王昀，郜茜

（青海大學(xué)附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，青海 西寧 810000）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是惡性程度較高，預(yù)后較差的惡性腫瘤之一，目前肝切除術(shù)仍是患者的主要根治方法之一[1-2]。盡管近幾十年來(lái)HCC的治療取得了廣泛的進(jìn)展，但由于其早期診斷率低，且患者往往合并肝功能不全，只有不足30%的患者有手術(shù)切除的機(jī)會(huì)[3-4]。因此，探索有效的預(yù)后評(píng)估和治療靶點(diǎn)是十分必要的。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）已被證明在基因表達(dá)中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[5-7]。已有證據(jù)[8-10]表明，多種lncRNA在HCC中失調(diào)，并作為癌基因或抑癌基因參與HCC細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、遷移和侵襲。GAS8反義RNA 1（lncRNA GAS8-AS1）位于GAS8的第二個(gè)內(nèi)含子中，并且是以與GAS8相反的方向轉(zhuǎn)錄994 nt的lncRNA[11]。據(jù)報(bào)道[12-13]，它是一種新的腫瘤抑制因子，可以影響甲狀腺乳頭狀癌和結(jié)直腸癌中的腫瘤細(xì)胞增殖。但目前為止，它在HCC中的作用受到的關(guān)注較少。

微小RNA（microRNA，miRNA）是小分子非編碼RNA，參與靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[14-15]。越來(lái)越多的證據(jù)[16-18]表明，異常表達(dá)的miRNA參與調(diào)節(jié)HCC的發(fā)生發(fā)展。已有研究[19]發(fā)現(xiàn)，miR-135b的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)HCC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。但目前為止，其與HCC患者臨床相關(guān)的報(bào)道較少。本課題組在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中通過(guò)生物學(xué)軟件Targetscan（http ://www.targetscan.org）預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，lncRNA GAS8-AS1和miR-135b之間存在結(jié)合位點(diǎn)。因此，本研究旨在探討lncRNA GAS8-AS1和miR-135b在HCC組織中的表達(dá)及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 病歷資料

收集2017年2月—2019年2月在青海大學(xué)附屬醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)切除的110例HCC患者的癌組織及癌旁組織樣本（＞3 cm處）。根據(jù)Edmondson病理分級(jí)：I～Ⅱ級(jí)52例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)58例；根據(jù)TNM分期：I～Ⅱ期48例，Ⅲ～Ⅳ期62例。所有組織在采集后立刻進(jìn)行速凍，之后置于-80 ℃的冰箱中保存。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療、介入、射頻消融術(shù)及免疫治療；⑵ HE染色常規(guī)病理檢查均為原發(fā)性HCC，且未合并其他惡性腫瘤；⑶ 經(jīng)2名病理醫(yī)師確認(rèn)為HCC；⑷ 有完整的臨床資料，術(shù)后有隨訪數(shù)據(jù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 肝轉(zhuǎn)移癌；⑵ 合并心、腎等其他重要器官功能不全；⑶ 合并有自身免疫性疾病；⑷ 臨床資料及術(shù)后隨訪數(shù)據(jù)缺失。

1.3 試劑與儀器

RNA提取和分離試劑盒（Ambion，美國(guó)）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，中國(guó)）；NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（Thermo，美國(guó)）；熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)（BioRad，美國(guó)）。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）實(shí)驗(yàn)

嚴(yán)格按操作說(shuō)明書，用Trizol?試劑提取HCC組織及癌旁組織的總RNA，并通過(guò)NanoDrop 2000測(cè)定RNA的質(zhì)量和濃度。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，中國(guó)）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為：cDNA產(chǎn) 物2 μL，2×SYBR?Premix Ex Taq TM Ⅱ 8 μL，上下游引物各1 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，RNase-Free H2O 7.6 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 1 min、95 ℃ 10 s、58 ℃ 45 s、72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。lncRNA GAS8-AS1和miR-135b的表達(dá)水平以2-ΔΔCT表示。實(shí)驗(yàn)所用引物序列如表1所示。

表1 研究所用引物序列Table 1 Sequence of primers used in the study

1.5 隨訪

術(shù)后經(jīng)門診、電話及住院等方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止時(shí)間為2022年2月，隨訪終點(diǎn)為隨訪時(shí)間終止或患者死亡。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究經(jīng)SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。生存分析用Kaplan-Meier法，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料

本研究中年齡＞55歲的患者有61例（55.45%），≤55歲的患者有49例（44.55%）；男性患者63例（57.27%），女性患者47例（42.73%）；腫瘤直徑＞5 cm的患者60例（54.56%），≤5 cm的患者50例（45.44%）；有乙肝病史的患者65例（59.09%），無(wú)乙肝病史的患者45例（40.91%）；術(shù)前甲胎蛋白＞20 ng/mL的患者57例（51.82%），≤20 ng/mL的患者53例（48.18%）（表2）。

表2 患者的一般資料[n（%）]Table 2 The general data of patients [n (%)]

2.2 lncRNA GAS8-AS1和miR-135b在HCC組織及癌旁組織中的表達(dá)情況

與癌旁組織比較，HCC組織中l(wèi)ncRNA GAS8-AS1的表達(dá)水平明顯降低（0.47±0.03vs. 1.03±0.8，P＜0.05）；而miR-135b在HCC組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織（3.17±0.29vs. 1.12±0.16，P＜0.05）（圖1）。

圖1 HCC組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNA GAS8-AS1和miR-135b的相對(duì)表達(dá)量比較Figure 1 Comparison of the relative expression levels of lncRNA GAS8-AS1 and miR-135b in HCC and adjacent tissues

2.3 lncRNA GAS8-AS1和miR-135b表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

本研究根據(jù)lncRNA GAS8-AS1、miR-135b表達(dá)水平的均值，將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lncRNA GAS8-AS1高表達(dá)組中高Edmondson分期、高TNM分期、高分化的患者比例明顯低于lncRNA GAS8-AS1低表達(dá)組（均P＜0.05）；而miR-135b高表達(dá)組中高Edmondson分期、高TNM分期、高分化的患者比例明顯高于miR-135b低表達(dá)組（均P＜0.05）（表3）。

表3 lncRNA GAS8-AS1和miR-135b表達(dá)水平與HCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n（%）]Table 3 Relations of the expression levels of lncRNA GAS8-AS1 and miR-135b with the clinicopathologic variables of HCC patients [n (%)]

2.4 lncRNA GAS8-AS1和miR-135b表達(dá)水平與患者生存的關(guān)系

lncRNA GAS8-AS1高表達(dá)組3年總生存率為70.00%（35例）；lncRNA GAS8-AS1低表達(dá)組3年總生存率為30.00%（15例）；miR-135b高表達(dá)組3年總生存率為32.26%（20例）；miR-135b高表達(dá)組3年總生存率為67.74%（42例）（圖2）。

圖2 lncRNA GAS8-AS1和miR-135b表達(dá)水平與HCC患者的生存的關(guān)系Figure 2 Relations of the expression levels of lncRNA GAS8-AS1 and miR-135b with the survival of HCC patients

2.5 影響HCC患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

多因素Cox回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高Edmondson分級(jí)、高TNM分期、有乙肝病史、lncRNA GAS8-AS1低表達(dá)及miR-135b高表達(dá)均為影響患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P＜0.05）（表4）。

表4 影響HCC患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析Table 4 Multivariate Cox regression analysis of factors for prognosis of HCC patients

3 討 論

肝癌是世界上第六大常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是男性癌癥患者死亡的第二大常見(jiàn)原因。HCC是其最主要的組織學(xué)亞型，占原發(fā)性肝癌的70%～85%。但目前為止，HCC患者的5年生存率很低，每年仍有超過(guò)75萬(wàn)例患者死亡[20-21]。雖然之前的研究發(fā)現(xiàn)HCC中存在許多異常表達(dá)的蛋白質(zhì)編碼基因，但仍需要尋找能幫助早期診斷及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的新型分子標(biāo)志物。

多項(xiàng)研究[22]已經(jīng)證明，lncRNA與腫瘤的關(guān)系目前已成為癌癥研究的熱點(diǎn)之一。HCC中l(wèi)ncRNA TLR8-AS1可通過(guò)miR-34a抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。lncRNA UCA1在HCC組織中異常上調(diào)，并與TNM分期、轉(zhuǎn)移和術(shù)后生存率相關(guān)[23]。lncRNA PTENP1過(guò)表達(dá)載體可有效減緩肝癌小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，抑制腫瘤內(nèi)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡、自噬和抑制血管生成[24]。這些結(jié)果表明，lncRNA可能在HCC的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，具有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

GAS8-AS1是一種新鑒定的lncRNA，對(duì)于甲狀腺乳頭狀癌和HCC的發(fā)生可能起關(guān)鍵作用。在甲狀腺乳頭狀癌中，lncRNA GAS8-AS1發(fā)生的突變被證明與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[25]。在HCC發(fā)生過(guò)程中，lncRNA GAS8-AS1通過(guò)MLL1/WDR5調(diào)節(jié)GAS8表達(dá)，從而抑制疾病進(jìn)展[26]。但目前為止，lncRNA GAS8-AS1與HCC相關(guān)的臨床研究并未見(jiàn)報(bào)道。本研究在HCC組織中觀察到lncRNA GAS8-AS1低表達(dá)，提示lncRNA GAS8-AS1的表達(dá)水平可能與HCC的發(fā)生密切相關(guān)，這與之前的研究結(jié)果相似。在此基礎(chǔ)上，本研究將lncRNA GAS8-AS1的表達(dá)水平與HCC患者的臨床病理特征相關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)lncRNA GAS8-AS1水平低的HCC患者3年總生存率往往比lncRNA GAS8-AS1水平高的患者低，且lncRNA GAS8-AS1低表達(dá)是HCC患不良預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。上述結(jié)果說(shuō)明，lncRNA GAS8-AS1是HCC患者的一種新的預(yù)后生物標(biāo)志物。

lncRNA已被證明可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[27-29]。Qin等[30]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA GAS8-AS1可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-187-3p和miR-1343-3p，并分別上調(diào)ATG5和ATG7的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的自噬。本課題組在前期通過(guò)生物信息學(xué)軟件Targetscan預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)lncRNA GAS8-AS1和miR-135b之間存在調(diào)控靶點(diǎn)。張彥兵等[19]發(fā)現(xiàn)，miR-135b可通過(guò)靶向Hippo信號(hào)通路相關(guān)基因促進(jìn)HCC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-135b水平高的患者3年總生存率比miR-135b水平低的患者低，且miR-135b高表達(dá)是不良預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)，這也從臨床層面驗(yàn)證了張彥兵等[19]研究結(jié)果。上述結(jié)果同樣說(shuō)明，miR-135b可能是HCC的潛在預(yù)后預(yù)測(cè)因子。

綜上，lncRNA GAS8-AS1在HCC組織中表達(dá)下調(diào)，而miR-135b在HCC組織中表達(dá)上調(diào)，兩者間存在調(diào)控位點(diǎn)且均可作為HCC患者潛在的預(yù)后生物標(biāo)志物。但目前為止，lncRNA GAS8-AS1和miR-135b在HCC中的作用機(jī)制尚不十分明確，今后需通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。