王 雨，孫延平，喬威杰，楊炳友，匡海學(xué)

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040）

多糖廣泛存在于生物體中，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、抗病毒、降血糖及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[1]。多個(gè)研究結(jié)果表明，多糖分子量與其生物活性密切相關(guān)[2]。迄今針對(duì)不同分子量段多糖的常用分離純化方法主要有分級(jí)醇沉法、超濾分離法和凝膠柱層析法。其中凝膠柱層析法是通用的分離純化多糖方法之一，具有分子篩的性質(zhì)，多應(yīng)用于多糖的精細(xì)分離[3]。常用的固定相凝膠填料主要有Sephadex葡聚糖凝膠、Sepharose瓊脂糖凝膠和Sephacryl系列聚丙烯酰胺凝膠[4]。與前兩種凝膠稍有不同，Sephacryl系列凝膠可選的型號(hào)類型較多，可根據(jù)不同多糖樣品的分子量大小分布特點(diǎn)，達(dá)到最佳分離效果，同時(shí)還具有分離范圍廣，化學(xué)穩(wěn)定性高，機(jī)械性能好等優(yōu)點(diǎn)[5]。然而，目前針對(duì)聚丙烯酰胺凝膠（Sephacryl）在多糖的分離純化中應(yīng)用方面的系統(tǒng)綜述較少。因此，本文選取Sephacryl凝膠作為研究對(duì)象，對(duì)其性質(zhì)特點(diǎn)、使用方法及系列柱層析在活性多糖分離純化中的應(yīng)用情況進(jìn)行概述，為多糖研究工作者提供參考。

1 Sephacryl凝膠性質(zhì)特點(diǎn)

聚丙烯酰胺凝膠（Sephacryl）是一種烯丙基葡聚糖和N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺的交聯(lián)共聚物，屬于通用型凝膠過濾介質(zhì)，粒徑大小范圍為25～75μm。凝膠填料pH值保持在3～11范圍內(nèi)，適合于長(zhǎng)時(shí)間放置；pH值保持在2～13范圍內(nèi)，適合于短期內(nèi)再生、原地清洗等過程，其化學(xué)穩(wěn)定性高于其他傳統(tǒng)凝膠?？稍?21°C，pH值為7，30min的條件下進(jìn)行高壓滅菌。其親水剛性基質(zhì)可最大限度地減少非特異性吸附，提高回收率，同時(shí)增加了基體的剛性，確?？焖倭鲃?dòng)特性和高分辨率。

2 Sephacryl凝膠使用方法

2.1 填料裝柱前處理及裝柱

將儲(chǔ)存于20%乙醇溶液中的Sephacryl凝膠放入去離子水內(nèi)，重復(fù)洗滌3次，浸泡過夜。裝柱后使凝膠在柱內(nèi)自由沉降，平衡液上柱前，須進(jìn)行脫氣處理。可用蠕動(dòng)泵加壓讓流速維持穩(wěn)定，但需注意壓力不要超過填料最大耐壓。一般平衡層析柱至少5～10個(gè)柱體積后再進(jìn)行上樣。

2.2 樣品前處理及填料儲(chǔ)存

多糖樣品溶液用平衡液進(jìn)行配制，所有樣品溶液及平衡溶液在上柱使用前應(yīng)離心或過濾（0.45μm），上樣量不超過柱體積的5%。新購(gòu)置的Sephacryl凝膠密封儲(chǔ)存在4～25℃的20%乙醇保存溶液中，所處環(huán)境保持通風(fēng)、干燥、清潔，不能冷凍。用過的凝膠填料儲(chǔ)存在4℃的20%乙醇保存溶液中，保質(zhì)期一般不超過2年。

3 Sephacryl凝膠在活性多糖分離純化中的應(yīng)用

根據(jù)不同分離范圍Sephacryl凝膠可分為S-100～500系列，結(jié)合具體在活性多糖分離純化中的應(yīng)用實(shí)例（見表1），除了多糖還適用于肽類、激素類、蛋白、DNA片段等樣品的分離。

3.1 免疫活性多糖的分離

免疫失調(diào)是在一部分誘因，如過度飲酒，過敏源等刺激影響下，引發(fā)許多基因、蛋白質(zhì)以及細(xì)胞的作用，會(huì)導(dǎo)致包括免疫系統(tǒng)受損及變態(tài)反應(yīng)等在內(nèi)的大量相關(guān)疾病的發(fā)生。隨著愈來(lái)愈多的多糖被發(fā)現(xiàn)顯示出免疫調(diào)節(jié)活性，其免疫作用機(jī)理、功效因子也越加清楚和確切[16]。Shi等[8]采用陰離子交換柱層析法和凝膠過濾柱層析法對(duì)石耳樣品進(jìn)行純化，用超純水作為流動(dòng)相通過DEAE-Cellulose色譜柱得到洗脫組分UP1，UP1再經(jīng)Sephacryl S-200柱（1.0cm×80cm）進(jìn)一步分離純化，以0.2mL·min-1為流速繼續(xù)采用超純水洗脫，得到分子量為2.81×105Da的高純度多糖UP1-1。藥理結(jié)果表明，UP1-1能呈劑量依賴性地促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞的吞噬活性和NO的產(chǎn)生，具有良好的免疫刺激活性。Zhang等[10]將紅參粗多糖樣品裝入DEAE-52層析柱，用蒸餾水洗脫，得到RGRP-1洗脫組分，采用Sephacryl S-300 HR色譜柱（80cm×1.5cm）進(jìn)一步純化RGRP-1，得到平均分子量分別為2.13×104Da和1.02×104Da的均一多糖RGRP-1a和RGRP-1b，藥理結(jié)果表明，RGRP-1b具有明顯的生物學(xué)活性，可通過巨噬細(xì)胞活化促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO、TNF-α、IL-6和IL-12，促進(jìn)HuH7細(xì)胞凋亡，具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性。Zhang等[15]采用水提梯度醇沉的方法從正紅菇子實(shí)體中提取分離得到3種主要沉淀。使用Sephacryl S-500 HR色譜柱，在A KTA純化系統(tǒng)上進(jìn)一步純化這些乙醇沉淀物以除去共沉淀物，不同組分樣品以2mg·mL-1的濃度進(jìn)入色譜柱。用PBS緩沖液（pH值7.4，50 mmol·L-1）洗脫，流速為1.3mL·min-1，最終得到Mw分別為2.18×106、3.92×105、9.36×104Da的純化組分，藥理結(jié)果表明，其中純化組分WRP-1具有較強(qiáng)的免疫刺激作用。

表1 常用Sephacryl凝膠類型、分離范圍及在活性多糖分離應(yīng)用中的實(shí)例Tab.1 Type and separation range of commonly used Sephacryl gel and its application in the isolation of active polysaccharides

3.2 抗氧化活性多糖的分離

過多的自由基會(huì)引起衰老、腫瘤以及其它各類疾病的產(chǎn)生，近20年發(fā)現(xiàn)天然來(lái)源的多糖具有顯著抗氧化活性，深受學(xué)者追捧[17]。Cheng等[6]以落葉松木屑粗多糖AGD水溶液經(jīng)Sephacryl S-100 HR凝膠柱（1.6cm×60cm）進(jìn)行純化，流動(dòng)相為0.05mol·L-1PBS緩沖液（含0.15mol·L-1NaCl，pH值7.0），流速為0.5mL·min-1，分離得到了分子量為3.7×103Da的AGD2。實(shí)驗(yàn)顯示，AGD2具有羥自由基清除活性，此外，AGD2能更好地促進(jìn)促炎細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的分泌。Wu等[9]用DEAE Sephose FF色譜柱分離得到的超純水洗脫組分浙江金線蘭多糖AZP-1，再經(jīng)Sephacryl S-200 HR凝膠滲透柱（2.6cm×95cm）進(jìn)一步純化。用去離子水以0.3mL·2min-1的流速洗脫，得到Mw分別為3.41×104Da和4.568×10-3Da的浙江金線蘭均一多糖AZP-1a和AZP-1d，藥理實(shí)驗(yàn)表明，這兩種多糖均對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝細(xì)胞氧化損傷有保護(hù)作用。Teng等[11]經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow色譜柱洗脫得到藜麥多糖樣品QAP，根據(jù)分子量的差異，用Sephacryl S-300 HR色譜柱（2.6cm×100cm）進(jìn)一步純化，分離得到兩種多糖SQAP-1和SQAP-2，其中SQAP-2抗氧化活性顯著高于SQAP-1。Sun等[1]從駱駝刺內(nèi)生細(xì)菌NX-11中提取粗多糖，用DEAE纖維素分離得到兩個(gè)NaCl溶液洗脫組分，在Sephacryl S-500 HR色譜柱（16mm×40cm）上進(jìn)一步純化，以超純水為洗脫劑，流速為0.2mL·min-1，分別得到平均分子量為1.326×106Da和1.959×106Da的PAPS1和PAPS2，藥理活性表明，均具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

3.3 抗骨質(zhì)疏松活性多糖的分離

骨質(zhì)疏松癥是最普遍的一種全身性代謝性骨病，其特點(diǎn)是骨量和骨質(zhì)量的衰退，因骨質(zhì)疏松引發(fā)的脆性骨折發(fā)病率和死亡率逐年增加[18]。迄今已有大量研究表明，一些多糖可通過平衡骨吸收和骨形成而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。Zheng等[13]將淫羊藿粗多糖樣品溶液置于DEAE-52纖維素柱，得到蒸餾水洗脫組分CEBP1。CEBP1再經(jīng)Sephacryl S-400凝膠柱（2.5cm×100cm）用0.1M NaCl以0.5mL·min-1的流速洗脫，得到分子量約為2×104Da的均一多糖EBP，體外藥理實(shí)驗(yàn)表明，EBP呈現(xiàn)對(duì)糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的體外保護(hù)作用。Ye等[7]將駱駝刺粗多糖水溶液裝入DEAE-52纖維素柱，得到0.05M NaCl洗脫組分，再裝入Sephacryl S-100柱（1.6cm×100cm）重復(fù)分離洗脫，得到分子量為5.9×103Da的純化均一多糖APP90-2，藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，APP90-2可顯著促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖、分化和礦化，表明APP90-2具有明顯的成骨活性。

3.4 調(diào)節(jié)腸道微生物活性多糖的分離

人體腸道內(nèi)存在著數(shù)量巨大、種類千差萬(wàn)別的微生物，稱之為腸道菌群。腸道菌群失調(diào)，可觸發(fā)和加重各類疾病的發(fā)生。多糖中無(wú)法被立刻分解的成分與發(fā)酵所產(chǎn)生的短鏈脂肪酸，繼而調(diào)節(jié)腸道菌群的組成，改進(jìn)腸道生理功能，調(diào)控抗腫瘤、抗炎、抗病原微生物等基因表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)疾病治療目標(biāo)[19]。Cui等[12]用Sepharose 6B柱分離得到褐藻馬尾藻海帶多糖組分，經(jīng)Sephacryl S-300 HR柱（2.2cm×100cm）進(jìn)一步純化，得到分子量為8.4×103Da的均一多糖SHNP，體外發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腸道中短鏈脂肪酸總量、乙酸、丙酸和正丁酸顯著增加。此外，SHNP刺激腸桿菌科細(xì)菌的生長(zhǎng)，同時(shí)消耗副流感嗜血桿菌和福爾米格芽孢桿菌。這些結(jié)果表明，SHNP具有潛在參與調(diào)節(jié)腸道微生物的作用。

3.5 α-葡萄糖苷酶抑制活性多糖的分離

通過抑制α-葡萄糖苷酶，減緩淀粉分解的速率，降低和推遲小腸對(duì)葡萄糖的吸收，從而降低血糖。目前，相當(dāng)多一部分多糖也顯示出相關(guān)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，對(duì)于糖尿病糖代謝、病理的改善以及對(duì)α-糖苷酶的抑制中發(fā)揮了多種生理作用[20]。Lv等[14]從麥麩中分級(jí)醇沉得到兩個(gè)粗多糖級(jí)分裝入DEAE Cellulose-52陰離子交換柱，用0.1M NaCl溶液洗脫得到的兩個(gè)主要組分（W2和A2），再分別用Sephacryl S-400凝膠滲透色譜柱進(jìn)一步純化，以0.2mL·min-1流速得到分子量分別為1.93×105Da和1.07×105Da的超純水洗脫組分WXA-1和AXA-1。藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AXA-1對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用強(qiáng)于WXA-1，其中AXA-1對(duì)α-淀粉酶呈競(jìng)爭(zhēng)性抑制，對(duì)α葡萄糖苷酶呈混合型非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

4 結(jié)論

綜上所述，聚丙烯酰胺凝膠Sephacryl在多糖的分離純化中發(fā)揮著重要作用。除大量應(yīng)用于多糖類化合物外，Sephacryl還對(duì)肽類、激素類、蛋白、DNA片段等也有分離純化的應(yīng)用。當(dāng)前研究中，Sephacryl不僅分離范圍廣，還具有多選擇性和化學(xué)穩(wěn)定性高等特性。再配備密封柱、加壓泵、自動(dòng)收集器甚至A KTA純化系統(tǒng)等儀器設(shè)備，Sephacryl分離純化系統(tǒng)具備更加完善的自動(dòng)化機(jī)械性能，不僅擴(kuò)充了其使用領(lǐng)域，還優(yōu)化了純化效果。Sephacryl凝膠系列的廣泛使用為活性多糖的構(gòu)效關(guān)系研究、藥效機(jī)制研究提供更加有效可靠的分離純化工藝，對(duì)多糖分離純化方法的革新也起到較好的促進(jìn)作用。