閆 鋒

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院齊齊哈爾分院，黑龍江齊齊哈爾 161006)

谷子(Setariaitalica)起源于我國(guó)，據(jù)考古遺存證明谷子在我國(guó)已經(jīng)有7 000多年的栽培歷史，在我國(guó)悠久的農(nóng)耕文明中占有重要地位。谷子具有耐瘠薄、營(yíng)養(yǎng)豐富、耐旱等優(yōu)點(diǎn)，種植區(qū)域主要分布在黃河以北干旱、半干旱地區(qū)，是該地區(qū)重要的糧飼兼用作物[1-2]。長(zhǎng)久以來我國(guó)谷子主產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)上應(yīng)用的品種不抗除草劑，田間除草主要依靠人工，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，是限制谷子產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的限制因素之一[3]。隨著20世紀(jì)90年代，河北省農(nóng)林科學(xué)院在世界上率先創(chuàng)制出并大力推廣抗拿撲凈、咪唑啉酮等不同抗性谷子除草劑品種(冀谷系列)，我國(guó)谷子育種及谷子產(chǎn)業(yè)迎來了革命性的變革[4-5]。由于目前生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的抗除草劑谷子品種多為夏谷，且生育期普遍較長(zhǎng)，因此，選育適合春谷區(qū)種植的早熟抗除草劑春谷品種不僅能夠?yàn)楫?dāng)?shù)剞r(nóng)民脫貧致富提供幫助，而且能夠大力推進(jìn)當(dāng)?shù)毓茸赢a(chǎn)業(yè)發(fā)展。

在長(zhǎng)期的人工種植馴化過程中，尤其是近幾十年育種家們對(duì)谷子育種目標(biāo)的趨同化，經(jīng)過不斷的人工選擇，致使谷子遺傳基礎(chǔ)越來越狹窄，一些特異谷子資源慢慢消失。種質(zhì)資源是生物多樣性的重要組成部分，是新品種選育和種質(zhì)創(chuàng)新的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[6]。種質(zhì)資源創(chuàng)新的手段有多種，傳統(tǒng)的雜交、回交、系圃選擇等方式，育種周期較長(zhǎng)，且不易選擇到目標(biāo)性狀?；瘜W(xué)誘變開始于20世紀(jì)初期[7]，氮化鈉(NaN3)、甲基磺酸乙酯(EMS)、秋水仙素等化學(xué)藥劑在作物誘變育種中得到廣泛應(yīng)用[8]。其中，EMS是一種最常用的烷化劑，可直接使鳥嘌呤N-7的位置發(fā)生改變，從而導(dǎo)致DNA結(jié)構(gòu)產(chǎn)生誘變效果，EMS誘變不僅具有突變頻率高的優(yōu)點(diǎn)，而且使用成本較低、操作簡(jiǎn)單[9]。目前，已經(jīng)在藜麥、水稻、玉米、大豆等多種作物誘變育種中得到廣泛應(yīng)用，對(duì)推動(dòng)作物遺傳改良和資源創(chuàng)新起到了重要作用[10]。

目前，有關(guān)谷子EMS誘變效應(yīng)方面的研究報(bào)道較少。李顏方等對(duì)晉谷21進(jìn)行不同浸種濃度及時(shí)間的誘變處理，結(jié)果表明，晉谷21號(hào)種子的發(fā)芽勢(shì)與發(fā)芽率均隨著EMS濃度的增大而降低，且莖長(zhǎng)和胚根長(zhǎng)受抑制，最終確定1.0% EMS處理10 h為晉谷21號(hào)種子的最佳誘變條件；M1代植株出現(xiàn)白化苗、黃化苗、分蘗等現(xiàn)象[11]。李偉等采用裂區(qū)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以誘變時(shí)間為主區(qū)，EMS濃度為副區(qū)，對(duì)豫谷1號(hào)種子進(jìn)行誘變處理，研究發(fā)現(xiàn)豫谷1號(hào)的適宜誘變條件為清水浸種過夜，1.0% EMS處理8 h[12]。

公谷88因適口性好、產(chǎn)量高、外觀品質(zhì)佳，己成為吉林省的主栽谷子品種，但受生育期限制，難以在黑龍江地區(qū)推廣。本研究以抗除草劑春谷品種公谷88為材料，擬通過研究不同浸種時(shí)間及EMS濃度對(duì)谷子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、幼苗理化指標(biāo)等產(chǎn)生的影響，從而確定公谷88的EMS誘變適宜條件，以期為創(chuàng)建谷子突變體庫(kù)及拓寬中早熟春谷抗除草劑種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試劑

試驗(yàn)于2021年在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院齊齊哈爾分院試驗(yàn)室進(jìn)行，選取由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物資源研究所選育的公谷88作為試驗(yàn)材料，該品種2019年通過國(guó)家非主要農(nóng)作物品種登記，EMS誘變劑由美國(guó)麥克林公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 EMS處理方法 選取成熟度好的公谷88種子，用蒸餾水浸種3 h吸脹后瀝干水分備用。用0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH值為7.0)配制體積分?jǐn)?shù)分別為0.4%、0.8%、1.2%的EMS溶液，以磷酸緩沖液為對(duì)照。每個(gè)處理取100粒吸脹后的種子，置于200 mL三角瓶中，每個(gè)瓶中加入50 mL不同體積濃度的EMS溶液，置于100 r/min的搖床中均勻搖晃6、10、14 h，重復(fù)3次。將誘變處理后的谷種置于水龍頭下沖洗2 h，播種于直徑為10 cm的塑料花盆中(每盆播10粒種子)，播種深度為1.5 cm。然后將花盆置于濕度為60%、溫度為28 ℃、光照—黑暗比為10 h—14 h的人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)，發(fā)芽期間各處理澆水量一致。

1.2.2 種子發(fā)芽及幼苗形態(tài)指標(biāo)測(cè)定 播種5 d后調(diào)查各處理發(fā)芽勢(shì)、10 d后調(diào)查發(fā)芽率，出苗 10 d 后在各處理中隨機(jī)挑選10株幼苗測(cè)量莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)。出苗20 d后統(tǒng)計(jì)成苗率，計(jì)算公式如下：

發(fā)芽勢(shì)=播種5 d后發(fā)芽數(shù)/供試種子總粒數(shù)×100%；

發(fā)芽率=播種10 d后發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

成苗率=成活苗數(shù)/供試種子數(shù)×100%。

1.2.3 電導(dǎo)率的測(cè)定 取每個(gè)誘變處理后的種子50粒，稱質(zhì)量，用自來水沖洗2 h后，置于小燒杯中，倒入 10 mL 蒸餾水浸泡，30 min后測(cè)定種子浸出液電導(dǎo)率，以空白蒸餾水為對(duì)照。

1.2.4 生理指標(biāo)測(cè)定 出苗5 d后選取幼苗第1張葉片進(jìn)行各項(xiàng)理化指標(biāo)的測(cè)定。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法進(jìn)行測(cè)定[13]，過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法進(jìn)行測(cè)定[14]，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定[15]。

1.2.5 SPAD值測(cè)定 出苗后5 d在每個(gè)處理中隨機(jī)選取10株幼苗，采用日本柯尼卡美能達(dá)公司生產(chǎn)的 SPAD-502 型測(cè)定儀測(cè)定谷子第1張葉片的葉綠色相對(duì)含量(SPAD值)。

1.2.6 半致死劑量的確定 參照王兆玉等的分析方法[16]，對(duì)谷子成苗率與EMS濃度進(jìn)行回歸分析，計(jì)算不同處理時(shí)間下EMS濃度的半致死劑量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及作圖，采用DPS 7.05軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS處理對(duì)電導(dǎo)率的影響

由圖1可知，當(dāng)EMS濃度為0時(shí)，種子浸出液電導(dǎo)率處于較低的水平(電導(dǎo)率<0.1 mS/cm)，經(jīng)過EMS處理后，種子浸出液電導(dǎo)率相比對(duì)照大幅升高，隨著EMS濃度升高及浸種時(shí)間延長(zhǎng)，電導(dǎo)率也隨之增加，但是總體增長(zhǎng)幅度有所放緩，6、10、14 h 3種浸種時(shí)間處理下，電導(dǎo)率均在EMS濃度為1.2%時(shí)達(dá)到最高，分別為0.43、0.56、0.58。說明隨著EMS濃度增加及浸種時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞質(zhì)膜受害嚴(yán)重，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)滲漏。

2.2 EMS處理對(duì)谷子萌發(fā)的影響

2.2.1 EMS處理對(duì)發(fā)芽勢(shì)的影響 由表1可知，隨著浸種時(shí)間延長(zhǎng)及EMS處理濃度增加，谷子種子的發(fā)芽勢(shì)呈逐漸降低的變化規(guī)律，均顯著低于對(duì)照，說明EMS對(duì)谷子種子萌發(fā)有抑制作用。在同一浸種時(shí)間下，不同濃度EMS處理之間谷子的發(fā)芽勢(shì)存在一定差異。當(dāng)處理時(shí)間為6 h時(shí)，EMS各濃度處理之間的發(fā)芽勢(shì)均呈顯著性差異；當(dāng)浸種時(shí)間為10 h時(shí)，1.2% EMS處理下谷子的發(fā)芽勢(shì)顯著低于0.4% EMS處理和0.8% EMS處理，0.4% EMS處理和0.8% EMS處理之間差異不顯著；當(dāng)處理時(shí)間為14 h時(shí)，0.4% EMS處理與0.8% EMS處理間發(fā)芽勢(shì)差異不顯著，0.4%濃度處理下發(fā)芽勢(shì)顯著高于1.2%濃度處理。說明不同浸種時(shí)間及EMS濃度對(duì)谷子種子發(fā)芽勢(shì)的影響不同。

2.2.2 EMS處理對(duì)發(fā)芽率的影響 由表1可知，不同浸種時(shí)間及EMS濃度對(duì)谷子發(fā)芽率有較大影響，其變化規(guī)律基本與發(fā)芽勢(shì)相同，隨著浸種時(shí)間延長(zhǎng)及EMS濃度增加，發(fā)芽率逐漸降低。在同一浸種時(shí)間下，不同濃度EMS處理之間谷子的發(fā)芽率存在一定差異。當(dāng)處理時(shí)間為6 h時(shí)，0.4% EMS處理的發(fā)芽率與對(duì)照差異不顯著，但是顯著高于0.8%、1.2% EMS處理；當(dāng)浸種時(shí)間為10 h時(shí)，EMS各濃度處理之間的發(fā)芽率均呈顯著性差異；當(dāng)處理時(shí)間為14 h時(shí)， 0.8% EMS處理與1.2% EMS處理間發(fā)芽率差異不顯著，但均顯著低于0.4% EMS處理。

表1 EMS處理對(duì)谷子發(fā)芽的影響

2.2.3 EMS對(duì)成苗率的影響及半致死劑量的確定 由圖2可知，不同浸種時(shí)間及EMS濃度對(duì)谷子成苗率影響較大，其變化趨勢(shì)與發(fā)芽率大體一致。不同浸種時(shí)間下，同一濃度EMS處理下谷子的成苗率存在一定差異。浸種14 h處理下，各EMS處理濃度下的成苗率均大幅低于浸種6 h及10 h處理。以成苗率為因變量(y)，EMS濃度為自變量(x)，通過回歸方程(圖2)統(tǒng)計(jì)出公谷88在浸種6、10、14 h下EMS處理的半致死劑量分別為1.01%、0.75%、0.39%。

2.3 EMS處理對(duì)谷子幼苗生長(zhǎng)的影響

2.3.1 EMS處理對(duì)苗高的影響 由圖3可知，谷子種子經(jīng)過EMS處理后，莖長(zhǎng)隨著浸種時(shí)間的延長(zhǎng)及EMS處理濃度的增加呈逐漸下降的趨勢(shì)，但是在相同的浸種時(shí)間下，不同EMS處理之間莖長(zhǎng)下降的程度不同，在6 h浸種時(shí)間下，只有1.2% EMS處理的莖長(zhǎng)顯著低于對(duì)照，另外2個(gè)處理與對(duì)照差異不顯著；10 h浸種時(shí)間下，0.4% EMS處理的莖長(zhǎng)與對(duì)照差異不顯著，但顯著高于其他2個(gè)處理；14 h浸種時(shí)間下，各EMS處理之間均呈顯著性差異。由此隨著浸種時(shí)間的延長(zhǎng)及EMS處理濃度的增加，谷子地上部生長(zhǎng)受到的抑制作用越來越大，1.2% EMS浸種14 h處理下的莖長(zhǎng)最小，為5.1 cm，比對(duì)照降低43.3%。

2.3.2 EMS處理對(duì)根長(zhǎng)的影響 谷子經(jīng)過EMS處理后根長(zhǎng)的變化規(guī)律與莖長(zhǎng)大體一致(圖3)，總體來看谷子根長(zhǎng)隨著EMS濃度升高及處理時(shí)間延長(zhǎng)逐漸受到抑制。在6 h和10 h浸種時(shí)間下，0.4%EMS處理下的根長(zhǎng)生長(zhǎng)受到抑制作用不顯著，與對(duì)照差異不顯著，但顯著高于另外2個(gè)EMS處理；隨著浸種時(shí)間延長(zhǎng)，谷子根長(zhǎng)受到抑制作用逐漸加大，10 h浸種時(shí)間下對(duì)照與各處理的根長(zhǎng)達(dá)顯著性差異。綜合來看，1.2% EMS浸種14 h處理下的根長(zhǎng)最小，為8.8 cm，比對(duì)照降低51.6%。

2.4 EMS處理對(duì)幼苗生理指標(biāo)的影響

2.4.1 EMS處理對(duì)幼苗抗氧化酶活性的影響 由圖4可知，經(jīng)過EMS浸種處理后，同一浸種時(shí)間下谷子幼苗葉片中SOD活性變化規(guī)律并不一致，但隨著EMS處理濃度的增加，總體呈逐漸上升的趨勢(shì)，在浸種時(shí)間為6 h時(shí)，SOD活性呈逐漸上升的趨勢(shì)，0.4% EMS處理下與對(duì)照差異不顯著，但是顯著低于其他處理。10 h和14 h浸種時(shí)間下，SOD活性呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，10 h浸種時(shí)間下，SOD活性在0.8% EMS處理下達(dá)到最高，但與1.2% EMS處理間差異不顯著。14 h浸種時(shí)間下SOD活性在EMS濃度為0.4%時(shí)達(dá)到最高?？傮w來看隨著浸種時(shí)間的延長(zhǎng)SOD活性峰值出現(xiàn)的EMS濃度逐漸降低。

經(jīng)過EMS處理后POD活性的變化規(guī)律與SOD大體一致(圖4)，同一浸種時(shí)間下，各EMS處理的POD活性均顯著高于對(duì)照。6 h浸種時(shí)間下，POD活性隨浸種濃度增加而升高，并在1.2% EMS處理下達(dá)到最大值。10 h浸種時(shí)間下，POD活性呈先升高后降低的變化規(guī)律，POD活性在EMS濃度為0.8%時(shí)達(dá)到最高，隨后下降，但與1.2% EMS處理差異不顯著。14 h浸種時(shí)間下，POD活性同樣呈先升高后降低的變化規(guī)律，只是POD活性峰值出現(xiàn)在EMS濃度為0.4%時(shí)。

2.4.2 EMS處理對(duì)幼苗過氧化產(chǎn)物的影響 由圖5可知，不同的浸種時(shí)間下，谷子幼苗葉片中MDA含量隨著浸種時(shí)間延長(zhǎng)及EMS濃度增加，均呈逐漸上升的變化趨勢(shì)。6 h浸種時(shí)間下，0.4% EMS處理的MDA含量與對(duì)照差異不顯著，但顯著低于其他處理；10 h浸種時(shí)間下， 各處理間MDA含量均呈顯著性差異；14 h浸種時(shí)間下，0.4%和0.8% EMS處理的MDA含量差異不顯著。所有處理中浸種 14 h，濃度為1.2%時(shí)，MDA含量最高，為7.1 μmol/L，顯著高于對(duì)照45.8%。

2.5 EMS處理對(duì)幼苗SPAD值的影響

葉綠素含量的消長(zhǎng)規(guī)律是反映葉片生理活性變化的重要指標(biāo)之一，與葉片光合能力有密切關(guān)系。由圖6可知，隨著浸種時(shí)間延長(zhǎng)及EMS處理濃度增加，公谷88的SPAD值呈逐漸下降的趨勢(shì)，除了0.4% EMS濃度下浸種6 h處理下的SPAD值與對(duì)照差異不顯著外，其他處理均與對(duì)照呈顯著性差異。在1.2% EMS濃度中浸種14 h的SPAD值最低，為19.4，比對(duì)照低40.7%。

3 討論與結(jié)論

EMS誘變不僅能夠抑制種子萌發(fā)，還會(huì)抑制幼苗生長(zhǎng)。前人的研究結(jié)果表明，EMS濃度越高，其溶解的過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸越多，對(duì)種子的毒害作用越強(qiáng)，但是在低濃度EMS處理下脅迫作用較弱[17]。浸種時(shí)間和濃度是決定誘變效果的關(guān)鍵因素，研究顯示，不同物種對(duì)EMS的敏感度不同，這可能與種子的結(jié)構(gòu)、種皮的透水性、種子的大小及種子內(nèi)部的休眠機(jī)制有關(guān)。云娜等研究發(fā)現(xiàn)，以成苗率達(dá)半致死量為衡量標(biāo)準(zhǔn)，1.5% EMS浸種15 h和1.1% EMS浸種21 h可作為EMS誘變蒙農(nóng)紅豆草建立突變體庫(kù)的適宜條件[18]。秦思思等的研究結(jié)果表明，EMS濃度為3.0%、處理時(shí)間為8 h時(shí)，其相對(duì)發(fā)芽率最接近半致死濃度的相對(duì)發(fā)芽率，為醉魚草EMS誘變體庫(kù)建立的適宜條件[19]。前人利用EMS對(duì)谷子也做過一些相應(yīng)研究，長(zhǎng)農(nóng)35號(hào)和豫谷1號(hào)的EMS最佳誘變條件是1.0% EMS浸種 8 h[12，20]，本研究以公谷88相對(duì)成苗率達(dá)到半致死劑量為標(biāo)準(zhǔn)，通過回歸方程計(jì)算出公谷88在浸種時(shí)間6、10、14 h條件下EMS處理濃度的半致死劑量分別為1.01%、0.75%、0.39%，可作為EMS誘變谷子建立突變體庫(kù)的適宜條件。

郭曉珊等對(duì)番茄種子進(jìn)行6種EMS濃度處理，結(jié)果表明EMS處理對(duì)不同品種番茄的胚軸和胚根生長(zhǎng)有明顯的抑制作用[21]。伊風(fēng)艷等用9種濃度EMS對(duì)苜蓿種子進(jìn)行處理，結(jié)果表明，低濃度EMS對(duì)苜蓿幼苗高無顯著影響，隨著EMS處理濃度的升高，幼苗生長(zhǎng)逐漸被抑制[22]。本研究分析結(jié)果顯示，在0.4%EMS濃度下浸種6 h處理下公谷88幼苗的莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)與對(duì)照差異不顯著。隨著EMS濃度的增加及浸種時(shí)間延長(zhǎng)，谷子幼苗生長(zhǎng)逐漸受到抑制，1.2%EMS濃度下浸種14 h對(duì)公谷88生長(zhǎng)抑制程度最嚴(yán)重。

植物種子經(jīng)過不同濃度EMS處理后，細(xì)胞膜會(huì)受到不同程度的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物滲漏，而使種子浸出液電導(dǎo)率不同[23]。超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)是植物體內(nèi)主要的抗氧化酶，植物受到的脅迫，抗氧化酶活性增高，用于清除活性氧，這是植物體對(duì)自身的重要保護(hù)機(jī)制[24]。EMS處理后植物細(xì)胞內(nèi)會(huì)發(fā)生一些生化反應(yīng)，產(chǎn)生有害物質(zhì)，而抗氧化酶可有效地清除這些有害物質(zhì)，因此，在一定EMS濃度范圍內(nèi)對(duì)種子進(jìn)行處理，SOD、POD活性會(huì)增加，但當(dāng)EMS濃度過大時(shí)，會(huì)造成植物細(xì)胞失活，從而使SOD、POD活性下降。本研究中SOD、POD活性隨著浸種時(shí)間和EMS處理濃度的上升呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，這與前人的研究結(jié)果相一致。

本研究針對(duì)EMS誘變的濃度和時(shí)間2個(gè)因素對(duì)谷子種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響做了研究，初步確定了適合公谷88誘變的EMS濃度和時(shí)間組合，可為今后建立谷子突變體庫(kù)、豐富適宜黑龍江省生態(tài)條件谷子育種材料及加快谷子育種進(jìn)程提供參考。但如何對(duì)誘變后的植株進(jìn)行鑒定分析，如何篩選具有目的性狀的變異植株，需要進(jìn)一步探究。另一方面，由于本研究中只有1個(gè)品種，所有研究結(jié)論都只適用于公谷88，其分析結(jié)果是否具有普遍性、指導(dǎo)性還須通過進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證。

EMS處理對(duì)谷子種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、理化指標(biāo)及存活率具有抑制作用，低劑量處理(0.4%、6 h)下，對(duì)公谷88的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)及各項(xiàng)理化指標(biāo)(POD活性除外)影響不顯著。隨著浸種時(shí)間及EMS濃度增加，種子萌發(fā)指標(biāo)與幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)與對(duì)照相比顯著降低；生理指標(biāo)中SOD和POD活性隨著浸種時(shí)間及EMS濃度增加呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，MDA呈逐漸升高、SPAD值呈逐漸降低的變化趨勢(shì)。以成苗率達(dá)到半致死劑量為標(biāo)準(zhǔn)，通過回歸方程計(jì)算出在浸種時(shí)間6、10、14 h下EMS處理濃度的半致死劑量分別為1.01%、0.75%、0.39%，可作為EMS誘變公谷88建立突變體庫(kù)的適宜條件。