陳 凌，郭 艷，劉路宏，陳宏坤，王 毅，張 雪，周韓玲，李 毅

(宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644007)

甜味劑是一類能賦予食品、飲料甜味的食品添加劑，因其能極大地改善食品的口感而被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)。甜味劑按營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可分為營(yíng)養(yǎng)性甜味劑和非營(yíng)養(yǎng)性甜味劑，按甜度可分為低甜度甜昧劑和高甜度甜味劑，按來(lái)源可分為天然甜味劑和合成甜味劑[1-2]。市場(chǎng)上常見(jiàn)的甜味劑有糖精鈉、阿斯巴甜、安賽蜜、甜蜜素、紐甜、甜菊糖苷、阿力甜、三氯蔗糖、愛(ài)德萬(wàn)甜、甘草酸、新橙皮苷二氫查耳酮等[3]。食品與健康領(lǐng)域?qū)W者深入研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期食用某些人工合成甜味劑可能會(huì)引發(fā)一系列的健康問(wèn)題。因發(fā)現(xiàn)糖精鈉和甜蜜素在實(shí)驗(yàn)室用于動(dòng)物身上會(huì)引發(fā)某些疾病，美國(guó)已禁止使用糖精鈉和甜蜜素作為食品添加劑[4]。針對(duì)人工合成甜味劑在作為食品添加劑使用過(guò)程中可能會(huì)存在一些潛在風(fēng)險(xiǎn)，我國(guó)于2014 年年底發(fā)布了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)當(dāng)前市面上普遍存在的甜味劑的使用范圍和最大使用量進(jìn)行了限制[5]。

蒸餾酒是以糧谷、薯類、水果、乳類等為主要原料，經(jīng)發(fā)酵、蒸餾、勾兌而成的飲料酒[6]。醇和是蒸餾酒評(píng)判的感官指標(biāo)之一[7-8]，醇和、醇厚、綿甜、甘潤(rùn)等口味源自于酒體中的醇、酯、酸等有機(jī)物的協(xié)調(diào)搭配，并非依靠添加甜味劑來(lái)呈現(xiàn)[9]。根據(jù)GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，蒸餾酒不允許添加糖精鈉、甜蜜素等甜味劑。受經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使，一些不法分子通過(guò)向酒中添加甜味劑改善口感來(lái)獲得利益，這不僅會(huì)引發(fā)潛在食品安全風(fēng)險(xiǎn)，還嚴(yán)重?fù)p害了蒸餾酒的行業(yè)形象[10]。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確定量的方法來(lái)監(jiān)測(cè)蒸餾酒中甜味劑非常有必要。

酒類產(chǎn)品中甜味劑的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[11-14]、離子色譜法[15-16]和HPLCMS/MS 法等[17-18]，HPLC 法和離子色譜法成本低，操作簡(jiǎn)單，但僅依靠保留時(shí)間定性，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性。隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展和科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，HPLC-MS/MS 被廣泛應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域，使用HPLC-MS/MS 檢測(cè)酒類產(chǎn)品中的甜味劑，可同時(shí)依靠保留時(shí)間和化合物碎片離子定性，假陽(yáng)性少，結(jié)果精準(zhǔn)[19-20]。本研究建立了一種適用于蒸餾酒中14 種甜味劑的檢測(cè)方法，前處理簡(jiǎn)單，靈敏度高，分析速度快，適用于蒸餾酒生產(chǎn)企業(yè)開(kāi)展日常甜味劑監(jiān)測(cè)工作，為蒸餾酒流通領(lǐng)域中甜味劑檢測(cè)提供了技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：白蘭地樣品（編號(hào)為B，38 %vol），4 種白酒樣品（編號(hào)分別為S1、S2、S3、S4，其中，S1：39 %vol；S2：42 %vol；S2：48 %vol；S4：52 %vol），2種伏特加樣品（編號(hào)分別為V1 和V2，其中，V1：40%vol；V2：41%vol），所有樣品均為市售。

試劑與標(biāo)準(zhǔn)品：甲醇（LC-MS 級(jí)，美國(guó)Merck公司）；甲酸（LC-MS 級(jí)，美國(guó)fisher 公司）；甲酸銨（LC-MS 級(jí)，美國(guó)fisher 公司）；糖精鈉（≥99%，Sigma-Aldrich 公司）；甜蜜素（98 %，Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司）；安賽蜜（98 %，百靈威科技公司）；阿斯巴甜（98%，百靈威科技公司）；紐甜（98%，百靈威科技公司）；甜菊糖苷（98%，百靈威科技公司）；甜菊雙糖苷（92 %，百靈威科技）；甜菊糖苷C（98 %，百靈威科技公司）；新橙皮二氫查爾酮（≥95 %，Sigma-Aldrich 公司）；甘草酸（98 %，百靈威科技）；愛(ài)德萬(wàn)甜（≥97 %，Sigma-Aldrich 公司）；三氯蔗糖（98%，百靈威科技公司）；阿力甜（95%，英國(guó)Fluorochem 公司）；杜克苷A（98 %，百靈威科技公司）。

儀器設(shè)備：ExionLC-5500 型三重四級(jí)桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)AB Sciex 公司；Milli-Q 型超純水儀，美國(guó)Millipore 公司；mL1602 型百分之一分析天平，梅特勒-托利多公司；AE200 型萬(wàn)分之一分析天平，梅特勒-托利多公司；YM-060S 型超聲波清洗機(jī)，深圳市雨盟超聲波清洗機(jī)設(shè)備廠；HWS26 型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱?。ň_到0.0001 g）一定量的各種甜味劑于25 mL 容量瓶中，以40 %的甲醇水溶液（40∶60，V/V）溶解并定容，配制14 種甜味劑單標(biāo)儲(chǔ)備液，于-20 ℃避光保存。分別吸取一定量的各單標(biāo)儲(chǔ)備液于50 mL容量瓶中，用40%的甲醇水溶液稀釋并定容，配制成14 種甜味劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜、三氯蔗糖、阿力甜、甜菊糖苷、阿斯巴甜、紐甜、甜菊雙糖苷、甘草酸、新橙皮二氫查爾酮、愛(ài)德萬(wàn)甜、甜菊糖苷C 和杜克苷A 的濃度分別為200 μ g/L、50 μ g/L、72 μ g/L、3000 μ g/L、40 μ g/L、2000 μ g/L、144 μ g/L、120 μ g/L、600 μ g/L、5000 μg/L、80 μg/L、160 μg/L、8000 μg/L、1000 μg/L，將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液置于4 ℃環(huán)境下避光保存。試驗(yàn)過(guò)程中根據(jù)實(shí)際需求采用逐級(jí)稀釋法稀釋至合適的濃度，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品工作溶液。

1.2.2 樣品制備

直接進(jìn)樣法：將白酒、伏特加和白蘭地樣品經(jīng)0.22 μ m有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾后待測(cè)。

蒸干復(fù)溶法：取白酒、伏特加和白蘭地樣品25 mL于潔凈的蒸發(fā)皿中，60 ℃水浴蒸發(fā)至近干，以40%的甲醇水溶液復(fù)溶后轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，洗滌蒸發(fā)皿3 次，將洗滌液轉(zhuǎn)移至容量瓶并定容，混勻，取溶液1 mL，經(jīng)0.22 μ m濾膜過(guò)濾后待測(cè)。

1.2.3 檢測(cè)條件

1.2.3.1 質(zhì)譜條件

14種化合物質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化：采用針泵進(jìn)樣方式將14 種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)溶液直接導(dǎo)入質(zhì)譜儀，采用電噴霧離子源（ESI），分別在正、負(fù)模式下進(jìn)行母離子掃描，根據(jù)響應(yīng)強(qiáng)度確定檢測(cè)模式和各甜味劑的母離子；在production ion 模式下進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，分別選擇最強(qiáng)和次強(qiáng)響應(yīng)的離子碎片作為各化合物的定量離子和定性離子；在MRM 模式下，優(yōu)化各化合物定量離子和定性離子的去族電壓（DP）及碰撞電壓（CE）。

質(zhì)譜檢測(cè)條件：離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負(fù)離子模式掃描；毛細(xì)管電壓：4500 V；氣簾氣：32 psi；碰撞氣：7 psi；離子源溫度：500 ℃；加熱氣1：50 psi，加熱氣2：50 psi；檢測(cè)方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。

1.2.3.2 液相色譜條件

液相色譜條件：流動(dòng)相：A：甲酸銨溶液，B：甲醇；色譜柱：C18柱（100 mm×2.0 mm，3 μ m）；流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：2 μ L。流動(dòng)相是本試驗(yàn)要研究的因素，在不同的流動(dòng)相下進(jìn)樣分析14 種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察流動(dòng)相對(duì)質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度、各化合物分離度及峰型的影響。

1.2.4 方法學(xué)論證

1.2.4.1 線性方程、檢出限和定量限

以40%的甲醇水溶液對(duì)14 種甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行梯度稀釋，配制系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)HPLCMS/MS 分析，分別以各化合物的定量離子峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行回歸分析，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)。以定量離子S/N=3 計(jì)算各化合物的檢出限，定量離子S/N=10 計(jì)算各化合物的定量限。

1.2.4.2 加標(biāo)回收率和精密度

將白酒樣品S1 按1.4 中直接進(jìn)樣法和蒸干復(fù)溶法進(jìn)行樣品制備，進(jìn)HPLC-MS/MS 分析，計(jì)算本底值。取酒樣分別加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)品，按1.4 中兩種方法進(jìn)行處理和測(cè)定，比較直接進(jìn)樣法和蒸干復(fù)溶法的加標(biāo)回收率。

將白酒樣品S1、白蘭地B、伏特加V1 按1.4 中直接進(jìn)樣法和方法進(jìn)行樣品制備，進(jìn)HPLC-MS/MS 分析，計(jì)算本底值。另取2 種酒樣，分別加入低、中、高3 種濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品，按前方法進(jìn)行處理和測(cè)定，進(jìn)行6 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.4.3 實(shí)際樣品分析

蒸餾酒樣品過(guò)0.22 μ m 有機(jī)濾膜后進(jìn)HPLCMS/MS，測(cè)定樣品中14種甜味劑含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

采用針泵直接進(jìn)樣，優(yōu)化14 種甜味劑質(zhì)譜參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 14種甜味劑質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

2.2 液相色譜條件的選擇和優(yōu)化

通過(guò)對(duì)糖精鈉等14 種甜味劑理化性質(zhì)的研究，確立用C18色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分離。

分別以水-甲醇、0.1%甲酸水-甲醇、5 mmol甲酸銨-甲醇、10 mmol 甲酸銨-甲醇為流動(dòng)相，進(jìn)樣分析14 種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以甲酸銨-甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，化合物信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度最高；以0.1%甲酸水-甲醇為流動(dòng)相時(shí)，甘草酸峰型最好，但是，其他化合物的質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)及分離度相對(duì)較差；考察了5 mmol 甲酸銨-甲醇和10 mmol甲酸銨-甲醇作為流動(dòng)相的效果，結(jié)果沒(méi)有明顯差異，因此，最終選擇5 mmol 甲酸銨-甲醇作為本試驗(yàn)的流動(dòng)相。以5 mmol 甲酸銨-甲醇為流動(dòng)相，采用0.2 mL/min 的流速，按表2 中的洗脫梯度進(jìn)行洗脫時(shí)，各化合物分離效果好，質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)，14種甜味劑的MRM色譜圖見(jiàn)圖1。

表2 液相色譜梯度洗脫程序

圖1 14種甜味劑的MRM色譜圖

14 種甜味劑出峰順序依次為：1-2.91 min：安賽蜜；2-3.70 min：糖精鈉；3-4.54 min：甜蜜素；4-5.41 min：三氯蔗糖；5-5.81 min：阿斯巴甜；6-6.64 min：阿力甜；7-6.79 min：新橙皮二氫查耳酮；8-7.28 min：愛(ài)德萬(wàn)甜；9-7.64 min：甘草酸；10-8.13 min：紐甜；11-8.45 min：甜菊糖苷；12-8.61 min：杜克苷A；13-8.61 min：甜菊糖苷C；14-8.98 min：甜菊雙糖苷。

2.3 線性范圍和方法的檢出限、定量限

采用HPLC-MS/MS 分析系列標(biāo)準(zhǔn)溶液后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算14 種甜味劑的檢出限和定量限，結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3 可看出，14 種甜味劑在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R）不低于0.9991，檢出限低，靈敏度高。

表3 14種甜味劑線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.4 樣品前處理方法的選擇

蒸餾酒中乙醇濃度較高，還含有一定量的可揮發(fā)性微量成分，可能會(huì)干擾目標(biāo)化合物的檢測(cè)。為了評(píng)估樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)化合物分析的影響，本試驗(yàn)以白酒樣品S1 為對(duì)象，分別用直接進(jìn)樣法和蒸干復(fù)溶法處理白酒及其加標(biāo)樣品，進(jìn)HPLC-MS/MS分析，計(jì)算14種甜味劑的加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

從表4 可看出，采用蒸干復(fù)溶法對(duì)樣品進(jìn)行前處理后，甜蜜素、三氯蔗糖、鈕甜和愛(ài)德萬(wàn)甜4 種化合物加標(biāo)回收率較好，在88.5 %～99.9 %之間，其他10 種化合物的加標(biāo)回收率較差；采用直接進(jìn)樣法處理樣品時(shí)，14 種化合物的加標(biāo)回收率均較高，在90 %～115 %之間。表明HPLC-MS/MS 具有較強(qiáng)的抗基質(zhì)干擾能力。采用HPLC-MS/MS 測(cè)定蒸餾酒中甜味劑時(shí)，可選擇直接進(jìn)樣法，該法簡(jiǎn)單易操作，耗時(shí)短，人為誤差少，結(jié)果準(zhǔn)確。

表4 白酒中14種甜味物質(zhì)在不同前處理方法下的加標(biāo)回收率

2.5 加標(biāo)回收率和精密度

樣品前處理方法選擇直接進(jìn)樣法，分別測(cè)定白酒樣品S1、白蘭地B、伏特加V1 中14 種甜味劑的本底值及加標(biāo)后的含量，計(jì)算不同加標(biāo)水平下的平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表5。

從表5 可看出，不同濃度的14 種甜味物質(zhì)在白酒、伏特加、白蘭地中的平均加標(biāo)回收率在86.1 %～119.0 %之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1 %～8.5 %之間，方法的加標(biāo)回收率較好，精密度高，滿足痕量多組分分析要求。

表5 蒸餾酒中14種甜味劑加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (%,n=6)

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

利用本研究建立的分析方法對(duì)市售白蘭地樣品、4 種白酒樣品和2 種伏特加樣品中的14 種甜味劑含量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6 個(gè)蒸餾酒樣品中均未檢測(cè)出甜味劑成分。

3 結(jié)論

本研究建立了一種HPLC-MS/MS 分析蒸餾酒中14 種甜味劑含量的方法，方法學(xué)試驗(yàn)和實(shí)際應(yīng)用考察結(jié)果表明，該方法具有樣品前處理簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高、分析速度快、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，適用于蒸餾酒生產(chǎn)企業(yè)針對(duì)大量樣品開(kāi)展日常甜味劑監(jiān)測(cè)工作，為蒸餾酒流通領(lǐng)域中甜味劑檢測(cè)提供了技術(shù)參考。