鄧永平，肖 凱，車 鑫，劉曉蘭，2

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾 161006）

發(fā)酵飼料能提高動物生產(chǎn)性能、抗氧化能力，改善動物免疫機能（Lv等，2022；Zhu等，2020）。我國發(fā)酵飼料市場缺口大，在“飼料禁抗令”實施的情況下，生物發(fā)酵飼料的市場需求量進一步擴大，因此，亟需加大對發(fā)酵飼料的研發(fā)（Li等，2020）。

玉米蛋白粉是濕法生產(chǎn)玉米淀粉的主要副產(chǎn)物，蛋白質(zhì)含量高達60%，其構(gòu)成中谷氨酰胺占氨基酸總量的1/3，有報道表明，谷氨酰胺具有維持腸道結(jié)構(gòu)完整性和抗氧化功能性的作用（Beutheu等，2013）。但是由于玉米蛋白粉中蛋白質(zhì)主要是醇溶蛋白和谷蛋白，水溶性差，同時，玉米蛋白粉中賴氨酸含量較低，導(dǎo)致其直接作為飼料原料利用度低，營養(yǎng)性和功能性體現(xiàn)不足（Loy等，2019）。米糠是稻米加工副產(chǎn)物，資源豐富，但含有非淀粉多肽等抗?fàn)I養(yǎng)因子，導(dǎo)致其直接作為飼料原料生物利用度較低（張志宏等，2020）。豆粕是大豆制油副產(chǎn)物，蛋白質(zhì)含量40%以上，但因含有胰蛋白酶抑制劑等抗?fàn)I養(yǎng)因子，直接作為飼料易導(dǎo)致動物腹瀉，需要經(jīng)處理后飼喂（許欣等，2020）。微生物發(fā)酵是提高玉米蛋白粉等農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物生物利用度的主要方法。通過微生物發(fā)酵可以適度降解玉米蛋白粉、米糠、豆粕等原料中蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)，不僅可以改善飼料原料物化性質(zhì)，提高吸收利用率，降低原料中抗?fàn)I養(yǎng)因子濃度，提高飼料適口性，還可能產(chǎn)生具有抗氧化、提高免疫力等功能的小肽，提高動物機體抗氧化能力和免疫力，優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)，在一定程度上起到“替代抗生素”的作用（袁澤琿等，2022；Li n～an-Vidriales等，2020；Wang等，2019）。

本試驗以農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物玉米蛋白粉、豆粕、米糠作為發(fā)酵飼料的原料，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化多種微生物協(xié)同發(fā)酵工藝條件，旨在增加發(fā)酵飼料中可溶性蛋白含量，提高飼料的營養(yǎng)價值，為這些農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物在發(fā)酵飼料開發(fā)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種 米曲霉（Aspergillus oryzae）、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），保存于齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院菌種保藏室。

1.2 主要試劑與儀器 玉米蛋白粉，購自黑龍江龍鳳玉米開發(fā)有限公司；米糠、豆粕市售；其他試劑為分析純，購自天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。生化培養(yǎng)箱SPX-150BS-Ⅱ，天津市泰斯特儀器有限公司；高速萬能粉碎機FW80，天津市泰斯特儀器有限公司；杜馬斯定氮儀NDA701，意大利VELP公司。

1.3 培養(yǎng)基1.3.1 液體培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g，加蒸餾水溶解并定容至1000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.0。PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1000 mL，自然pH。

1.3.2 固體培養(yǎng)基 在1.3.1中的液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂即可制得斜面培養(yǎng)和平板培養(yǎng)菌種所需的固體培養(yǎng)基。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基由玉米蛋白粉、

米糠和豆粕組成，加入適量自來水，自然pH。

1.4 試驗方法

1.4.1 單因素試驗優(yōu)化發(fā)酵飼料生產(chǎn)工藝

1.4.1.1 發(fā)酵菌株的活化與種子液制備 菌株活化：將枯草芽孢桿菌劃線接種于LB斜面培養(yǎng)基，32℃培養(yǎng)24 h；將產(chǎn)朊假絲酵母接種于PDA斜面培養(yǎng)基，于32℃培養(yǎng)24 h；米曲霉接種于PDA斜面培養(yǎng)基，于28℃培養(yǎng)48 h。種子液制備：將活化的枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母分別轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基和PDA液體培養(yǎng)基中，在32℃培養(yǎng)24 h后備用；用無菌蒸餾水洗下2株霉菌孢子，制成菌懸液（控制孢子數(shù)1×107個/mL）備用。

1.4.1.2 復(fù)合菌液比例的測定 在250 mL三角瓶中加入比例為1:1:1（m/m/m）的玉米蛋白粉、米糠和豆粕（總量30 g），培養(yǎng)基中含水量40%，121℃滅菌30 min，調(diào)整米曲霉、枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母菌液比例分別為1:1:1、1:2:2、1:3:3、2:1:2、2:2:3、2:3:1、3:1:3、3:2:1、3:3:2（V/V/V），按3%接種量（V/m）向發(fā)酵培養(yǎng)基中接種復(fù)合種子液，在32℃恒溫培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白含量。

1.4.1.3 培養(yǎng)基原料比例的確定 調(diào)整培養(yǎng)基中玉米蛋白粉、米糠和豆粕比例分別為3:4:2、1:1:1、4:2:4、5:2:3、6:2:2、7:1:2（m/m/m），培養(yǎng)基含水量40%，121℃滅菌30 min，采用優(yōu)化后的復(fù)合菌液比例接種，接種量為3%（V/m），在32℃培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵產(chǎn)物可溶性蛋白含量。

1.4.1.4 培養(yǎng)基含水量的確定 在上述優(yōu)化條件下，調(diào)整培養(yǎng)基中含水量分別為20%、30%、40%、50%、55%、60%，121℃滅菌30 min，復(fù)合菌液接種量為3%（V/m），在32℃培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵產(chǎn)物可溶性蛋白含量。

1.4.1.5 單因素優(yōu)化發(fā)酵條件 在上述優(yōu)化條件下，以發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白含量為指標(biāo)，依次對接種量（分別為1%、2%、3%、5%、8%、10%，V/m）、發(fā)酵溫度（分別為30、32、34、36℃）、發(fā)酵時間（分別為48、60、72、84、96 h）進行優(yōu)化。

1.4.2 正交試驗優(yōu)化發(fā)酵飼料生產(chǎn)工藝 在單因素的試驗基礎(chǔ)上，選擇接種量（4%、5%、6%，V/m）、培養(yǎng)基含水量（45%、50%、53%，V/m）、發(fā)酵溫度（30、32、34℃）、發(fā)酵時間（60、72、84 h）四個因素進行L9（34）正交試驗進一步優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵條件。

1.4.3 發(fā)酵飼料營養(yǎng)成分分析 采用杜馬斯燃燒法測定未發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵后產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量；采用福林酚法測定可溶性蛋白含量（江成英等，2021），計 算 方 程 為y=0.0024x+0.0107，R2=0.9990，其中y為640 nm下的吸光值，x為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量（μg/mL）；采用酪氨酸法測定蛋白酶活力（鄧永平等，2016），酪氨酸含量計算方程為y=0.0106x-0.0125，R2=0.9983，其中y為640 nm下的吸光值，x為酪氨酸含量（μg/mL）；采用3，5-二硝基水楊酸法計算羧甲基纖維素酶活力（鄧永平等，2016），以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，葡萄糖含量的計算方程為y=1.0291x+0.0339，R2=0.9978，其中y為540 nm下的吸光值，x為葡萄糖含量（μg/mL）。

1.5 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel 2007和SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)，采用Duncan氏法進行多重比較檢驗，表中同行數(shù)據(jù)左上角標(biāo)或圖中數(shù)據(jù)點上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05），標(biāo)注相同字母表示差異不顯著（P＞0.05）。

2 結(jié)果

2.1 單因素優(yōu)化發(fā)酵工藝條件

2.1.1 復(fù)合種子液比例的確定 如圖1所示，米曲霉、枯草芽孢桿菌、產(chǎn)朊假絲酵母菌液比例為3:2:1時，發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白含量可達到13.16%，顯著高于本實驗其他菌種比例發(fā)酵時的可溶性蛋白含量（P＜0.05），也高于3種菌株單獨發(fā)酵的可溶性蛋白含量。米曲霉是發(fā)酵過程中降解蛋白質(zhì)的主要菌株（王國強等，2016），可溶性蛋白含量隨著米曲霉在復(fù)合菌液中比例升高而升高，同時，三種菌株在降解培養(yǎng)基蛋白質(zhì)時存在協(xié)同作用。因此，確定菌液比例為3:2:1。

圖1 菌種比例對可溶性蛋白含量的影響

2.1.2 發(fā)酵飼料原料比例確定 如圖2所示，當(dāng)物料比例為3:4:2時，產(chǎn)物的可溶性蛋白含量最低，物料比為5:2:3時可溶性蛋白含量顯著高于其他比例（P＜0.05）。培養(yǎng)基中玉米蛋白粉含量的提高在一定程度上有利于提高可溶性蛋白含量，但是玉米蛋白粉含量過高會導(dǎo)致培養(yǎng)基黏稠，不利于好氧菌株生長，導(dǎo)致可溶性蛋白含量減少。因此，確定玉米蛋白粉、米糠和豆粕粉的比例為5:2:3。

圖2 不同物料對可溶性蛋白含量的影響

2.1.3 發(fā)酵初始水含量的確定 如圖3所示，含水量為20%～50%時，可溶性蛋白含量隨著含水量增加而增加，在含水量50%時可溶性蛋白含量顯著高于其他含水量（P＜0.05）?？赡苁且驗榫晟L環(huán)境的水分含量不足時，菌種與原料、水分接觸不均勻，使得部分原料發(fā)酵不充分，菌株生長在較干燥環(huán)境，生長速度較緩慢，從而代謝能力低，導(dǎo)致可溶性蛋白含量低；菌株生長環(huán)境的水分含量過高時，培養(yǎng)基黏稠，溶氧量減少，微生物的生長繁殖受到較大影響（Yang等，2021）。因此，確定培養(yǎng)基初始含水量為50%。

圖3 不同含水量對可溶性蛋白含量的影響

2.1.4 接種量的確定 如圖4所示，隨著接種量的增加可溶性蛋白含量呈先增加后緩慢減少的趨勢，當(dāng)接種量較低時，微生物濃度較小，整體代謝速率緩慢，使得產(chǎn)物中可溶性蛋白含量較少。當(dāng)接種量過高時，菌體之間競爭營養(yǎng)物質(zhì)，同時代謝產(chǎn)物的排出和生物熱的釋放改變了培養(yǎng)環(huán)境，不利于菌株生長代謝，使得產(chǎn)物可溶性蛋白含量減少（Yang等，2021）。接種量5%時發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白含量顯著高于其他接種量（P＜0.05），因此確定接種量為5%。

圖4 不同接種量對可溶性蛋白含量的影響

2.1.5 培養(yǎng)溫度的確定 如圖5所示，發(fā)酵溫度為32℃時發(fā)酵產(chǎn)物中可溶性蛋白含量顯著高于其他溫度，超過32℃后，可溶性蛋白含量逐漸減少。原因可能是由于發(fā)酵菌株在適宜溫度時，生長代謝旺盛，產(chǎn)酶能力及其活性高；當(dāng)溫度達到36℃時，發(fā)酵菌株新陳代謝速率加快，由于生物量的快速增加會釋放生物熱，而固態(tài)發(fā)酵傳熱效率差，導(dǎo)致微環(huán)境中溫度急劇升高，熱量不能及時消散，微生物的生長和新陳代謝就會受到影響（Yang等，2021）。因此，確定發(fā)酵溫度為32℃。

圖5 不同發(fā)酵溫度對可溶性蛋白含量的影響

2.1.6 發(fā)酵時間的確定 如圖6所示，在48～72 h內(nèi)，隨著發(fā)酵時間延長，可溶性蛋白含量逐漸升高，在72 h達到最大值17.51%，72 h后呈逐漸降低趨勢?？赡苁且驗榘l(fā)酵前期，培養(yǎng)基中營養(yǎng)供給充足，菌株生長繁殖力旺盛，產(chǎn)水解酶能力較強；在發(fā)酵后期，由于菌株過量繁殖導(dǎo)致培養(yǎng)基中營養(yǎng)被大量消耗，供給不充足，導(dǎo)致可溶性蛋白含量降低。因此，確定發(fā)酵時間為72 h。

圖6 發(fā)酵時間對可溶性蛋白含量的影響

2.2 正交試驗方案和結(jié)果 在單因素試驗基礎(chǔ)上采用L9（34）正交試驗對接種量（4%、5%、6%）、含水量（45%、50%、53%）、發(fā)酵溫度（30、32、34℃）、發(fā)酵時間（60、72、84 h）四個條件進一步優(yōu)化，結(jié)果見表1。

表1 L9（34）試驗結(jié)果

如表1所示，以可溶性蛋白含量為指標(biāo)，各因素的響應(yīng)順序為RA＞RB＞RC＞RD，即接種量＞含水量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間，通過正交試驗優(yōu)化發(fā)酵得出最優(yōu)組合條件為A3B3C2D2，即接種量6%、含水量53%、發(fā)酵溫度32℃、發(fā)酵時間72 h。在上述最佳條件下進行驗證試驗，確定最適工藝條件下可溶性蛋白含量平均值為19.37%。

2.3 發(fā)酵飼料部分營養(yǎng)成分分析 對采用上述條件進行多菌株發(fā)酵獲得的發(fā)酵飼料（發(fā)酵組）的相關(guān)營養(yǎng)成分含量進行測定，并與同等條件下處理的未發(fā)酵原料（未發(fā)酵組）進行比較，結(jié)果見表2。

表2 營養(yǎng)成分分析

由表2可知，發(fā)酵組的干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和可溶性蛋白含量以及蛋白酶、纖維素酶活力顯著高于未發(fā)酵組（P＜0.05），經(jīng)過多菌株的混合發(fā)酵有效提高了以玉米蛋白粉為主，米糠和豆粕為輔組成的飼料的部分營養(yǎng)成分含量。

3 討論

3.1 原料組成對發(fā)酵效果的影響 我國蛋白飼料資源短缺，開發(fā)高蛋白含量的農(nóng)產(chǎn)品加工副產(chǎn)物是緩解這一現(xiàn)狀的必要途徑。玉米蛋白粉含豐富的玉米黃質(zhì)、葉黃素，也是蛋氨酸和半胱氨酸的良好來源，但賴氨酸和色氨酸含量非常低（Loy等，2019），需與其他原料搭配應(yīng)用提高發(fā)酵飼料的可飼性。姜鑫（2021）利用單一乳酸菌發(fā)酵玉米蛋白粉和麩皮混合物，當(dāng)二者比例為6:4（m/m）時發(fā)酵效果最好。江成英等（2021）利用芽孢桿菌復(fù)合菌劑發(fā)酵玉米蛋白粉和麩皮混合物，當(dāng)二者比例為7:3（m/m）時發(fā)酵效果最好。從氨基酸構(gòu)成考慮，豆粕蛋白缺乏甲硫氨酸和半胱氨酸，但富含賴氨酸和色氨酸，與玉米蛋白粉蛋白質(zhì)的氨基酸構(gòu)成具有互補性（Loy等，2019）。通過微生物發(fā)酵，不僅可以有效降解原料中的大分子物質(zhì)，還能減少豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，提高飼料的營養(yǎng)價值 （Li等，2020）。Hamidoghli（2020）研究發(fā)現(xiàn)，用枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕和玉米蛋白粉產(chǎn)物替代魚粉可以改善白對蝦的生長、飼料利用率、免疫反應(yīng)和抗病性，同時能改善水質(zhì)指標(biāo)。本研究經(jīng)優(yōu)化確定發(fā)酵飼料由玉米蛋白粉、豆粕和米糠組成，質(zhì)量比例為5:2:3。

3.2 菌種對發(fā)酵效果的影響 發(fā)酵菌株是決定發(fā)酵飼料品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一。發(fā)酵飼料常用生產(chǎn)菌株類型包括芽孢桿菌屬、乳酸菌和真菌中的某些菌株（Wang等，2019；Sugiharto等，2019）。米曲霉具有較強的產(chǎn)蛋白質(zhì)酶、纖維素酶等水解酶的活力，在開發(fā)功能食品方面有較多的研究。已有報道表明，米曲霉發(fā)酵米糠能夠增加可溶性蛋白含量，同時產(chǎn)生益生元，促進腸道雙歧桿菌和擬桿菌的增殖（Yang等，2021）；攝入米曲霉發(fā)酵的米糠和糙米的培養(yǎng)物可以抑制炎癥細胞浸潤和體細胞突變而防止腫瘤細胞轉(zhuǎn)移（Nemoto等，2022）。產(chǎn)朊假絲酵母具有較強的合成細胞蛋白質(zhì)和維生素B的能力，是食品和飼料研究中常用菌株（Hansen等，2019；Cruz等，2019）。

多菌株發(fā)酵能夠發(fā)揮菌株間的協(xié)同作用，使發(fā)酵效果優(yōu)于單菌株發(fā)酵。袁澤琿等（2022）利用短小芽孢桿菌SE5、乳酸乳球菌17和釀酒酵母菌Sa發(fā)酵豆粕，使豆粕中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白分別降解了71.48%和73.29%。本研究采用米曲霉、枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母協(xié)同發(fā)酵玉米蛋白粉、米糠和豆粕混合物，通過優(yōu)化工藝條件，顯著提高了原料中蛋白質(zhì)的溶解性，提高了產(chǎn)物中水解酶的活力，可溶性蛋白含量較江成英等（2021）報道的枯草芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌混合發(fā)酵制得的玉米蛋白粉發(fā)酵飼料高出40.7%。

3.3 工藝條件對發(fā)酵效果的影響 微生物的代謝受溫度影響較大，當(dāng)溫度適宜時，酶活力旺盛，新陳代謝速度快，發(fā)酵周期短，相反，溫度較低時，酶促反應(yīng)速度減緩，發(fā)酵周期延長。因此，優(yōu)化發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間十分必要。魏炳棟等（2017）發(fā)現(xiàn)，采用地衣芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、黑曲霉四株菌混合發(fā)酵玉米蛋白粉時在33℃發(fā)酵84 h時達到最佳效果。江成英等（2021）發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌復(fù)合菌劑在33℃發(fā)酵約87 h效果最佳。在本研究中米曲霉、枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母在32℃發(fā)酵72 h時達到最佳效果。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，以玉米蛋白粉為主料的發(fā)酵飼料制備工藝為：玉米蛋白粉、米糠和豆粕的質(zhì)量比例為5:2:3，含水量為53%（V/m），米曲霉、枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母組成的復(fù)合菌液比例為3:2:1，接種量為6%，發(fā)酵溫度為32℃，發(fā)酵時間為72 h。在此條件下，發(fā)酵飼料中可溶性蛋白含量19.37%、粗蛋白質(zhì)約40.22%、干物質(zhì)約54.17%、蛋白酶活力（2926.52±103.58）U/g、纖維素酶活力（1092.07±76.16）U/g，飼料散發(fā)淡淡的醬香味。