王思之，關文靈，郝曉函，宋 杰

（1云南農業(yè)大學花卉研究所，昆明 650201；2云南省農業(yè)科學研究院花卉研究所，昆明 650205）

0 引言

白珠樹屬(Gaultheria)隸屬于杜鵑花科(Ericaceae)越橘亞科(Vaccinioideae)[1]，在中國被廣泛應用于醫(yī)藥、食品、工業(yè)及園藝相關產業(yè)[2]。平鋪白珠(G.procumbens)又稱匍匐白珠，是一種多年生常綠匍匐灌木，原產于美國和加拿大[3]，植株耐低溫，成株矮小可愛，很適合做盆栽?；ㄆ诖耗┲脸跸模锛窘Y果，果實有白、粉、紅等顏色，漿果小而鮮艷，掛果期長，能保持整個冬季[4]，還曾獲得皇家園藝學會獎，成為了近年來國際流行的盆栽觀果植物。平鋪白珠的果實富含水楊酸和花青素[5]，在北美的藥用價值堪比滇白珠在中國的地位，具有止痛、消炎、治療風濕等功效[6]；是美國著名鎮(zhèn)痛藥“ICY HOT”的主要成分[2]。同時平鋪白珠的葉子還是提取冬青油的主要原料，被廣泛用于生產牙膏、口香糖、殺蟲劑等產品[6]，工業(yè)價值顯著。目前國內主要將其作為室內盆栽，但繁殖困難導致種苗和盆花產品價格居高。該屬植物的常規(guī)繁殖方式為種子繁殖[2]，但生產實踐中發(fā)現(xiàn)常規(guī)播種后種子萌發(fā)率很低，而且發(fā)芽后種苗長勢弱，不易成活。

如何提高平鋪白珠的繁殖效率是目前亟待解決的問題，但關于其播種育苗的文獻極少。由于白珠樹屬與越橘屬為近緣關系[7]，參考越橘屬藍莓的相關種子萌發(fā)試驗發(fā)現(xiàn)GA3能促進種子的萌發(fā)[8-10]。國內雖已有平鋪白珠的組培繁殖專利[11]，但卻并未研究過種子的萌發(fā)特性。筆者將從前人的研究經驗入手，研究平鋪白珠一個重要園藝品種‘極速貴族’(G.procumbens‘Speedy Baron’)種子的萌發(fā)特性，并對目前的播種繁殖方式進行優(yōu)化，旨在為平鋪白珠引種馴化及生產實踐提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料平鋪白珠‘極速貴族’為一個園藝品種，果實于8月采自云南農業(yè)大學園林園藝學院苗圃。果實采集后，取出其中種子凈種、干燥后裝入自封袋內4℃冷藏保存、待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子形態(tài)指標測定

（1）種子形態(tài)。隨機選擇種子100粒，在體視顯微鏡（萊卡M125）下觀測種子的形態(tài)、顏色。種子長度的測定用顯微鏡自帶軟件（LAS V4.8，精度0.001 mm），重復5次，取平均值。

（2）種子千粒重。采用百粒法稱重，隨機取種子100粒，電子天平（精度0.0001 g）稱量，重復8次，取平均值乘以10算得千粒重。

1.2.2 種子活力及種子吸水量測定

（1）種子活力值。采用TTC法（氯化三苯基四氮唑法）測定種胚的活力。將蒸餾水浸泡12 h的種子縱切，選100粒浸泡于35℃的0.1%的TTC溶液中12 h，取出觀察記錄，種胚被染為鮮紅色視為有活力種子，試驗重復3次，取平均值。種子活力值計算如式(1)。

（2）種子吸水率。取飽滿種子100粒置于裝有蒸餾水的燒杯中，于25℃的培養(yǎng)箱中吸脹，前2 h每隔0.5 h測定1次，然后每隔1 h測定1次，測量時用吸水紙吸干種皮表面浮水后稱重，之后再放回燒杯繼續(xù)吸水，直至種子質量基本恒定。重復3次，取平均值，繪制種子吸水曲線。吸水率計算如式(2)。

1.2.3 種子萌發(fā)試驗

（1）GA3濃度與GA3浸種時間對種子發(fā)芽的影響。設置GA3濃度分別為0、250、500、1000 mg/L，浸泡時間分別為12、24、48 h，共12組處理。光照條件為12 h有光+12 h無光，培養(yǎng)溫度為25℃。每處理30粒種子，重復3次。

（2）變溫處理對種子發(fā)芽的影響。設置浸種溶液蒸餾水和濃度為1000 mg/L的GA3溶液，浸種時間分別為12、24、48 h，共6組處理。培養(yǎng)條件為12 h有光、溫度25℃+12 h無光、溫度15℃。每處理50粒種子，重復3次。

種子萌發(fā)均采用培養(yǎng)皿濾紙法。用質量分數(shù)10%的次氯酸鈉溶液浸泡15 min，蒸餾水沖洗后用相應溶液浸種，達到相應時間后取出種子用濾紙吸干表面溶液后擺放于含有濕潤雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過程用蒸餾水進行補水，全程保證濾紙的濕潤，培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)條件如上。胚根突破種皮即為種子萌發(fā)，以播種后30天為萌發(fā)結束。萌發(fā)結束后，計算發(fā)芽率，如式(3)。

1.2.4 種子無菌萌發(fā)

（1）種子預處理方案。稱取0.03 g種子（約100粒）為1組，設置GA3濃度分別為0、500、1000、1500 mg/L，浸泡時間為24 h，共4組處理，每組處理重復3次。浸泡結束后流水沖洗15 min，隨即放進超凈工作臺備用。

（2）種子組培方案。在超凈工作臺中使用75%酒精浸泡30 s，之后使用質量分數(shù)15%的次氯酸鈉溶液滅菌20 min，最后用無菌水沖洗5次。接種培養(yǎng)基配方為WPM+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，pH 5.8。置于環(huán)境溫度24～26℃、每日光照16 h、光照強度2500 lx的培養(yǎng)室內生長3個月后，統(tǒng)計發(fā)芽率、株高、根長并與1.2.3處理中所獲種苗作對比。1.2.3處理中的種苗發(fā)芽后立即轉移到栽培基質中，基質的配比為草炭:椰糠:珍珠巖=2:2:1（體積比），栽培期間僅進行常規(guī)補水處理，培養(yǎng)時間同為播種后的3個月。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 26.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，組間比較采用Duncan檢驗。采用Excel 2019進行制圖。

2 結果與分析

2.1 種子形態(tài)指標

平鋪白珠‘極速貴族’種子卵狀近似于腎形，體視顯微鏡下觀察如圖1。種子種皮黃棕色，皮薄且粗糙，無毛。種子長(2.245±0.245)mm、寬(1.412±0.223)mm，千粒重(0.2995±0.0111)g，屬小粒種子。

圖1 平鋪白珠‘極速貴族’種子形態(tài)圖

2.2 種子活力及種子吸水特性

平鋪白珠‘極速貴族’種子活力值為75.27%，種子吸水變化曲線如圖2。種子迅速吸水階段發(fā)生在前1 h，吸水率達到20.45%，4 h之后吸水進入減緩階段，在6 h時種子吸水率達到26.52%，而后吸水率不再變化，達到飽和狀態(tài)?？梢娖戒伆字椤畼O速貴族’種皮透水性良好。

圖2 平鋪白珠‘極速貴族’吸水曲線

2.3 種子萌發(fā)試驗

2.3.1 不同GA3濃度與GA3浸泡時間對種子萌發(fā)的影響 從種子播種后的第15天開始記錄每日萌發(fā)率得到圖3。由圖可以看出，GA3處理的種子在萌發(fā)初期和萌發(fā)結束每日發(fā)芽率均高于清水處理的種子，且所有處理在萌發(fā)開始后均呈現(xiàn)出波紋式上升趨勢，在播種后大約27天時逐漸趨于平穩(wěn)。在使用清水處理的3組數(shù)據(jù)中用清水浸泡12 h萌發(fā)效果最佳，萌發(fā)率最終達48.89%。GA3濃度1000 mg/L、浸泡時間48 h處理下種子的每日萌發(fā)率均高于其他處理，最終萌發(fā)率高達78.89%；雖然GA3濃度500 mg/L、浸泡時間24 h處理下的每日萌發(fā)率在萌發(fā)29天前均低于前者，但最終的萌發(fā)率兩者持平。

圖3 恒溫環(huán)境下平鋪白珠‘極速貴族’種子日萌發(fā)率變化

GA3濃度的高低涉及對種子萌發(fā)的作用大小，而GA3溶液浸泡時間的長短決定溶液是否浸入種子內部。GA3濃度和浸泡時間對種子萌發(fā)影響的單因素方差分析表明（表1），不同浸泡時間對種子的發(fā)芽率無顯著影響，但GA3濃度對種子發(fā)芽率有極顯著影響，并且GA3濃度和浸泡時間之間有交互性。

表1 恒溫環(huán)境下不同GA3濃度、浸泡時間對平鋪白珠‘極速貴族’種子萌發(fā)率影響的方差分析

將不同GA3濃度及不同浸泡時間對萌發(fā)率的影響制成表2。可以發(fā)現(xiàn)，當溶液浸泡時間為12 h時，組間萌發(fā)率沒有差異性，但用1000 mg/L GA3浸泡萌發(fā)率最高，達65.56%。當溶液浸泡時間為24 h時，500、1000 mg/L GA3萌發(fā)率都顯著高于對照，但用500 mg/L GA3萌發(fā)率最高，達71.11%。當溶液浸泡時間為48 h時，GA3浸泡的種子萌發(fā)率均顯著高于對照，其中500、1000 mg/L GA3萌發(fā)率一致，均高達78.89%。比較所有處理可以發(fā)現(xiàn)，清水處理24 h和48 h效果均顯著差于GA3處理，其中500、1000 mg/L GA3+48 h浸泡的處理組合最適宜種子的萌發(fā)。

2.3.2 變溫環(huán)境下對種子萌發(fā)的影響 從種子播種后的第15天開始記錄每日萌發(fā)率得到圖4。由圖可以看出，GA3處理的種子前期萌發(fā)率增速很快，在播種22天后增速才逐漸趨于平穩(wěn)，在播種后25天萌發(fā)率不再改變；而清水處理的種子萌發(fā)率整體都不如GA3處理的種子，但萌發(fā)率隨時間穩(wěn)定上升，直到統(tǒng)計結束（播種后30天）才達到最大值?？梢奊A3浸泡能有效促進種子的萌發(fā)，并且萌發(fā)時間更短。

圖4 變溫環(huán)境下平鋪白珠‘極速貴族’種子日萌發(fā)率變化

為探究變溫環(huán)境下GA3濃度與浸泡時間對種子萌發(fā)的影響，通過做單因素分析得到表3。在變溫環(huán)境中不同浸泡時間對發(fā)芽率的影響不顯著，但GA3濃度對萌發(fā)率有極顯著影響，兩者并無交互作用。

表3 變溫環(huán)境下不同GA3濃度、浸泡時間對平鋪白珠‘極速貴族’種子萌發(fā)率影響的方差分析

在變溫環(huán)境下，對比不同處理組合（表4），相同的浸泡溶液在不同的浸泡時間下萌發(fā)率無顯著差異。清水浸泡的發(fā)芽率均低于GA3溶液浸泡的發(fā)芽率，并且差異顯著，表明GA3能顯著促進種子的萌發(fā)。當GA3濃度1000 mg/L、浸泡12 h時種子萌發(fā)率最高(92%)，浸泡24 h時發(fā)芽率也高達90%。

表4 變溫環(huán)境下不同GA3濃度、浸泡時間對平鋪白珠‘極速貴族’種子萌發(fā)率的影響

2.3.3 溫度和GA3處理對種子萌發(fā)的影響 為進一步探究萌發(fā)溫度以及GA3濃度與浸泡時間對種子萌發(fā)的影響，取不同溫度環(huán)境下GA3濃度0、1000 mg/L中各個浸泡時間的試驗組做單因素方差分析得到表5。由表可以看出，溫度與GA3濃度是影響種子萌發(fā)的關鍵因素，而前期的溶液浸泡時間則對萌發(fā)無顯著影響。溫度、GA3濃度與GA3浸泡時間三者之間存在交互關系，但兩兩間交互作用并不顯著。

表5 不同環(huán)境溫度對平鋪白珠‘極速貴族’種子萌發(fā)影響的方差分析

對比恒溫和變溫環(huán)境下清水和1000 mg/L GA3溶液預處理不同時間對發(fā)芽率的影響（表6）發(fā)現(xiàn)，在清水處理中，變溫環(huán)境下的種子萌發(fā)率均顯著高于恒溫處理下的種子，恒溫環(huán)境下清水處理的種子萌發(fā)率最高僅48.89%，而變溫環(huán)境下清水處理的種子萌發(fā)率最高可達64.67%。同樣的，在1000 mg/L的GA3溶液處理中，變溫環(huán)境下的種子萌發(fā)率也均高于恒溫處理下的種子，且當浸泡時間為12 h時萌發(fā)率最高，可達92%。綜上，可以得出最適于平鋪白珠‘極速貴族’種子萌發(fā)的條件為：將種子浸泡在濃度1000 mg/L的GA3溶液中12 h，之后播種于環(huán)境控制為12 h有光、溫度25℃+12 h無光、溫度15℃的環(huán)境中萌發(fā)效果最佳。

表6 不同環(huán)境溫度對平鋪白珠‘極速貴族’種子萌發(fā)的影響

2.4 無菌萌發(fā)對種子生長的影響

通過記錄下種子播種3個月后的生長狀況，對常規(guī)生產方式與無菌組培對平鋪白珠‘極速貴族’種子的影響進行對比，得到表7。其中發(fā)芽率僅對比不同無菌處理組合間的差異，相應的株高及根長由于不同預處理對常規(guī)播種并無顯著性差異故將其整合為一組與組培苗進行對比。

表7 常規(guī)播種與無菌萌發(fā)的長勢對比

通過比對發(fā)現(xiàn)，不同預處理方案對無菌播種種子的發(fā)芽率并沒有影響(P＞0.05)。同樣的培養(yǎng)時間下常規(guī)播種與無菌播種所獲植株的株高也沒有顯著性差異(P＞0.05)。但不同預處理方案對種苗根長的影響十分顯著(P＜0.05)，對比常規(guī)播種所獲植株而言，GA3濃度為1500 mg/L時顯著促進了根的生長，而清水與500 mg/L的GA3則顯著抑制了根的生長。通過圖5可以發(fā)現(xiàn)，常規(guī)苗和無菌苗之間葉色、莖桿粗壯程度，生長長勢均有較大差異。無菌播種中清水預處理的種苗葉色多為紅色，500 mg/L GA3處理的種苗葉色多為黃綠色，其余葉色均為嫩綠色。無菌苗的莖桿也比常規(guī)苗的莖桿更為粗壯，硬度也更高。1000、1500 mg/L GA3處理下的植株生長長勢也比常規(guī)苗要好，常規(guī)苗多為2片葉，而無菌苗植株葉片均多于2片。常規(guī)苗的根系雖然多，但是十分纖細，而無菌苗根系則更加粗壯?？偟膩碚f，在相同的培養(yǎng)時間下，1000、1500 mg/L GA3預處理獲得的無菌苗長勢比常規(guī)苗要更好。

圖5 不同播種方式生長3個月后種苗的形態(tài)

3 結論

（1）平鋪白珠‘極速貴族’種子屬小粒種子，種子種皮薄且透水性良好。

（2）GA3能顯著促進種子的萌發(fā)，提升萌發(fā)率并縮短萌發(fā)時間；GA3濃度和浸泡時間之間存在交互作用，最佳處理方案為1000 mg/L的GA3溶液浸泡12～24 h。

（3）變溫環(huán)境能顯著促進種子的萌發(fā)，并且與GA3濃度和浸泡時間三者存在交互作用，在三者的共同作用下能獲得更高萌發(fā)率且萌發(fā)時間更短，最佳的處理組合為：濃度1000 mg/L的GA3溶液浸泡12～24 h，培養(yǎng)條件為25℃（12 h，光照）/15℃（12 h，黑暗）的變溫環(huán)境，最佳處理下種子萌發(fā)時間僅需24～28天，此時種子萌發(fā)率高達92%，均高于變溫對照的64.67%及恒溫對照的78.89%。

（4）無菌萌發(fā)能促進種苗的生長，能獲得更佳的長勢。用1500 mg/L GA3預處理種子進行無菌萌發(fā)，3個月后種苗的平均株高12.17 mm、平均根長18.15 mm，均高于常規(guī)播種苗的平均株高9.65 mm、平均根長13.31 mm。無菌萌發(fā)培養(yǎng)基配方為WPM+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖，pH 5.8。

4 討論

4.1 溫度和GA3處理對平鋪白珠‘極速貴族’種子萌發(fā)的影響

為解決平鋪白珠‘極速貴族’種子常規(guī)播種萌發(fā)率低的問題，本研究從種子的基本特性入手深入探索提高萌發(fā)率的方法。白珠樹屬類似的相關文獻甚少，筆者通過參閱大量杜鵑花屬(Rhododendron)及越橘屬(Vaccinium)植物種子萌發(fā)的論文發(fā)現(xiàn)，GA3可以作為促進種子萌發(fā)的誘導劑[8-10,12]。由于GA3的效果由處理時間和濃度決定，杜鵑花屬及越橘屬植物常用的GA3濃 度 為 400～2000 mg/L，處 理 時 間 4～48 h 不等[8-10,12-13]，試驗多為單變量試驗，并未考慮GA3濃度與GA3浸泡時間的交互關系。本研究最終發(fā)現(xiàn)GA3濃度與GA3浸泡時間在平鋪白珠‘極速貴族’種子萌發(fā)過程中存在交互作用，GA3濃度是兩者中影響種子萌發(fā)的關鍵因素。

溫度也是影響種子萌發(fā)的重要因素，恒溫或變溫對不同種類的種子影響不同，杜鵑花屬植物的種子尤其明顯。譬如，在恒溫條件下，馬銀花(R.ovatum)的種子發(fā)芽率最高[14]；迷人杜鵑(R.agastum)[15]、桃葉杜鵑(R.annae)[16]、露珠杜鵑(R.irroratum)[17]的發(fā)芽率和發(fā)芽勢可以被顯著提高。在變溫條件下，映山紅(R.simsii)[17]、大 白 杜 鵑 (R.decorunm)[14]、滇 南 杜 鵑 (R.hancockii)[13]的種子萌發(fā)率和發(fā)芽勢顯著高于恒溫。由前人研究可以推斷在白珠樹屬植物的種子萌發(fā)中溫度或許也是影響萌發(fā)的重要因素，而且前人的試驗中均未討論過溫度與前期預處理之間的交互關系，本研究最終發(fā)現(xiàn)溫度與前期預處理之間是有交互作用的，GA3濃度和溫度是影響平鋪白珠‘極速貴族’種子萌發(fā)的關鍵因素。但是本研究并未能確定不同溫度對種子萌發(fā)的影響，后續(xù)研究可以對種子最適萌發(fā)溫度進行探索。同時由于光照是種子萌發(fā)重要的影響因素之一[18]，在映山紅的種子萌發(fā)過程中每日12 h的光照可以顯著提高萌發(fā)效果[19]；但在黑暗條件下露珠杜鵑種子萌發(fā)基本不受影響[20]；可以發(fā)現(xiàn)不同種類植物種子的萌發(fā)對光照的敏感度不同。光照對于平鋪白珠種子萌發(fā)的影響并不清楚，后續(xù)可以通過相應研究對其進行探討。

4.2 無菌萌發(fā)對平鋪白珠‘極速貴族’種子萌發(fā)及長勢的影響

為解決生產實踐中平鋪白珠‘極速貴族’種子播種后長勢弱的問題，本研究通過無菌萌發(fā)，利用組培的手段解決這一問題。結果表明無菌萌發(fā)的確能促進生長，可也帶來了一些問題。在無菌萌發(fā)早期幼苗的葉色及莖桿的顏色均為紅色，后期才逐漸轉綠。造成這一結果的原因不得而知，對此本研究提出兩點猜想：一種原因可能是培養(yǎng)基碳源影響了葉色。有大量研究表明碳源可以影響花青素的合成[21]，進而導致葉色的變換。另一種可能是生長調節(jié)劑導致的幼苗葉色差異，陳兵[22]發(fā)現(xiàn)GA3、NAA這兩種激素對紅花木蓮(Manglietia insignis)幼苗葉綠素含量有影響；張慧寧[23]發(fā)現(xiàn)6-BA可以提高紫葉稠李(Padus virginiana)體內的色素含量，NAA則能促進葉片色素的積累。具體原因有待后續(xù)研究。

本研究無菌萌發(fā)GA3預處理種子后萌發(fā)率對比清水預處理并沒有顯著提升，與常規(guī)萌發(fā)試驗結論不一致，本研究推測由于常規(guī)萌發(fā)試驗中萌發(fā)統(tǒng)計結束時間為播種后的30天，這30天GA3預處理的種子萌發(fā)階段已經結束，而清水預處理的種子萌發(fā)階段還未結束。在無菌萌發(fā)過程中，由于萌發(fā)率數(shù)據(jù)的統(tǒng)計在播種的3個月后，清水預處理過的種子萌發(fā)時間充足，進而導致萌發(fā)率之間無顯著差異，這也從側面說明了GA3有縮短種子萌發(fā)時間的作用。在太白杜鵑(R.purdomii)[24]、藍莓雜交種子[25]的萌發(fā)中GA3發(fā)揮了顯著作用，有效縮短了種子萌發(fā)所需要的時間。將GA3作為生長調節(jié)劑加入到無菌萌發(fā)的培養(yǎng)基中能有效促進植株的生長，例如在大白杜鵑種子的無菌萌發(fā)培養(yǎng)基中加入1.0～2.0 mg/L的GA3顯著縮短萌發(fā)時間，并且生長活力更佳[26]。后續(xù)可針對平鋪白珠組培壯苗和繁殖進行深入研究，此方法或將為其提供幫助。