文│劉占艷（山東省無棣縣畜牧獸醫(yī)管理服務(wù)中心）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的，主要引起偶蹄動物的一種急性、烈性、危害性大的傳染病，以O(shè)型和A型血清型多發(fā)。該病發(fā)病速度快，傳播范圍廣，對畜產(chǎn)品質(zhì)量安全和進(jìn)出口貿(mào)易造成重大危害，不利于畜牧業(yè)的綠色健康發(fā)展。

一、口蹄疫的診斷方法

1.臨床診斷?？谔阋呤荝NA病毒，為二十面體的球形結(jié)構(gòu)，主要感染牛、羊、豬等偶蹄獸，發(fā)病速度快，傳染性強(qiáng)，病程3～10天，發(fā)病率100%，感染動物出現(xiàn)發(fā)熱、精神萎靡、食欲減退，主要特征是口、蹄、鼻等部位出現(xiàn)水泡，破損后留有結(jié)痂。幼齡動物感染后，如果護(hù)理不到位，死亡率100%，成年動物感染后，消瘦、生產(chǎn)能力下降，部分動物自愈后，無明顯癥狀，會長期帶毒，成為隱性感染，給畜產(chǎn)品交易和食品安全帶來重大隱患。

2.實(shí)驗(yàn)室診斷。在基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室，主要應(yīng)用液相阻斷ELISA實(shí)驗(yàn)方法檢測偶蹄動物的血清，不足之處是耗時費(fèi)力，檢測通量低。筆者在多年動物疫病實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上優(yōu)化了檢測方法，提出高通量液相阻斷ELISA口蹄疫病毒檢測法，檢測的準(zhǔn)確性提高2～3倍，節(jié)約了時間，節(jié)省了移液槍頭等實(shí)驗(yàn)耗材，降低了檢測成本。做好高通量液相阻斷ELISA實(shí)驗(yàn)方法的關(guān)鍵因素是確定合適的血清稀釋倍數(shù)，考慮不同稀釋倍數(shù)有不同的檢測范圍，試驗(yàn)中把羊血清直接配比稀釋成1∶8，可以保證檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和真實(shí)性，更好地為養(yǎng)殖戶提供批量檢測。

二、口蹄疫液相阻斷ELISA抗體檢測方法

該方法的原理是在液相條件下將待檢血清與病毒反應(yīng)，病毒與特異性抗體充分結(jié)合，推斷出待檢血清中特異性抗體的數(shù)量。筆者從事獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室抗體監(jiān)測工作十余年，現(xiàn)以檢測20份羊血清的O型口蹄疫病毒為例，將高通量液相阻斷ELISA試驗(yàn)方法的工作經(jīng)驗(yàn)總結(jié)如下。

1.檢測樣品。采集20份羊全血樣品后應(yīng)盡快分離出血清（樣品不能有溶血狀態(tài)、受污染、破損、變質(zhì))，編號為S1～S20。

2.試驗(yàn)器材。酶標(biāo)儀；37℃恒溫箱；超純水儀；單道和多道移液器；配套移液槍頭；96孔U型血清稀釋板；移液槽；吸水紙；檢測試劑盒是蘭州獸研生物科技有限公司生產(chǎn)的口蹄疫O型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒（改進(jìn)型）。

3.實(shí)驗(yàn)操作步驟。稀釋20份羊血清需要1塊96孔U型微量稀釋板，在血凝板邊緣標(biāo)記數(shù)字（橫向標(biāo)記為1～12，縱向標(biāo)記為A～H）。先在稀釋板的A1～A10、B1～B10孔中加入PBST稀釋液140微升/孔，然后在以上20孔加入待檢血清樣品20微升/孔，混勻后把血清混合液取出100微升移到抗原包被板的A1～A10、B1～B10孔中，并做好標(biāo)記。

包被板C、D、E、F、G、H列的1～10孔分別加入PBST稀釋液50微升/孔。再用10～300微升8道或12道移液器以50微升/孔的量稀釋從第A～D列S1～S10血清混合液，DS1～DS10混合液吸出50微升棄掉。第E～H列S11～S20樣品同上依次稀釋，HS11～HS20混合液吸出50微升棄掉。

陽性對照稀釋：在抗原包被板A11～H11孔先加入PBST稀釋液50微升/孔，然后在A11孔中加入陽性對照血清（已稀釋濃度為1∶8）50微升，混勻后以50微升/孔的量依次稀釋到H11孔，從H11孔中吸出50微升棄掉。陰性對照稀釋：在抗原包被板A12～B12孔先加入PBST稀釋液50微升/孔，然后在A12孔中加入陰性對照血清50微升，混勻后吸出50微升移到B12孔，從B12孔中吸出50微升棄掉。

由表3可知，抗體效價大于或等于1∶128時判定為口蹄疫O型抗體陽性，抗體效價1∶64～1∶128判為可疑，小于1∶64判為陰性。讀數(shù)結(jié)果：本次試驗(yàn)ELISA包被板試驗(yàn)結(jié)果有效，計算出OD值＝0.87，抗體陽性孔數(shù)20個，抗體陽性合格率100%。

表3 20份羊血清O型口蹄疫檢測結(jié)果

4.分析與總結(jié)。在液相阻斷ELISA抗體檢測試劑盒說明書的基礎(chǔ)上，結(jié)合工作實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，待檢血清提前進(jìn)行倍比稀釋，倍比稀釋后再把血清稀釋液從稀釋板轉(zhuǎn)移到包被板上。本次試驗(yàn)中把羊血清直接配比成1∶8，將混合均勻的血清稀釋液按100微升/孔的量，從稀釋板直接移到包被板A1～A10孔中，然后取50微升/孔，用多頭移液槍在包被板上直接稀釋成所需比例。

高通量液相阻斷ELISA試驗(yàn)方法的好處：保證血清稀釋液移板時是足量的，節(jié)省了稀釋后移板的一部分時間，按轉(zhuǎn)移1個血清樣品用時5秒計算，20個樣品可節(jié)時1.5分鐘，提高了工作效率；節(jié)省大量的移液槍頭，節(jié)省了試驗(yàn)耗材，可用于大批量的口蹄疫免疫效果檢測；用PBST稀釋液洗板時，若洗滌液少了洗板不均勻達(dá)不到洗板效果，若洗滌液多了在操作過程中容易溢出造成混孔混樣，筆者根據(jù)多次試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為用量260～280微升/孔較好。

三、口蹄疫液相阻斷ELISA的重要意義

1.促進(jìn)畜牧業(yè)綠色發(fā)展?，F(xiàn)如今，人類新發(fā)疾病絕大多數(shù)來源于動物和動物源性食品，通過免疫無疫區(qū)高標(biāo)準(zhǔn)的建設(shè)，有效控制和撲滅了重大動物疫病，有效保護(hù)了人類生命安全和維護(hù)公共衛(wèi)生健康。建立健全生物安全工作環(huán)境，最大限度地減少動物疫病流行造成的社會和經(jīng)濟(jì)損失，減少了人畜共患病和動物性食品殘留對人體的危害，降低動物疫病帶來的食品安全風(fēng)險給社會提供安全放心的食品。

2.提升畜產(chǎn)品質(zhì)量安全。通過對動物疫病免疫效果的檢測可以推動免疫無疫區(qū)的建設(shè)，進(jìn)一步推進(jìn)無疫區(qū)綠色、安全、放心畜產(chǎn)品品牌的影響力，全方位提高畜產(chǎn)品市場占有率，培育優(yōu)質(zhì)畜產(chǎn)品新品牌，提升新品牌建設(shè)和畜產(chǎn)品質(zhì)量品質(zhì)，提高畜產(chǎn)品出口貿(mào)易，吸納國內(nèi)外飼料、獸藥和科研機(jī)構(gòu)等來無疫區(qū)投資生產(chǎn)。

3.助力“無疫區(qū)的建設(shè)”。山東省在全國率先推行強(qiáng)制免疫“先打后補(bǔ)”，又于2022年7月初通過了全國動物衛(wèi)生風(fēng)險評估專家委員會的審議，成為首個全省域通過口蹄疫、高致病性禽流感“雙病”無疫區(qū)的省份。無棣縣地處山東省的北大門，將切實(shí)筑牢動物疫病防線，擦亮“無疫省”金字招牌，依靠縣疫控中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室，利用口蹄疫液相阻斷ELISA等檢測方法可更好地做好口蹄疫、高致病性禽流感的抗體檢測工作，提供科學(xué)、有力、堅實(shí)的數(shù)據(jù)做支撐，為維護(hù)“無疫省”和強(qiáng)制免疫“先打后補(bǔ)”高標(biāo)準(zhǔn)、高水平長效運(yùn)行，進(jìn)行保駕護(hù)航。

四、結(jié)語

近些年，全球疫情頻發(fā)，口蹄疫作為重大動物傳染病，在我國主要為O型和A型，呈零星散發(fā)，給畜牧業(yè)發(fā)展和畜產(chǎn)品交易帶來不利影響。為了減輕動物疫病的發(fā)生，我國采取因地制宜、強(qiáng)制免疫和疫病持續(xù)監(jiān)測凈化的防控措施。通過液相阻斷ELISA等檢測方法，降低了成本，提高了檢測效率和準(zhǔn)確度，及時評價疫苗免疫效果，實(shí)現(xiàn)更為經(jīng)濟(jì)、高效的檢測口蹄疫疫情，助力畜牧業(yè)持續(xù)綠色健康發(fā)展。

表2 96孔包被板加入20份血清布局圖