夏瑾華， 李丹丹， 李 然， 劉賢泥， 劉子捷， 羅 冰， 歐麗佳

(1.上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江西上饒 334001； 2.上饒農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新研究院，江西上饒 334001；3.上饒市藥食同源植物資源保護(hù)與利用重點實驗室，江西上饒 334001； 4.上饒市三葉青保育與利用技術(shù)創(chuàng)新中心，江西上饒 334001)

懷玉山三葉青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg cv. Huaiyushan)，屬葡萄科崖爬藤屬植物，為我國特有珍稀藥用植物，也是江西省上饒市玉山縣特產(chǎn)和國家地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品，主要分布在以懷玉山山脈為中心的贛、浙、皖、閩相交的海拔800 m以上的高山山區(qū)[1]。南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室的鄧澤元教授、孫永教授及其團(tuán)隊對懷玉山三葉青莖葉抗癌活性成分、塊根黃酮類成分及其藥理學(xué)作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)懷玉山三葉青莖葉抗癌活性成分有牡荊素鼠李糖苷、異牡荊素鼠李糖苷、異牡荊素和牡荊素等，塊根黃酮類成分有山奈酚蕓香糖苷、蘆丁、異槲皮苷、兒茶素、紫云英苷等[2]，這些化學(xué)成分不但能減慢癌細(xì)胞生長、抑制癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，還可作為癌癥預(yù)防治療的功能性食品[3-7]。此外，懷玉山三葉青具有較強(qiáng)的抗炎解熱活性[8]。2020年2月7日，上饒市衛(wèi)健委印發(fā)《上饒市新型冠狀病毒感染的肺炎中醫(yī)藥防治方案(試行)》，其中懷玉山三葉青為新型冠狀病毒感染臨床治療期的推薦處方成分?；颊咴诮邮苋~青治療觀察后，發(fā)熱、咳嗽、乏力等呼吸道癥狀有明顯改善[9]。煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV)屬帚狀病毒科(Vigaviridae)煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)病毒，可侵染 36 個科的 400 多種植物，每年給全世界農(nóng)作物造成的經(jīng)濟(jì)損失在1億美元以上[10]。目前有研究表明，煙草病毒復(fù)制蛋白2(tobamovirus multiplication protein 2，TOM2A)可以與來自西紅柿煙草花葉病毒(tomato mosaic virus，ToMV)感染原生質(zhì)體的溶解膜130、180 ku的西紅柿花葉病毒復(fù)制蛋白(tomato mosaic virus replication proteins)共純化[11]；TOM2A主要定位于液泡膜上，130、180 ku的西紅柿花葉病毒復(fù)制蛋白和合成煙草病毒相關(guān)RNA的活性與液泡膜部分相關(guān)[12]；TOM2A在酵母中可以與煙草病毒復(fù)制蛋白1(tobamovirus multiplication protein 1，TOM1)相互作用，TOM2A對于膜上煙草花葉病毒(TMV)-Cg復(fù)制復(fù)合物的形成和/或維持起重要作用[13]。筆者所在課題組在對懷玉山三葉青2個栽培種的轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)了TOM2A的亞型即TOM2A-like[8]。本研究將利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)克隆懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like(tobamovirus multiplication protein 2A-like，TP2A-like)基因，并采用生物信息學(xué)方法、煙草轉(zhuǎn)基因技術(shù)和實時定量 PCR進(jìn)行序列、功能和組織表達(dá)分析，為揭示懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)，為從分子水平調(diào)控懷玉山三葉青煙草花葉病毒增殖提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為懷玉山三葉青2個栽培種懷玉1號和懷玉2號的試管苗。試驗時間為2021年4—10月。試驗地點為上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 用Trizol 試劑提取懷玉山三葉青懷玉2號試管苗的總 RNA，提取步驟按說明書進(jìn)行，使用紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的濃度和完整性。以提取獲得的 RNA為模版，按照逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV) cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成 cDNA 第一鏈。逆轉(zhuǎn)錄引物用 Oligo(dT) 18：5′-G G C C A C G C G T C G A C T A G T A C T T T T T T T T T T T T T T T T T T-3′，CDNA合成具體步驟按M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行。

1.2.2 煙草病毒增殖蛋白2A-like基因的克隆 利用轉(zhuǎn)錄組組裝的Unigene序列信息(TRINITY_DN36028_c0_g3)，運用 Primer Premier 5.0 設(shè)計引物(F：5′-A T G G C G T G C C G A G G T T G C-3′；R：5′-C A T G A T G G T G C A T C G G C T C C-3′)。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 預(yù)變性 2 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將含有目的基因的條帶與 pMD19-T 載體連接并用熱激法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞大揚桿菌(Escherichiacoli)DH5α，經(jīng)鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 煙草病毒增殖蛋白2A-like基因的生物信息學(xué)分析 采用尹明華等的方法[14]對煙草病毒增殖蛋白2A-like基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2.4 基因克隆和載體構(gòu)建 以提供的目的基因序列設(shè)計引物(去掉終止密碼子TAG/TAA/TGA)[CZ-TP2A-like-BamHⅠ-GFPF：5′-A T G T C T A G A C T C G A GA T G G C G T G C C G A G G T T G C-3′；CZ-TP2A-like-BamHⅠ-GFPR：5′-G G C C G C T G T A C A C A TC A T G A T G G T G C A T C G G C T C C-3′(下劃線的堿基組成為載體同源重組序列)]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(總體積50 μL)包括17 μL ddH2O、25 μL 2×Phanta Max Buffer、1 μL dNTP Mix(10 mmol/L each)、2 μL模板DNA、2 μL引物1(10 μmol/L)、2 μL引物2(10 μmol/L)和1 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymease(1 U/μL)。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 30 s；95 ℃變性15 s，59 ℃ 退火15 s，72 ℃延伸1 min，39個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。將條帶切膠回收，即為目的基因片段。用BamHⅠ酶切載體pCambia2301-KY-GFP線性化，回收后和目的基因片段重組反應(yīng)。酶切反應(yīng)體系包括2 μL 10×K /10×L Buffer、5 μL 載體質(zhì)粒、2 μLBamHⅠ/KpnⅠ和ddH2O(補(bǔ)足至40 μL)。酶切產(chǎn)物純化后與上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行重組反應(yīng)。重組連接反應(yīng)體系(總體積10 μL)包括4 μL 線性化載體、1 μL 插入片段、2 μL 5×CE Ⅱ Buffer、1 μL Exnase Ⅱ和ddH2O(補(bǔ)足至10 μL)。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞。挑取PCR陽性的轉(zhuǎn)化子搖菌培養(yǎng)提取質(zhì)粒，同時對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。擴(kuò)增和測序引物為插入目的基因兩側(cè)的載體序列，分別為35S-F：5′-G A C G C A C A A T C C C A C T A T C C-3′；GFP-JR：5′-G G G T G A G C T T G C C G T A G G T G G-3′。

1.2.5 煙草葉片亞細(xì)胞定位 采用尹明華等的方法[14]對煙草病毒增殖蛋白2A-like基因進(jìn)行煙草葉片亞細(xì)胞定位。

1.2.6 煙草病毒增殖蛋白2A-like轉(zhuǎn)基因株系PCR檢測 煙草葉片用農(nóng)桿菌侵染后均經(jīng)過4次篩選/繼代，誘導(dǎo)出抗性芽，再轉(zhuǎn)入伸長培養(yǎng)基中。采用PCR對其再生苗進(jìn)行鑒定，得到煙草病毒增殖蛋白2A-like基因的煙草轉(zhuǎn)基因株系。引物F： 5′-A T G G C G G C G T G C C G G G G W T-3′；R：5′-C A T T A C G R T G C A A C G G C T C C-3′。2×TaqMaster Mix擴(kuò)增體系(共20 μL)包括7 μL ddH2O、10 μL 2×TaqMaster Mix、1 μL 模板DNA、1 μL引物1(10 μmol/L)、1 μL引物2 (10 μmol/L)。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火 30 s ，72 ℃延伸 60 sec/kb，35個循環(huán)；72 ℃徹底延伸5 min。

1.2.7 煙草病毒增殖蛋白2A-like轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因株系移栽苗的病毒接種和光合指標(biāo)檢測 采用尹明華等的方法[14]對煙草病毒增殖蛋白2A-like轉(zhuǎn)基因株系和非轉(zhuǎn)基因株系移栽苗的病毒接種和光合指標(biāo)進(jìn)行檢測。

1.2.8 煙草病毒增殖蛋白2A-like基因的組織表達(dá)分析 分別取懷玉山三葉青2個栽培種懷玉1號和懷玉2號試管苗的根、莖、葉RNA各500 ng，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。熒光定量 PCR(qRT-PCR，SYBR GreenⅠ)檢測內(nèi)參基因為GAPDH。設(shè)計引物為R：5′-G C T T T G G G C A G T T T A T C C-3′；F：5′-T T C C A G C G A A A C C C T T A C-3′。qRT-PCR 檢測采用 20 μL 反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)程序： 95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 變性10 s，52 ℃ 退火34 s， 95 ℃延伸15 s，40個循環(huán)。使用 2-ΔΔCT法計算基因表達(dá)水平。試驗重復(fù)3次。所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，并使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，應(yīng)用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗煙草病毒增殖蛋白 2A-like基因組織表達(dá)的差異顯著性(α=0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因cDNA序列、氨基酸序列和親疏水性分析

通過PCR擴(kuò)增，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因cDNA總長度為828 bp(圖1)，G+C 含量為46.50%(圖2)。

ProtParam預(yù)測的懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like氨基酸序列見圖3。懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like由275個氨基酸組成，分子量為30 728.97 u，等電點為5.39，為疏水性蛋白。

各氨基酸的數(shù)量和比例詳見表1。帶負(fù)電殘基的氨基酸(Asp+Glu)總數(shù)為28個，帶正電荷殘基(Arg+Lys)總數(shù)為26個。序列的N端和C端均為M(Met)。失穩(wěn)指數(shù)(II)計算為47.71，說明該蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

表1 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like氨基酸的數(shù)量和比例

由圖4可知，高峰值(正值)的區(qū)域表示疏水的區(qū)域，而負(fù)值的低谷區(qū)域是親水區(qū)域。疏水性分析結(jié)果表明，最大疏水值為4.0左右，在該多肽中說明該處的疏水性最強(qiáng)；親水峰最大值為-2.5左右，整個蛋白質(zhì)表現(xiàn)出高度的疏水性，說明該蛋白為疏水性蛋白質(zhì)。

2.2 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)分析

李小樹發(fā)火了，我第一次見到李小樹對大黑貓發(fā)那么大的火，他氣急敗壞地提著大黑貓的后頸窩一把把它扔出了窗外。大黑貓被扔出去后又撕心裂肺地叫著從窗口爬了進(jìn)來，李小樹仍沒解氣，他從雜屋間找來一個廢舊的紙箱，三下兩下就把大黑貓裝進(jìn)了紙箱里，然后把它送給了我。

懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like的二級結(jié)構(gòu)(圖5)預(yù)測如下：GOR預(yù)測顯示其二級結(jié)構(gòu)由α螺旋(Hh，28.36%)、β-片層(Ee，20.73%)、無規(guī)則卷曲(Cc，50.91%)構(gòu)成。從分布位點上來看，C端和N端含無規(guī)則卷曲、β-片層和α-螺旋，且無規(guī)則卷曲、β-片層和α-螺旋散布于整個蛋白質(zhì)中。SWISS-MODEL預(yù)測結(jié)果顯示，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like的三級結(jié)構(gòu)為單體跨膜蛋白(圖6)。

2.3 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like亞細(xì)胞定位預(yù)測

采用 WoLFPsort在線軟件對懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因的表達(dá)部位進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果(圖7)表明，定位于液泡膜中的數(shù)量為9，質(zhì)膜中的數(shù)量為2，胞外的數(shù)量為1，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的數(shù)量為1，高爾基體中的數(shù)量為1。表明懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因主要存在液泡膜中。

2.4 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like系統(tǒng)進(jìn)化分析及其同源蛋白的序列比對

從構(gòu)建的進(jìn)化樹(圖8)中可見，懷玉山三葉青與葡萄(Vitisriparia)在一個大分支中，這說明懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like在進(jìn)化上與葡萄tobamovirus multiplication protein 2A(GenBank： XP_034708140.1、XP_002279170.2)的同源性最高，同源性達(dá)到86.79%。

懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like同源蛋白的序列比對信息見圖9，*號區(qū)域是煙草病毒增殖蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域。

以提供的目的基因序列設(shè)計引物(去掉終止密碼子TAG/TAA/TGA)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳。結(jié)果顯示：在目標(biāo)位置擴(kuò)增到單一條帶，大小正確。將條帶切膠回收，即為目的基因片段(圖10)。用BamHⅠ/KpnⅡ酶切載體pCambia2301-KY-GFP線性化，回收后和目的基因片段重組反應(yīng)。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α細(xì)胞。挑取PCR陽性的轉(zhuǎn)化子搖菌培養(yǎng)提取質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切檢測，同時對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序。測序比對結(jié)果顯示：目的基因已插入載體，表達(dá)載體構(gòu)建準(zhǔn)確(圖11)。

2.6 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like亞細(xì)胞定位分析

通過煙草葉片瞬時表達(dá)，將煙草病毒增殖蛋白2A-like融合綠色熒光蛋白(GFP)的載體質(zhì)粒2301-TP2A-GFP轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，吸取農(nóng)桿菌液，壓迫注入煙草葉片下表皮(背面)進(jìn)行煙草病毒增殖蛋白2A-like亞細(xì)胞定位分析(圖12)。利用激光共聚焦顯微鏡觀察，融合GFP的煙草病毒增殖蛋白2A-like轉(zhuǎn)化煙草葉片只在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核觀察到綠色熒光，表明煙草病毒增殖蛋白2A-like定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，與 WoLFPsort在線軟件預(yù)測結(jié)果一致。

2.7 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like轉(zhuǎn)基因煙草鑒定和光合特征

經(jīng)PCR檢測，獲得懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like轉(zhuǎn)基因陽性煙草和轉(zhuǎn)基因陰性煙草(圖13)。光合生理的測定結(jié)果表明：與懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like轉(zhuǎn)基因陰性煙草相比較，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like轉(zhuǎn)基因陽性煙草的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、實際光化學(xué)量子效率(ΦPSⅡ)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)及電子傳遞效率(ETR)顯著下降，而非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)顯著上升(表2)。

表2 懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like轉(zhuǎn)基因陽性植株和轉(zhuǎn)基因陰性植株的光合參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)比較

2.8 懷玉山三葉青2個栽培種不同器官中煙草病毒增殖蛋白2A-like基因的表達(dá)分析

以懷玉山三葉青的GAPDH為內(nèi)參基因，利用實時熒光定量PCR分析懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因在懷玉山三葉青2個栽培種不同器官中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因在懷玉2號和懷玉1號2個栽培種的根、莖、葉中均有表達(dá)，其中在根和莖中的表達(dá)差異不顯著，而在葉中的表達(dá)量顯著增高(圖14)。

3 討論與結(jié)論

Hagiwara等的研究表明，TOM2A主要定位于液泡膜上，花葉病毒復(fù)制蛋白和合成煙草病毒相關(guān)RNA的活性與液泡膜部分相關(guān)[12]。在本試驗中，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因cDNA總長度為828 bp，G+C含量為46.50%；懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like由275個氨基酸組成，分子量為30 728.97 u，等電點為5.39，為疏水性蛋白；二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋(28.36%)、β-片層(20.73%)、無規(guī)則卷曲(50.91%) 構(gòu)成；三級結(jié)構(gòu)為單體跨膜蛋白；軟件預(yù)測懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like亞細(xì)胞定位于液泡膜，但通過煙草葉片亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，煙草病毒增殖蛋白2A-like定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。說明煙草病毒增殖蛋白2A-like與TOM2A的亞細(xì)胞定位不同。從堿基組成和G+C含量基本平衡來看，G+C的含量越高，基因穩(wěn)定性越高，三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，這可能為三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因穩(wěn)定遺傳與進(jìn)化提供了保證。懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白 2A-like 與葡萄煙草病毒增殖蛋白2A(GenBank：XP_034708140.1、XP_002279170.2)的同源性最高，同源性達(dá)到86.79%，說明三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因具有保守性。這些保守區(qū)段的發(fā)現(xiàn)將為其他物種新的三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因的克隆提供序列依據(jù)。還有研究表明，擬南芥TOM1和TOM2A是煙草病毒細(xì)胞內(nèi)高效增殖所必需的完整膜蛋白[12]。

懷玉山三葉青繁殖主要靠無性繁殖，由于這一繁殖特點，受到病毒侵染后，會世代傳染[1]。懷玉山三葉青一旦感染煙草花葉病毒后，會導(dǎo)致種性退化，產(chǎn)量下降，品質(zhì)變劣[1]。有研究表明，枸杞感染病毒后葉綠素含量顯著下降，光合強(qiáng)度顯著降低[15]；甘薯感染甘薯羽狀斑駁病毒和甘薯潛隱病毒后，蔓長短，分枝少，葉片數(shù)不多，SPAD 值低，光合效應(yīng)下降[16]。在本試驗中，與懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like轉(zhuǎn)基因陰性煙草相比較，懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like轉(zhuǎn)基因陽性煙草的光合參數(shù)(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、實際光化學(xué)量子效率(ΦPSⅡ)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)及電子傳遞效率(ETR)顯著下降，而非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)顯著上升，表明懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因通過煙草花葉病毒增殖繼而影響煙草的光合作用。這與上述他人的研究結(jié)果一致。

研究表明，基因的組織表達(dá)特征與其功能緊密相關(guān)[16-17]。在本試驗中，實時定量PCR結(jié)果顯示，懷玉山三葉青懷玉2號和懷玉1號煙草病毒增殖蛋白2A-like基因均在葉中表達(dá)量最高，表明懷玉山三葉青煙草病毒增殖蛋白2A-like基因在葉片的煙草病毒增殖過程中起著重要的調(diào)控作用。