張 菡， 韋 丹， 蔡美婷， 尹富強(qiáng)， 劉 夏

鼻咽癌是一種源于鼻咽部的鱗狀上皮細(xì)胞癌，在我國南方地區(qū)和東南亞國家的發(fā)病率較高。2018年全世界報告鼻咽癌病例約12.9萬例[1]。鼻咽癌的臨床治療方法主要有放療以及放療聯(lián)合化療[2]，但鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移極大地降低了晚期鼻咽癌患者的生存率[3]。因此，亟需尋找能夠抑制癌細(xì)胞遷移與侵襲的新化療藥物。氧雜蒽酮類化合物是一類含氧雜環(huán)化合物，具有廣泛的生物活性，具有抗癌[4]、抗艾滋病毒[5]、抗菌[6]等作用，在藥物化學(xué)領(lǐng)域具有重要的意義。近年來的研究顯示，氧雜蒽酮類化合物可以抑制鼻咽癌、乳腺癌、胰腺癌等癌細(xì)胞的增殖[7-8]。Garcinone C是從藥用植物山竹(GarciniamangostanaL)中提取的一種氧雜蒽酮類天然化合物，有報道顯示其在結(jié)腸癌[9]和鼻咽癌[7]具有抗腫瘤活性，但對鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響作用研究未見報道。鑒此，本研究從細(xì)胞層面，以鼻咽癌細(xì)胞系HK1和HONE1作為實驗對象，通過體外實驗檢測不同濃度的Garcinone C對細(xì)胞衰老、遷移及侵襲能力，以及對鐵死亡的影響，探討Garcinone C對鼻咽癌的作用機(jī)制，為鼻咽癌治療藥物的研發(fā)提供候選先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1主要實驗試劑 Garcinone C(分子式為C23H26O7)，由課題組從山竹GarciniamangostanaL果皮中提取、分離并純化[7]。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、杜氏磷酸緩沖鹽溶液(Dulbecco′s phosphate buffered saline，D-PBS)均購自加拿大WISENT公司。胰蛋白酶、抗生素-青霉素鏈霉素均購自美國Gibco Life Technologies公司。蛋白定量BCA試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光液均購自美國Thermo Scientific Pierce公司。β-半乳糖苷酶衰老試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。RIPA細(xì)胞裂解液購自美國Sigma-Aldrich公司。無基質(zhì)膠Transwell小室、含基質(zhì)膠Transwell小室均購自美國Corning公司。0.1%結(jié)晶紫溶液購自北京索萊寶科技有限公司。30%丙烯酰胺、電泳緩沖液、印跡膜轉(zhuǎn)印緩沖液、預(yù)染蛋白Marker均購自上海生工生物工程股份有限公司。PVDF膜購自美國Merck Millipore公司。一抗E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑2(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 2,TIMP2)蛋白、鐵蛋白重鏈1(ferritin heavy chain 1,FTH1)、胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白xCT、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)以及HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(Anti-rabbit IgG)均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2主要儀器 倒置熒光顯微鏡(Olympus,BX53)，恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific,3111)，低溫高速離心機(jī)(Eppendorf,5424R)，-80 ℃超低溫冰箱(Haier,DW-86L628)，低速離心機(jī)(湘儀，TD5A-WS)，全波長酶標(biāo)儀(Thermo Scientific,Multiskan GO)，BD電泳儀(Bio Rad,PowerPac Basic)，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(中國賽智創(chuàng)業(yè)公司，MiniChemi 610Plus型)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 鼻咽癌細(xì)胞株HK1和HONE1受贈于中山大學(xué)腫瘤防治中心錢朝南教授。HK1和HONE1細(xì)胞均使用含有10% FBS、1% 100 U/ml青霉素、0.1 mg/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃的飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～85%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4HONE1細(xì)胞衰老檢測 取對數(shù)生長期的HONE1細(xì)胞接種于12孔板中，每孔600個細(xì)胞，設(shè)置3個平行孔。16 h后用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋Garcinone C母液，并設(shè)置4個濃度梯度(0 μM、2.50 μM、3.75 μM、5.00 μM)以及一個空白對照。培養(yǎng)11 d后吸除孔中的舊培養(yǎng)液，D-PBS洗1遍后用β-半乳糖苷酶固定液室溫固定15 min，每孔500 μl。吸除固定液，以D-PBS洗3遍后加入β-半乳糖苷酶染色工作液，每孔500 μl，置于37 ℃恒溫箱中孵育過夜。第2天取出12孔板，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察計數(shù)并拍照。β-半乳糖苷酶染色液染色后的衰老陽性細(xì)胞呈藍(lán)色，陰性細(xì)胞無著色。

1.5HK1和HONE1細(xì)胞遷移能力檢測 取對數(shù)生長期的HK1和HONE1細(xì)胞，常規(guī)消化、離心，重懸細(xì)胞時使用不含F(xiàn)BS的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，將HK1細(xì)胞懸液稀釋成5×105cells/ml，HONE1為4×105cells/ml。將細(xì)胞接種于Transwell小室的上室中，每孔500 μl，分別設(shè)3個藥物濃度梯度(HK1細(xì)胞組為5.00 μmol/L、7.50 μmol/L、10.00 μmol/L；HONE1組為3.75 μmol/L、5.00 μmol/L、7.50 μmol/L)和一個空白對照。Transwell小室的下室加入含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，每孔750 μl。作用24 h后，取出Transwell小室，吸除小室內(nèi)的培養(yǎng)液，用D-PBS洗2遍后加入4%多聚甲醛750 μl固定20 min，D-PBS洗2遍，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，D-PBS洗2遍后用濕潤的棉簽擦去上室中未遷移的細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。使用Image J軟件計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞遷移比例=藥物處理組遷移細(xì)胞數(shù)/對照組遷移細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6HK1和HONE1細(xì)胞侵襲能力檢測 細(xì)胞侵襲能力檢測實驗方法與上述的細(xì)胞遷移能力檢測實驗方法(方法1.5)相似。不同的是，Transwell小室的基底膜上有一層Matrigel基質(zhì)膠，小室在使用前要先經(jīng)水化：分別向小室的上、下室加入無FBS的DMEM培養(yǎng)基500 μl，在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中水化2 h。細(xì)胞處理24 h后，取出小室，先用濕潤的棉簽將上室中未穿過基底膜的細(xì)胞擦去，再固定、染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，使用Image J軟件計數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞侵襲比例=藥物處理組侵襲細(xì)胞數(shù)/對照組侵襲細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7HK1和HONE1細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白及鐵死亡相關(guān)蛋白檢測 通過Western blot實驗進(jìn)行檢測。取對數(shù)生長期的HK1和HONE1細(xì)胞，接種于10 cm的培養(yǎng)皿中，16 h后分別加入Garcinone C(5.00 μmol/L、7.50 μmol/L、10.00 μmol/L)，每組設(shè)一個空白對照。分別作用24 h、48 h后用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。BCA試劑盒檢測蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)至相同后加熱變性。通過10% SDS-PAGE凝膠電泳90 min分離蛋白質(zhì)，恒壓90 V轉(zhuǎn)膜3 h，5%脫脂奶粉液封閉1 h，4 ℃孵育一抗過夜(N-cadherin、E-cadherin、TIMP2、FTH1、xCT均以1∶1 000稀釋)，第2天孵育二抗(1∶5 000)1 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光顯影，拍照記錄，以GAPDH作為內(nèi)參計算目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1Garcinone C誘導(dǎo)HONE1細(xì)胞衰老實驗結(jié)果 β-半乳糖苷酶染色實驗結(jié)果顯示，梯度濃度Garcinone C(2.50 μmol/L、3.75 μmol/L、5.00 μmol/L)處理HONE1細(xì)胞11 d后，衰老細(xì)胞染色率較空白對照組(0 μmol/L Garcinone C)顯著上升，且有藥物濃度依賴性，四組衰老細(xì)胞染色率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=1 253.695，P<0.001)。見圖1。

光學(xué)顯微鏡下所見(β-半乳糖苷酶染色×200)及四組衰老細(xì)胞染色率比較，與空白對照組比較，aP<0.05；與2.50 μmol/L Garcinone C組比較，bP<0.05；與3.75 μmol/L Garcinone C組比較，cP<0.05

2.2Garcinone C抑制HK1和HONE1細(xì)胞的遷移能力實驗結(jié)果 Transwell細(xì)胞遷移實驗結(jié)果顯示，不同濃度的Garcinone C分別處理HK1和HONE1細(xì)胞24 h后，與空白對照組相比，藥物干預(yù)組中穿過基底膜的細(xì)胞比例顯著減少，且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(HK1細(xì)胞：F=201.208，P<0.001；HONE1細(xì)胞：F=397.185，P<0.001)。見圖2。

?HK1細(xì)胞鏡下所見(結(jié)晶紫染色，×200)及四組穿過基底膜的細(xì)胞比例比較。與0 μmol/L Garcinone C組比較，aP<0.05；與5.00 μmol/L Garcinone C組比較，bP<0.05；與7.50 μmol/L Garcinone C組比較，cP<0.05；?HONE1細(xì)胞鏡下所見(結(jié)晶紫染色，×200)及四組穿過基底膜的細(xì)胞比例比較。與0 μmol/L Garcinone C組比較，aP<0.05；與3.75 μmol/L Garcinone C組比較，bP<0.05；與5.00 μmol/L Garcinone C組比較，cP<0.05

2.3Garcinone C抑制HK1和HONE1細(xì)胞的侵襲能力實驗結(jié)果 Transwell細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果顯示，不同濃度的Garcinone C分別處理HK1和HONE1細(xì)胞24 h后，與空白對照組相比，藥物干預(yù)組中侵襲的細(xì)胞比例顯著減少，且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(HK1細(xì)胞：F=166.242，P<0.001；HONE1細(xì)胞：F=84.964，P<0.001)。見圖3。

?HK1細(xì)胞鏡下所見(結(jié)晶紫染色，×200)及四組穿過含基質(zhì)膠基底膜的細(xì)胞比例比較，與0 μmol/L Garcinone C組比較，aP<0.05；與5.00 μmol/L Garcinone C組比較，bP<0.05；?HONE1細(xì)胞鏡下所見(結(jié)晶紫染色，×200)及四組穿過含基質(zhì)膠基底膜的細(xì)胞比例比較。與0 μmol/L Garcinone C組比較，aP<0.05；與3.75 μmol/L Garcinone C組比較，bP<0.05；與5.00 μmol/L Garcinone C組比較，cP<0.05

2.4不同濃度Garcinone C對HK1和HONE1細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot實驗結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的Garcinone C分別處理HK1和HONE1細(xì)胞后，E-cadherin、TIMP2表達(dá)水平上升(P<0.05)，N-cadherin表達(dá)水平下降(P<0.05)，且有劑量依賴性。見圖4。

?不同濃度Garcinone C對HK1細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，與0 μmol/L Garcinone C組比較，aP<0.05；與5.00 μmol/L Garcinone C組比較，bP<0.05；與7.50 μmol/L Garcinone C組比較，cP<0.05；?不同濃度Garcinone C對HONE1細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，與0 μmol/L Garcinone C組比較，aP<0.05；與5.00 μmol/L Garcinone C組比較，bP<0.05；與7.50 μmol/L Garcinone C組比較，cP<0.05

2.5不同濃度Garcinone C對HK1和HONE1細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot實驗結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度的Garcinone C分別處理HK1和HONE1細(xì)胞后，F(xiàn)TH1和xCT蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

?不同濃度Garcinone C對HK1細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，與0 μmol/L Garcinone C組比較，aP<0.05；與5.00 μmol/L Garcinone C組比較，bP<0.05；與7.50 μmol/L Garcinone C組比較，cP<0.05；?不同濃度Garcinone C對HONE1細(xì)胞鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，與0 μmol/L Garcinone C組比較，aP<0.05；與5.00 μmol/L Garcinone C組比較，bP<0.05；與7.50 μmol/L Garcinone C組比較，cP<0.05

3 討論

3.1廣西是鼻咽癌高發(fā)的地區(qū)，鼻咽癌病理類型多為非角化型鱗狀細(xì)胞癌[10]。原發(fā)鼻咽癌的治療主要以放療或放化療結(jié)合為主，部分患者會出現(xiàn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到其他器官，包括骨、肺、肝和遠(yuǎn)處淋巴結(jié)等[4]。轉(zhuǎn)移病例的治療仍是以化療為主，但耐藥率較高[11]。局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是鼻咽癌治療失敗的主要原因[12]，因此，亟需尋找新的化療藥物。

3.2天然產(chǎn)物是抗腫瘤新藥研發(fā)的重要途徑之一。山竹是一種藤黃屬植物，含有一類特殊的化學(xué)物質(zhì)——氧雜蒽酮類化合物，包括gartanin、β-mangostin、γ-mangostin、Garcinone E和Garcinone C等。有研究表明這些氧雜蒽酮類化合物具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性[12]。Chen等[9]研究發(fā)現(xiàn)，Garcinone C可以通過調(diào)節(jié)Hedgehog信號通路在體內(nèi)外抑制結(jié)腸腫瘤的發(fā)生。Garcinone E與Garcinone C同為山竹果皮提取的蒽醌類化合物。已有研究表明，Garcinone E可以抑制卵巢癌[13]和鼻咽癌[14]的轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果也顯示，Garcinone C可顯著抑制HK1和HONE1細(xì)胞遷移和侵襲，誘導(dǎo)HONE1細(xì)胞衰老，誘導(dǎo)HK1和HONE1細(xì)胞的鐵死亡。

3.3天然產(chǎn)物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老是抑制腫瘤發(fā)展的主要途徑之一，可使癌細(xì)胞永久性喪失增殖能力，達(dá)到抗腫瘤效果。癌細(xì)胞的遷移和侵襲與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)密切相關(guān)。EMT是一個發(fā)育過程，是指極化后的上皮細(xì)胞停止維持細(xì)胞間的接觸，失去細(xì)胞極性，并獲得間充質(zhì)細(xì)胞特性，如運(yùn)動性、收縮能力和侵襲性[15]。在EMT進(jìn)程中，通常伴隨著N-cadherin表達(dá)上調(diào)及E-cadherin表達(dá)下調(diào)。E-cadherin是介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間同質(zhì)性黏附的主要蛋白，E-cadherin表達(dá)下調(diào)被廣泛認(rèn)為是EMT發(fā)生的標(biāo)志[16]。因此，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)EMT，抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。有研究顯示，上調(diào)E-cadherin可以顯著抑制鼻咽癌[17]、乳腺癌[18]細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。細(xì)胞外基質(zhì)是防止腫瘤細(xì)胞侵襲的天然屏障，基質(zhì)金屬酶是誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生降解的重要蛋白酶，TIMP2是基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制因子，在多種腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)[19]。有研究表明，上調(diào)TIMP2表達(dá)可以抑制卵巢癌和肝癌細(xì)胞的侵襲[13，20]。

3.4鐵死亡是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞程序性死亡的機(jī)制，當(dāng)鐵依賴性脂質(zhì)過氧化物積累到一定程度時就會觸發(fā)鐵死亡[21]。越來越多的證據(jù)表明，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡具有治療癌癥的可能，特別是對傳統(tǒng)治療方法產(chǎn)生耐藥性的侵襲性惡性腫瘤[22]。在鐵死亡過程中，F(xiàn)TH1和xCT蛋白表達(dá)下調(diào)。FTH1具有鐵氧化酶活性[23]，可促進(jìn)鐵吸收[24]。在鐵死亡過程中，對細(xì)胞鐵平衡的維持起重要作用[25]。相關(guān)研究表明，在膀胱癌[26]、肝癌[27]細(xì)胞中FTH1下調(diào)表達(dá)，誘導(dǎo)鐵死亡，抑制癌癥發(fā)展。xCT是一種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可被還原為半胱氨酸，用于谷胱甘肽的合成。通過抑制xCT，減少谷胱甘肽合成，是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡的有效途徑[28]。有研究證明，在胃癌[29]、乳腺癌[30]細(xì)胞中，下調(diào)xCT的表達(dá)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。在本研究中，經(jīng)Garcinone C處理鼻咽癌細(xì)胞，F(xiàn)TH1和xCT表達(dá)下調(diào)，提示Garcinone C可通過誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，抑制腫瘤發(fā)展。

綜上所述，Garcinone C可逆轉(zhuǎn)EMT過程，抑制鼻咽癌細(xì)胞HK1和HONE1的遷移和侵襲，并誘導(dǎo)其發(fā)生鐵死亡，提示Garcinone C具有潛在的抗鼻咽癌作用，為鼻咽癌治療藥物的研發(fā)提供了候選化合物。