趙楊楊，于貞

(煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺 264005)

香菇又名香蕈、香信，栽培歷史悠久，最早的剁花種菇法距今已經有 800 多年[1]。香菇是最常見的一種可食用真菌，其含有豐富的呈味氨基酸和核苷酸,賦予了香菇獨特的鮮味[2]， 在日常烹調中它也可以替代味精,在菜肴中起到提鮮的作用。香菇中還含有香菇多糖[3]、嘌呤[4]、多酚[5]等生物活性物質，因此香菇具有一定的抗腫瘤[6-7]、抗氧化[8-9]、降血脂[10]等生理功能。

醬油是烹飪中不可缺少的一類調味品，最初人們對醬油的要求為滿足簡單調味、上色即可，但隨著生活水平的提高以及消費觀念的轉變，人們更加注重醬油口感和營養(yǎng)價值的豐富性[11]。這使得醬油向功能型醬油的方向發(fā)展，因此眾多提高醬油營養(yǎng)價值的功能型醬油面向市場。香菇味道鮮美，營養(yǎng)價值豐富，利用香菇進行醬油的釀造不僅使醬油具備了香菇的濃郁鮮味，而且增加了醬油的生物活性成分，為人們提供了更高質量、更美味的醬油產品[12]。目前市售的大部分香菇醬油都是以香菇提取液為原料，加入到醬油中調配而成的。此方法雖然對提高醬油鮮味有所幫助，但并不能使香菇中營養(yǎng)物質和鮮味物質完全降解，充分溶解到醬油中，對于醬油品質沒有很大的改觀。只有經過微生物的降解以及各種化學反應共同作用而釀造出的原釀醬油才稱得上是高品質的香菇醬油。為了得到一種高品質的香菇醬油，本試驗以豆粕、小麥、烘干粉碎的香菇為原料制備香菇醬油成曲，通過單因素試驗研究成曲潤水量、接種量、香菇添加量和制曲時間4個因素對香菇醬油成曲中性蛋白酶活性的影響，通過正交試驗優(yōu)化香菇醬油制曲工藝，以期為香菇醬油的發(fā)酵生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株：米曲霉AS3.042，煙臺大學生物工程實驗室保藏。

試驗原料：豆粕、小麥粉(均由山東魯花生物科技有限公司提供)、香菇(購自煙臺大學市場)。

1.2 主要試驗儀器

DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9140A電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；D-1自動控制壓力蒸汽滅菌鍋 北京發(fā)恩科貿有限公司；MQD-B3R全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海旻泉儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州智博瑞儀器制造有限公司；TDL-5-A低速臺式大容量離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.3 主要試劑

酪氨酸、碳酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸、氫氧化鈉、干酪素、鹽酸：均為分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司；福林酚：分析純，上海源葉生物科技有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 成曲的制備

將豆粕用熱水潤濕至無硬心后，與小麥顆粒按1∶1(質量比)的比例混合，加入烘干粉碎的香菇，0.1 MPa，121 ℃，高壓蒸汽滅菌20 min。接入香菇粉馴化后的米曲霉AS3.042，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間，待曲料升溫結塊時進行翻曲。

1.4.2 樣品粗酶液的制備

取一定量的樣品，進行充分研磨，準確稱取1.000 g樣品，加入pH 7.5的磷酸鹽緩沖液，定容至100 mL,置于40 ℃恒溫水浴鍋中浸提1 h，期間搖勻3次。浸提完畢后，以5 000 r/min離心20 min得到粗酶液。此過程中需要測定中性蛋白酶酶活和曲料的水分含量。

1.4.3 分析檢測

中性蛋白酶酶活的測定：參考SB/T 10317-1999 《蛋白酶活力測定法》；曲料水分含量的測定：參考GB 5009.3-2016 《食品安全國家標準 食品中水分的測定》。

1.4.4 制曲工藝優(yōu)化單因素試驗

1.4.4.1 潤水量的確定

在30 ℃下，分別將成曲的潤水量設定為46%、50%、54%、58%、62%(質量比)，香菇添加量為5%(質量比)，接種量為0.8×106個/g，培養(yǎng)42 h后測定成曲的中性蛋白酶活性。

1.4.4.2 接種量的確定

確定潤水量后，以最佳潤水量進行潤水制曲。在30 ℃下，分別將成曲的接種量設定為0.4×106，0.6×106，0.8×106，1.0×106，1.2×106個/g，香菇添加量為5%(質量比)，培養(yǎng)42 h后測定成曲的中性蛋白酶活性。

1.4.4.3 香菇添加量的確定

確定潤水量和接種量后，在30 ℃下，分別將成曲中香菇添加量設定為1%、3%、5%、7%、9%(質量比)，培養(yǎng)42 h后測定成曲的中性蛋白酶活性。

1.4.4.4 成曲制曲時間的確定

以最佳潤水量、接種量和香菇添加量進行制曲，發(fā)酵溫度不變。分別在30，42，54，66，78 h取樣，測定成曲的中性蛋白酶活性。

1.4.5 制曲工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，分別以潤水量(A)、接種量(B)、香菇添加量(C)、制曲時間(D)4個因素為自變量，以中性蛋白酶酶活為響應值(Y)，根據(jù)正交試驗確定制曲工藝的最佳條件，正交試驗因素水平見表1。

表1 制曲工藝優(yōu)化正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for optimization of koji-making technology

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與繪圖處理，SPSS 26.0進行單因素方差分析，所有測定重復3次取平均值。

2 結果與討論

2.1 制曲工藝單因素試驗

2.1.1 潤水量對成曲中性蛋白酶活性的影響

水分既是使原料充分溶解的重要保證，又是維持米曲霉正常生長和代謝的必要條件。當曲料中含水量適當時，曲料吸水膨脹，營養(yǎng)物質溶出，為米曲霉的生長提供養(yǎng)料，從而加速米曲霉的生長。因此，在制曲過程中應該使曲料的水分活度保持在0.9左右，曲室相對濕度保持在90%左右，這樣才能保證米曲霉的最佳生長環(huán)境[13]。但潤水量也不宜過高，否則會造成曲料結塊、曲溫升高，反而容易增加染菌的風險，會形成酸曲、花曲，造成曲的質量下降[14]。成曲潤水量對醬油成曲中性蛋白酶活性的影響見圖1。

圖1 成曲中潤水量對中性蛋白酶酶活的影響Fig.1 Effect of moistening water amount in finished koji on the activity of neutral protease

由圖1可知，潤水量在54%時，成曲的中性蛋白酶活性最高，為1 423.62 U/g干曲，當潤水量高于54%時，成曲的中性蛋白酶活性逐漸降低。在制曲過程中，充足的水分使原料經高溫蒸煮變性糊化，從而更有利于米曲霉對原料的充分利用，同時為米曲霉的生長和維持代謝提供了充足的水分。潤水量過低，無法提供米曲霉生長所需要的水分，導致米曲霉生長速度緩慢。而當潤水量過高時，酶活降低，也驗證了上述的觀點，曲料容易結塊，部分曲溫變高，有利于其他雜菌的生長，使原料被雜菌利用降解，產生了難聞的氣味，從而影響了米曲霉的生長[15]。

2.1.2 米曲霉接種量對成曲中性蛋白酶活性的影響

米曲霉孢子從發(fā)芽生長至成熟期產酶能力不斷增強，但米曲霉的生長形態(tài)不是統(tǒng)一的，只有充足的接種量才能保證在一定的發(fā)酵時間內有大量的米曲霉達到成熟期，進而使成曲酶活達到最高值[16]。接種量對醬油成曲中性蛋白酶活性的影響見圖2。

圖2 成曲中接種量對中性蛋白酶酶活的影響Fig.2 Effect of inoculation amount in finished koji on the activity of neutral protease

由圖2可知，當米曲霉接種量為0.6×106個/g時，成曲的中性蛋白酶活性最高，達到2 655.52 U/g干曲，當高于此接種量時，成曲的中性蛋白酶活性逐漸降低。米曲霉接種量過低時酶活不高,這是因為雖然米曲霉生長達到成熟期，但是米曲霉生物量低，所以產生的酶的總量低；米曲霉接種量過高，成曲酶活降低，這可能是由于米曲霉菌絲大量繁殖，但是測定時大多數(shù)菌絲還沒有達到成熟期，所以產生的蛋白酶減少。但也有可能是因為接種量過高，米曲霉生長耗氧量急劇增加，導致培養(yǎng)基中的氧氣量不足，而米曲霉是好氧微生物，因此對米曲霉的生長產生了影響，最終導致米曲霉產酶能力不強[17]。

2.1.3 香菇添加量對成曲中性蛋白酶活性的影響

米曲霉的生長主要靠豆粕和小麥提供氮源和碳源，而香菇的營養(yǎng)價值極其豐富，也可以為米曲霉的生長提供營養(yǎng)條件。但據(jù)報道，通過水和有機溶劑提取獲得的香菇提取物能夠抑制微生物的生長，因此香菇的添加量不宜過高，否則會對米曲霉的生長起到抑制作用[18]。香菇添加量對成曲中性蛋白酶活性的影響見圖3。

圖3 成曲中香菇添加量對中性蛋白酶酶活的影響Fig.3 Effect of addition amount of Lentinus edodes in finished koji on the activity of neutral protease

由圖3可知，添加1%～5%(質量比)的香菇，成曲的中性蛋白酶活性逐漸升高，香菇添加量為5%(質量比)時，成曲的中性蛋白酶活性最高，達到3 348.30 U/g干曲，但香菇添加量高于5%(質量比)時，成曲的中性蛋白酶活性逐漸降低。香菇中含有豐富的蛋白質、多糖等營養(yǎng)物質，添加適量的香菇可以為米曲霉的生長提供充分的能量，有利于提高成曲的中性蛋白酶活性；但當香菇添加量過高時，香菇中的一些抗菌類物質比如多酚、黃酮類物質[19]，可能會抑制米曲霉的生長，從而影響酶系的分泌，最終導致成曲的中性蛋白酶活性不高。

2.1.4 制曲時間對成曲中性蛋白酶活性的影響

米曲霉從孢子發(fā)芽生長到成熟期需要一定的時間，這樣才能夠保證米曲霉達到最發(fā)達的酶系。但在實際生產過程中，從經濟成本角度出發(fā)，制曲時間不宜過長，并且米曲霉生產代謝產物的堆積也會對成曲酶活造成一定的影響[20]。制曲時間對成曲中性蛋白酶活性的影響見圖4。

圖4 制曲時間對中性蛋白酶酶活的影響Fig.4 Effect of koji-making time on the activuty of neutral protease

由圖4可知，當制曲時間在36～66 h時，成曲的中性蛋白酶活性逐漸升高，當制曲時間為66 h時，成曲中性蛋白酶活性最高，達到3 170.20 U/g干曲，當制曲時間超過66 h時，中性蛋白酶活性急劇降低。66 h之前，米曲霉不斷生長繁殖，代謝分泌旺盛，因此中性蛋白酶活性不斷提高；制曲66 h時，米曲霉的生長達到成熟期，成曲的蛋白酶活性達到最大值；但當制曲時間超過66 h時，米曲霉生長代謝產物的堆積可能對成曲酶活造成一定的影響。據(jù)報道，米曲霉在生長過程中糖代謝鏈會產生曲酸，并且隨著發(fā)酵的進行，曲酸產量會逐漸增加，而曲酸是良好的酪氨酸酶抑制劑，僅20 μg/mL 就可以抑制80%的酪氨酸酶活力[21-22]。因此如果制曲時間過長，米曲霉的代謝產物曲酸可能會對成曲的酶活產生抑制作用。

2.2 正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，以潤水量(A)、米曲霉接種量(B)、香菇添加量(C)、制曲時間(D)為自變量，以中性蛋白酶活性為響應值，進行正交試驗優(yōu)化制曲工藝，結果見表2。各因素對中性蛋白酶酶活的方差分析結果見表3。

表2 制曲優(yōu)化工藝正交試驗設計與結果Table 2 Design and results of orthogonal test for optimization of koji-making technology

續(xù) 表

表3 各因素對中性蛋白酶酶活的方差分析結果Table 3 Variance analysis results of various factors on the activity of neutral protease

由表2可知，4個因素對酶活性的影響依次為B>C>D>A，最優(yōu)組合為A2B3C1D1，即當成曲潤水量為54%(質量比)，米曲霉接種量為0.8×106個/g，香菇添加量為3%(質量比)，制曲時間為54 h時，成曲中性蛋白酶活性最高。由表3可知，米曲霉接種量對成曲中性蛋白酶活性的影響極其顯著，香菇添加量對成曲中性蛋白酶活性的影響較為顯著，而成曲潤水量和制曲時間對成曲中性蛋白酶活性的影響不顯著。

2.3 結果驗證

以最優(yōu)組合進行發(fā)酵，即成曲潤水量為54%(質量比)、米曲霉接種量為0.8×106個/g，香菇添加量為3%(質量比)，制曲時間為54 h，發(fā)酵后測定成曲中性蛋白酶活性為4 414.31 U/g干曲，均高于正交試驗組合中的中性蛋白酶活性。

3 小結

將香菇與普通成曲混合來優(yōu)化制曲工藝，有利于提高成曲的中性蛋白酶活性，這是原料中的蛋白質被充分降解、提高香菇醬油氨態(tài)氮含量的前提。對成曲中性蛋白酶活性影響的因素從大到小依次為米曲霉接種量>香菇添加量>制曲時間>潤水量。香菇醬油制曲工藝最佳條件為米曲霉接種量0.8×106個/g、香菇添加量3%(質量比)、制曲時間54 h、成曲潤水量54%(質量比)。在此優(yōu)化條件下發(fā)酵的香菇醬油成曲的中性蛋白酶酶活可達4 414.31 U/g干曲。