顏曉鈺，司 玥，邢 翔

(山東大學(xué)威海海洋學(xué)院，山東威海 264209)

嗜高溫菌分裂周期短、代謝速率快、生長(zhǎng)率高、適應(yīng)性強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)、能源利用、石油開采、液體燃料生產(chǎn)、生物轉(zhuǎn)化及抗生素生產(chǎn)等領(lǐng)域。利用高溫菌進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵，可以縮短生產(chǎn)周期、避免微生物感染，在食品等行業(yè)中具有廣泛應(yīng)用前景[1]。在食品工業(yè)中甘油常用作甜味劑、煙草劑的吸濕劑和溶劑等，其主要生產(chǎn)方式還是化學(xué)合成法或使用天然油脂進(jìn)行皂化反應(yīng)[2-3]，發(fā)酵法雖已有應(yīng)用，但多為酵母等真菌發(fā)酵[4]。本研究在獲得嗜高溫細(xì)菌后，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定等，確定了菌株的分類地位并鑒定其產(chǎn)甘油，通過對(duì)菌株發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，提高了菌株的甘油產(chǎn)量，為細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)甘油提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源 在黑松的根系土壤中，分離得到嗜熱嗜氣解硫胺素芽孢桿菌(Aneurinibacillusthermoaerophilus)。

1.1.2 試劑 瓊脂粉、胰蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、氯化銨，高碘酸鈉、碘化鉀、硫代硫酸鈉、濃鹽酸，試驗(yàn)所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基 胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、氯化鈉10 g，蒸餾水溶解至1 000 mL，自然pH，121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基加入1.8%～2.0%瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離純化及篩選 將10 g土壤裝入盛有200 mL LB液體培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶，于55 ℃培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)48 h，得到菌株富集液。取菌懸液進(jìn)行10-1～10-7梯度稀釋，分別將100 μL稀釋液用涂布棒均勻涂抹于LB固體培養(yǎng)基平板，55 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，后多次進(jìn)行劃線純化，篩選目標(biāo)菌株。

1.2.2 菌株的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定 在自然光下觀察菌落形態(tài)(大小、形狀、顏色、邊緣和透明度等)；取復(fù)壯后菌體進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢，觀察菌落顏色和形態(tài)；同時(shí)，將菌體用戊二醛等溶液處理，進(jìn)行透射電鏡觀察。依照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[5]進(jìn)行生理生化測(cè)定。

1.2.3 菌株分子生物學(xué)鑒定 對(duì)菌株DNA進(jìn)行提取并使用27F通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳驗(yàn)證后，送至華大基因科技公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast相似性比對(duì)分析，使用MEGA軟件中的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[6]。

1.2.4 菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定 取2 mL種子液接種到100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于55 ℃恒溫培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)，采用紫外分光光度法[7]每隔3 h進(jìn)行OD 60 nm測(cè)定，繪制24 h內(nèi)以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、平均OD 600 nm為縱坐標(biāo)的生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 菌株的最佳發(fā)酵條件確定 采用單因素輪換法依次考察不同碳源、溫度、鹽度、pH、接種量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，以獲得最佳發(fā)酵條件。使用酶標(biāo)儀[8]檢測(cè)菌株在不同生長(zhǎng)條件下的OD 600 nm，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 菌株在最適生長(zhǎng)條件下的甘油產(chǎn)量 配制0.023 mol/L的高碘酸鈉溶液、20%碘化鉀溶液、0.05 mol/L的硫代硫酸鈉溶液、20%鹽酸溶液和淀粉指示劑，利用高碘酸-氧化法[9]對(duì)菌株在最佳生長(zhǎng)條件下的甘油產(chǎn)量進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Excel、MEGA 7.0等軟件對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定結(jié)果

菌落為圓形、乳白色，邊緣透明不規(guī)則，表面光滑、濕潤(rùn)；通過革蘭氏染色和光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，菌株被染為紫色，屬革蘭氏陽(yáng)性菌，短小桿狀，可見明顯芽孢；透射電鏡顯示，菌株為長(zhǎng)桿狀，有鞭毛，胞外產(chǎn)物較多(圖1、圖2)。采用API 50CH試劑盒進(jìn)行生理生化鑒定，由附表得知，發(fā)酵產(chǎn)物中有甘油產(chǎn)生且無(wú)影響甘油含量測(cè)定的糖類，可使用高碘酸-氧化法進(jìn)行甘油測(cè)定。

圖1 菌株形態(tài)觀察

圖2 菌株透射電鏡照片

附表 生理生化鑒定結(jié)果

2.2 菌株分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增后，均得到1 500 bp的基因序列片段，將測(cè)序后獲得的基因序列在數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列對(duì)比，該菌株序列與Aneurinibacillusthermoaerophilus的16S rDNA 序列同源性高達(dá)99.87%，同時(shí)結(jié)合菌株的形態(tài)觀察及生理生化鑒定結(jié)果，鑒定菌株為Aneurinibacillusthermoaerophilus，并編號(hào)為AneurinibacillusthermoaerophilusY4。同時(shí)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，顯示菌株與Aneurinibacillusthermoaerophilus親緣關(guān)系最近(圖3)。

圖3 菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株的生長(zhǎng)曲線

在搖床振蕩培養(yǎng)的條件下，用紫外分光光度計(jì)測(cè)得菌株培養(yǎng) 0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 的OD 600nm，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3組平行。由圖4生長(zhǎng)曲線可知，菌株在0～6 h為生長(zhǎng)延遲期，6～21 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此后進(jìn)入平臺(tái)期，24 h后進(jìn)入衰亡期。

圖4 菌株生長(zhǎng)曲線

2.4 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 不同碳源對(duì)發(fā)酵的影響 取菌株種子液2 mL分別接種在葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基上，其他條件相同且適宜，50℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后使用酶標(biāo)儀測(cè)定其OD值，以空白培養(yǎng)基作對(duì)照，比較不同碳源對(duì)發(fā)酵的影響，每個(gè)碳源設(shè)3個(gè)重復(fù)。通過圖5可知，菌株在生長(zhǎng)過程中，葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉均被利用，但是葡萄糖更利于菌株的生長(zhǎng)，獲得最大菌株生長(zhǎng)密度。依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè)葡萄糖是菌株生長(zhǎng)的最佳碳源。

圖5 碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

2.4.2 不同溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 將2 mL種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制發(fā)酵初始鹽度、pH及其他發(fā)酵條件一致且適宜，改變發(fā)酵溫度，分別于40、45、50、55、60 ℃溫度下進(jìn)行試驗(yàn)，以空白培養(yǎng)基作對(duì)照，探究最適發(fā)酵溫度；每個(gè)溫度設(shè)3個(gè)重復(fù)。當(dāng)溫度在45～60 ℃范圍內(nèi)，菌株均能生長(zhǎng)，可說明菌株有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，但是溫度在40 ℃時(shí)不利于菌株的生長(zhǎng)。50 ℃時(shí)獲得菌株生長(zhǎng)最大密度，可以推測(cè)溫度為50 ℃是菌株最佳生長(zhǎng)溫度且低于40 ℃不利于菌株的生長(zhǎng)(圖6)。

圖6 不同溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

2.4.3 不同鹽度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 將2 mL種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制發(fā)酵溫度、pH及其他發(fā)酵條件一致且適宜，改變發(fā)酵時(shí)菌劑所處環(huán)境的鹽濃度，分別按照2.5‰、5‰、10‰、15‰、20‰鹽濃度進(jìn)行試驗(yàn)，以空白培養(yǎng)基作對(duì)照，探究最適發(fā)酵鹽濃度。每個(gè)鹽濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。當(dāng)鹽度為5%～15%時(shí)，隨著鹽度的升高，菌株密度不斷增大；但是當(dāng)鹽度高于15%時(shí)，隨著鹽度的升高，菌株的發(fā)酵減弱，可能是因?yàn)楦邼舛鹊柠}濃度影響降解細(xì)菌細(xì)胞的滲透壓，嚴(yán)重者可導(dǎo)致菌體裂解死亡。當(dāng)鹽濃度在10‰～20‰時(shí)，菌株發(fā)酵均良好，可推測(cè)菌劑發(fā)酵的最佳的鹽濃度為15‰(圖7)。

圖7 不同鹽度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

2.4.4 不同pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 在控制溫度、鹽度及其他發(fā)酵條件一致且適宜的條件下，將2 mL種子液分別接種在pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的培養(yǎng)基上，50℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后測(cè)定其降解效能，以空白培養(yǎng)基對(duì)照，比較不同pH值對(duì)發(fā)酵的影響；每個(gè)pH設(shè)3個(gè)重復(fù)。當(dāng)pH 值為5或9時(shí)，菌株幾乎不發(fā)酵；而當(dāng)pH值在6～8時(shí)，菌株發(fā)酵隨著pH值趨向中性而增強(qiáng)，可見菌株的發(fā)酵與環(huán)境pH有很大的相關(guān)性，可推測(cè)趨近中性的環(huán)境更利于菌株發(fā)酵且pH值為7時(shí)是菌劑的最佳發(fā)酵條件(圖8)。

圖8 不同pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

2.4.5 不同接種量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 在控制溫度、鹽度及其他發(fā)酵條件一致且適宜的條件下，改變發(fā)酵時(shí)種子液的接種量，分別按照2%、6%、10%、14%、18%的接種量進(jìn)行試驗(yàn)，以空白培養(yǎng)基作對(duì)照，探究最適接種量。每個(gè)接種量設(shè)3個(gè)重復(fù)。接種量在2%～18%范圍內(nèi)，菌株均能生長(zhǎng)，可說明菌株有較強(qiáng)的耐鹽能力。但是接種量為2%時(shí)，不利于菌株的發(fā)酵；接種量在6%～18%時(shí)，隨著接種量的變多菌株密度變化不大，可以推測(cè)接種量為6%是菌株最佳接種量(圖9)。

圖9 不同接種量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

2.5 菌株在最佳發(fā)酵條件下的甘油產(chǎn)量

取發(fā)酵液10 mL于小燒杯中加少量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容。移取上述溶液10 mL于碘量瓶并加入20 mL高碘酸鈉溶液，混合均勻后于黑暗中避光靜置40 min，再加入20%碘化鉀溶液和20%鹽酸溶液各15 mL，用硫代硫酸鈉溶液滴定，近終點(diǎn)時(shí)，加入2～3 mL淀粉指示劑，繼續(xù)滴定溶液至藍(lán)色消失且30 s內(nèi)不再恢復(fù)藍(lán)色，同時(shí)做試樣空白對(duì)照。試驗(yàn)測(cè)得，菌株發(fā)酵液甘油產(chǎn)量為6.003%。

(1)

式(1)中，w—樣品中甘油的含量(%)；V1—試樣消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)V2—空白試樣消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL)；C—硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mol/L)；M—甘油相對(duì)分子質(zhì)量。

3 討論

嗜高溫菌在眾多的生產(chǎn)工藝中都具有廣泛的應(yīng)用，通過對(duì)嗜高溫菌的篩選并探究其功能，可為生產(chǎn)生活帶來(lái)諸多便利。通過在黑松的根系土壤中的篩選，我們獲得了一株嗜高溫菌，經(jīng)進(jìn)一步探究，其可產(chǎn)甘油。通過對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，研究得菌株最佳生長(zhǎng)條件：碳源為葡萄糖、50 ℃、鹽度為15‰、pH=7、接種量為6%等，同時(shí)測(cè)得其在最佳發(fā)酵條件下甘油產(chǎn)量為6.003%，該產(chǎn)量雖已高于克魯斯假絲酵母、釀酒酵母等，但與馴化后酵母類真菌發(fā)酵相比，處于中等水平[9]。為進(jìn)一步提高甘油產(chǎn)量，可對(duì)該株細(xì)菌進(jìn)行馴化。查閱文獻(xiàn)得知，真核微生物即釀酒酵母等對(duì)外界滲透壓脅迫的應(yīng)答受高滲甘油應(yīng)答途徑 (HOG途徑)的調(diào)控[10]，可從菌株的耐高滲透壓特性入手，對(duì)菌株進(jìn)行馴化，同時(shí)也為細(xì)菌的馴化提供了一定的研究方向?？稍谂囵B(yǎng)基中適當(dāng)增加鹽的含量，以期完成對(duì)該株細(xì)菌的馴化，獲得更高的甘油產(chǎn)量。