張林會(huì)，鄧楠，曠春桃

(中南林業(yè)科技大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，長沙 410004)

食源性致病菌所導(dǎo)致的食物中毒和食源性疾病是全球食品安全面臨的重要挑戰(zhàn)，直接關(guān)系到人類健康和環(huán)境安全，而化學(xué)合成的抗菌劑有致癌性、致畸性以及易引起食物中毒等食品安全問題，因此，安全、高效天然抗菌劑的開發(fā)顯得尤為重要。植物在抵御不利生存環(huán)境脅迫過程中，形成對植物具有保護(hù)作用的萜類化合物、酚類化合物和含氮有機(jī)物等次生代謝物，其中以萜類化合物為主要成分的植物精油主要用于防御蟲害以及致病菌侵?jǐn)_[1]。植物精油主要來自于植物的花、葉、莖、種子、果實(shí)、根或皮中的揮發(fā)性成分，具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗氧化以及驅(qū)避昆蟲等作用[2-6]。香芹酚和丁香酚分別是牛至揮發(fā)油和丁香揮發(fā)油的抑菌活性成分[7]，姜黃油對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等具有良好的抑制活性，主要抗菌活性成分是芳姜黃酮和姜黃酮[8]，山蒼子油及其主要成分檸檬醛對黑曲霉、非白色念珠菌、黃曲霉、白色念珠菌、皮膚癬菌和根霉等具有很好的抑制活性[9]。上述研究表明，萜類化合物及其含氧衍生物賦予了植物精油抗菌活性[10—12]，我國具有豐富的芳香植物資源，為天然抗菌劑或抗菌活性成分的篩選奠定了基礎(chǔ)。

本研究以我國南方特色芳香植物的精油為研究對象，采用濾紙片法研究了山蒼子精油、柏木精油、姜黃精油、八角茴香精油、香桂精油、杉木精油和迷迭香精油對4種供試菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉和根霉)的體外抑菌作用，并對其抗菌活性成分進(jìn)行了分析，以期為天然抗菌劑和抗菌活性成分的篩選提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

山蒼子、香桂葉、柏木、杉木：永順縣源植天然香精香料有限責(zé)任公司；姜黃、迷迭香葉、八角茴香：長沙市高橋中藥材市場。

細(xì)菌：大腸桿菌(E.coli)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)；真菌：黑曲霉(A.niger)、根霉(Rhizopus)，均由中南林業(yè)科技大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

胰蛋白胨(生物試劑)、酵母提取物(分析純)：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；青霉素鈉：哈藥集團(tuán)制藥總廠；瓊脂粉(生物試劑)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、二甲基亞砜、氯化鈉、氫氧化鈉、無水乙醇(均為分析純)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Clarcus 600氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Perkin Elmer公司；YJ-VS-1單人垂直超凈工作臺 無錫一凈凈化設(shè)備有限公司；DSX-18L手提式高壓蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；HPX-9052MBE恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 植物精油的提取

將山蒼子、姜黃、柏木、八角茴香、香桂葉、杉木和迷迭香葉粉碎，然后采用水蒸氣蒸餾法提取4 h，靜置分層，得到山蒼子精油(LC-EO)、姜黃精油(RCL-EO)、柏木精油(CF-EO)、八角茴香精油(LV-EO)、香桂葉精油(LCS-EO)、杉木精油(CL-EO)和迷迭香精油(RO-EO)。

1.3.2 植物精油的體外抗菌活性測定

培養(yǎng)基：細(xì)菌采用LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水定容至1 L，調(diào)節(jié)至pH 7.0～7.2)；真菌采用PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水定容至1 L)，120 ℃滅菌30 min，待用。

供試樣品溶液的制備：以滅菌后的DMSO為溶劑，采用兩倍稀釋法將植物精油和青霉素鈉分別配制成系列不同濃度的供試樣品溶液和陽性對照溶液。

菌懸液的制備：活化后的細(xì)菌在34 ℃下培養(yǎng)8～10 h，真菌在32 ℃下培養(yǎng)12～16 h，然后用無菌水稀釋到106～107CFU/mL的菌懸液，備用。

參照文獻(xiàn)[13-14]進(jìn)行測定。在無菌條件下，將20～25 mL的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中制成平板，凝固冷卻后，分別取200 μL不同菌懸液均勻涂布于相應(yīng)的培養(yǎng)基表面，然后將滅菌直徑為5.5 mm的濾紙片貼在含菌平板上，滴加5.0 μL不同濃度的供試樣品溶液，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)菌在34 ℃下培養(yǎng)24 h，真菌在32 ℃下培養(yǎng)48 h，通過抑菌圈直徑和最小抑菌濃度(MIC)評價(jià)植物精油的抑菌活性。以青霉素鈉為陽性對照，DMSO為陰性對照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3 次。

1.3.3 GC-MS分析

為進(jìn)一步確定具有良好抗菌活性的植物精油的抑菌化學(xué)成分，采用GC-MS對山蒼子精油、姜黃精油、柏木精油和八角茴香精油進(jìn)行化學(xué)成分分析。

氣相色譜條件：Elite-5MS分析色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；以He為載氣；進(jìn)樣量為0.5 μL；進(jìn)樣口溫度為250 ℃；分流比為60∶1；稀釋比為20∶1。升溫程序如下：

山蒼子精油：初溫80 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫至100 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升溫至130 ℃，保持3 min，以20 ℃/min升溫至230 ℃，保持6 min。

姜黃精油：初溫80 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升溫至250 ℃，保持2 min。

柏木精油：初溫80 ℃，保持2 min，以3.5 ℃/min升溫至230 ℃。

八角茴香精油：初溫60 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升溫至180 ℃，以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持1 min。

質(zhì)譜條件：EI離子源；電子能量70 eV；離子源溫度240 ℃；掃描范圍35～500 m/z。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物精油的抑菌性能分析

7種植物精油和陽性對照在不同濃度下的抑菌圈直徑見表1，最小抑菌濃度(MIC)見表2。

表1 7種植物精油對供試菌株的抑菌圈直徑(mm)Table 1 The inhibition zone diameters (mm) of seven kinds of plant essential oils against the tested strains

續(xù) 表

表2 7種植物精油對供試菌株的最小抑菌濃度(MIC)Table 2 The MIC of seven kinds of plant essential oils against the tested strains

由表1和表2可知，7種植物精油對4種供試菌均具有不同程度的抑制作用，對真菌的抑制活性優(yōu)于細(xì)菌。山蒼子精油的抗菌活性最好，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、根霉的MIC分別為3.13，6.25，1.56，3.13 mg/mL，尤其對黑曲霉的抑制效果好；其次是姜黃精油、柏木精油和八角茴香精油，對4種供試菌的MIC均小于12.5 mg/mL，其中對根霉的MIC分別為3.13，1.56，3.13 mg/mL。香桂精油、杉木精油和迷迭香精油的抗菌作用較弱。

2.2 植物精油的抑菌化學(xué)成分分析

為了分析山蒼子精油、柏木精油、姜黃精油和八角茴香精油的抑菌成分，對上述4種精油進(jìn)行了GC-MS分析，相對含量大于0.5%的化學(xué)成分見表3。

表3 植物精油的主要化學(xué)成分Table 3 The main chemical components of plant essential oils

續(xù) 表

山蒼子精油中相對含量大于0.5%的化學(xué)成分有14個(gè)，占山蒼子精油的96.69%，其中含量最高的是檸檬醛(香葉醛和橙花醛)，相對含量為74.07%，其次為檸檬烯(8.10%)。研究表明，檸檬醛能夠使菌株細(xì)胞膜超極化，破壞其細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)容物泄露，進(jìn)而影響其正常新陳代謝，抑制微生物的生長繁殖或?qū)е缕渌劳?。檸檬烯能使大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等微生物的膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響細(xì)胞膜的通透性，干擾細(xì)胞的正常代謝活動(dòng)，導(dǎo)致菌體死亡[15]。因此，山蒼子精油對4種供試菌的抑菌活性好，主要抑菌成分為檸檬醛和檸檬烯。

柏木精油中相對含量大于0.5%的化學(xué)成分有10個(gè)，占柏木精油的93.91%，倍半萜(78.05%)及其含氧衍生物(柏木醇，10.33%)為其主要成分。萜類化合物會(huì)破壞細(xì)胞膜的完整性，造成細(xì)胞內(nèi)容物的泄露和細(xì)胞生理功能紊亂，同時(shí)，抑制細(xì)菌蛋白和核酸的合成，從而抑制微生物生長或?qū)е录?xì)菌死亡[16]。

姜黃精油中相對含量大于0.5%的化學(xué)成分有12個(gè)，占姜黃精油的79.92%。主要成分為芳姜黃酮(37.88%)、姜黃酮(11.82%)、β-倍半水芹烯(7.82%)和α-姜黃烯(6.71%)。Negi等研究表明，芳姜黃酮、姜黃酮等是姜黃油的抑菌化學(xué)成分。

八角茴香精油中相對含量大于0.5%的化學(xué)成分有6個(gè)，占八角茴香精油的98.11%。其中茴香腦(87.79%)含量最高，其次為茴香醛。張赟彬等[17]研究表明，茴香腦和茴香醛對大腸桿菌菌液的還原糖含量、蛋白質(zhì)含量、電導(dǎo)率均有影響，在作用4 h后，菌體的細(xì)胞結(jié)構(gòu)被完全破壞，蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)也全部溶于菌液中，同時(shí)，八角茴香精油中多種成分具有協(xié)同作用。

3 結(jié)論

本研究采用濾紙片法測定了我國7種芳香植物精油在不同濃度下的抑菌圈直徑以及最小抑菌濃度(MIC)，然后采用GC-MS分析和確定了抗菌活性好的4種植物精油的主要抑菌成分。結(jié)果表明，山蒼子精油的抗菌活性最好，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、根霉的MIC分別為3.13，6.25，1.56，3.13 mg/mL，抑菌成分主要為檸檬醛和檸檬烯。姜黃精油、柏木精油和八角茴香精油的抗菌活性較好，對4種供試菌的MIC均小于12.5 mg/mL，芳姜黃酮、姜黃酮是姜黃油的抑菌化學(xué)成分，柏木精油的抗菌成分是萜類化合物，八角茴香精油的抑菌成分是茴香腦和茴香醛。香桂精油、杉木精油和迷迭香精油的抗菌作用較弱。綜上所述，山蒼子精油、姜黃精油、柏木精油和八角茴香精油或其抗菌成分具有開發(fā)為天然抗菌劑的潛力。