xì)胞比例比較。與0 μmol/L Garcinone C組比較,aP<0.05;與3.75 μmol/L Garcinone C組比較,bP<0.05;與5.00 μmol/L Garcinone C組比較,cP<0.05
2.4不同濃度Garcinone C對(duì)HK1和HONE1細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)不同濃度的Garcinone C分別處理HK1和HONE1細(xì)胞后,E-cadherin、TIMP2表達(dá)水平上升(P<0.05),N-cadherin表達(dá)水平下降(P<0.05),且有劑量依賴性。見(jiàn)圖4。
?不同濃度Garcinone C對(duì)HK1細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,與0 μmol/L Garcinone C組比較,aP<0.05;與5.00 μmol/L Garcinone C組比較,bP<0.05;與7.50 μmol/L Garcinone C組比較,cP<0.05;?不同濃度Garcinone C對(duì)HONE1細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,與0 μmol/L Garcinone C組比較,aP<0.05;與5.00 μmol/L Garcinone C組比較,bP<0.05;與7.50 μmol/L Garcinone C組比較,cP<0.05
2.5不同濃度Garcinone C對(duì)HK1和HONE1細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)不同濃度的Garcinone C分別處理HK1和HONE1細(xì)胞后,F(xiàn)TH1和xCT蛋白表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖5。
?不同濃度Garcinone C對(duì)HK1細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,與0 μmol/L Garcinone C組比較,aP<0.05;與5.00 μmol/L Garcinone C組比較,bP<0.05;與7.50 μmol/L Garcinone C組比較,cP<0.05;?不同濃度Garcinone C對(duì)HONE1細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,與0 μmol/L Garcinone C組比較,aP<0.05;與5.00 μmol/L Garcinone C組比較,bP<0.05;與7.50 μmol/L Garcinone C組比較,cP<0.05
3.1廣西是鼻咽癌高發(fā)的地區(qū),鼻咽癌病理類型多為非角化型鱗狀細(xì)胞癌[10]。原發(fā)鼻咽癌的治療主要以放療或放化療結(jié)合為主,部分患者會(huì)出現(xiàn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到其他器官,包括骨、肺、肝和遠(yuǎn)處淋巴結(jié)等[4]。轉(zhuǎn)移病例的治療仍是以化療為主,但耐藥率較高[11]。局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是鼻咽癌治療失敗的主要原因[12],因此,亟需尋找新的化療藥物。
3.2天然產(chǎn)物是抗腫瘤新藥研發(fā)的重要途徑之一。山竹是一種藤黃屬植物,含有一類特殊的化學(xué)物質(zhì)——氧雜蒽酮類化合物,包括gartanin、β-mangostin、γ-mangostin、Garcinone E和Garcinone C等。有研究表明這些氧雜蒽酮類化合物具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性[12]。Chen等[9]研究發(fā)現(xiàn),Garcinone C可以通過(guò)調(diào)節(jié)Hedgehog信號(hào)通路在體內(nèi)外抑制結(jié)腸腫瘤的發(fā)生。Garcinone E與Garcinone C同為山竹果皮提取的蒽醌類化合物。已有研究表明,Garcinone E可以抑制卵巢癌[13]和鼻咽癌[14]的轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果也顯示,Garcinone C可顯著抑制HK1和HONE1細(xì)胞遷移和侵襲,誘導(dǎo)HONE1細(xì)胞衰老,誘導(dǎo)HK1和HONE1細(xì)胞的鐵死亡。
3.3天然產(chǎn)物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老是抑制腫瘤發(fā)展的主要途徑之一,可使癌細(xì)胞永久性喪失增殖能力,達(dá)到抗腫瘤效果。癌細(xì)胞的遷移和侵襲與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)密切相關(guān)。EMT是一個(gè)發(fā)育過(guò)程,是指極化后的上皮細(xì)胞停止維持細(xì)胞間的接觸,失去細(xì)胞極性,并獲得間充質(zhì)細(xì)胞特性,如運(yùn)動(dòng)性、收縮能力和侵襲性[15]。在EMT進(jìn)程中,通常伴隨著N-cadherin表達(dá)上調(diào)及E-cadherin表達(dá)下調(diào)。E-cadherin是介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間同質(zhì)性黏附的主要蛋白,E-cadherin表達(dá)下調(diào)被廣泛認(rèn)為是EMT發(fā)生的標(biāo)志[16]。因此,上調(diào)E-cadherin的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)EMT,抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。有研究顯示,上調(diào)E-cadherin可以顯著抑制鼻咽癌[17]、乳腺癌[18]細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。細(xì)胞外基質(zhì)是防止腫瘤細(xì)胞侵襲的天然屏障,基質(zhì)金屬酶是誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生降解的重要蛋白酶,TIMP2是基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制因子,在多種腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)[19]。有研究表明,上調(diào)TIMP2表達(dá)可以抑制卵巢癌和肝癌細(xì)胞的侵襲[13,20]。
3.4鐵死亡是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞程序性死亡的機(jī)制,當(dāng)鐵依賴性脂質(zhì)過(guò)氧化物積累到一定程度時(shí)就會(huì)觸發(fā)鐵死亡[21]。越來(lái)越多的證據(jù)表明,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡具有治療癌癥的可能,特別是對(duì)傳統(tǒng)治療方法產(chǎn)生耐藥性的侵襲性惡性腫瘤[22]。在鐵死亡過(guò)程中,F(xiàn)TH1和xCT蛋白表達(dá)下調(diào)。FTH1具有鐵氧化酶活性[23],可促進(jìn)鐵吸收[24]。在鐵死亡過(guò)程中,對(duì)細(xì)胞鐵平衡的維持起重要作用[25]。相關(guān)研究表明,在膀胱癌[26]、肝癌[27]細(xì)胞中FTH1下調(diào)表達(dá),誘導(dǎo)鐵死亡,抑制癌癥發(fā)展。xCT是一種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,可被還原為半胱氨酸,用于谷胱甘肽的合成。通過(guò)抑制xCT,減少谷胱甘肽合成,是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡的有效途徑[28]。有研究證明,在胃癌[29]、乳腺癌[30]細(xì)胞中,下調(diào)xCT的表達(dá)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。在本研究中,經(jīng)Garcinone C處理鼻咽癌細(xì)胞,F(xiàn)TH1和xCT表達(dá)下調(diào),提示Garcinone C可通過(guò)誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡,抑制腫瘤發(fā)展。
綜上所述,Garcinone C可逆轉(zhuǎn)EMT過(guò)程,抑制鼻咽癌細(xì)胞HK1和HONE1的遷移和侵襲,并誘導(dǎo)其發(fā)生鐵死亡,提示Garcinone C具有潛在的抗鼻咽癌作用,為鼻咽癌治療藥物的研發(fā)提供了候選化合物。