孫玉婷，鄭曉衛(wèi)，，葉 力，陳玉紅，楊 鑫，劉沛通，丁子元

(1.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209；2.酒鬼酒股份有限公司，湖南吉首 416099)

中國(guó)白酒歷史悠久，以糧谷類為主要原料，以大曲、小曲或者麩曲為糖化發(fā)酵劑，采用固態(tài)、半固態(tài)或者液態(tài)的發(fā)酵方式，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾、老陳、勾調(diào)等過(guò)程制成[1]。中國(guó)白酒由于其生產(chǎn)所在的自然環(huán)境差異、釀造原料差異、糖化發(fā)酵劑差異、生產(chǎn)工藝差異和餾酒差異，風(fēng)格各具特色。

隨著“健康中國(guó)”戰(zhàn)略的制定與實(shí)施，消費(fèi)者對(duì)于白酒健康層面的需求也愈加明顯。食品安全與飲食健康成為熱議話題[2]，健康飲酒被提升至新的高度。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015—2019年白酒消費(fèi)趨勢(shì)向名優(yōu)產(chǎn)品轉(zhuǎn)變，白酒產(chǎn)業(yè)正在向高質(zhì)量發(fā)展穩(wěn)步推進(jìn)，研究?jī)?nèi)容也向白酒健康價(jià)值等方向傾斜。

已知白酒中的功能因子包含酸類、醇類、酚類、酯類、醛酮類、活性肽、氨基酸、多糖和吡嗪類等，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降脂、降血壓、鎮(zhèn)痛、抑菌、降血糖，預(yù)防心腦血管疾病、精神系統(tǒng)疾病等功效[3]，如亞麻酸、γ-氨基丁酸、洛伐他汀等成分早已在行業(yè)開(kāi)展研究。

四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP）又名川芎嗪[4]，易溶于醇，微溶于水，近年來(lái)受到行業(yè)內(nèi)廣泛關(guān)注。其對(duì)白酒醬香風(fēng)味的形成有重要貢獻(xiàn)，同時(shí)也是行業(yè)公認(rèn)的“健康因子”，具有擴(kuò)張血管、輕度降壓、防止血小板凝集與血栓形成、抑制纖維細(xì)胞增生、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、提升免疫水平、利尿、護(hù)肝、體外抗炎等諸多功效[5-6]。本文綜述了TTMP 在白酒中的研究進(jìn)展，旨在為后續(xù)學(xué)者進(jìn)一步研究提供參考。

1 TTMP在白酒中的研究進(jìn)展

早在20 世紀(jì)80 年代，在白酒風(fēng)味物質(zhì)解析時(shí)發(fā)現(xiàn)了TTMP 的存在，2005 年，莊名揚(yáng)提出通過(guò)美拉德反應(yīng)生成吡嗪等雜環(huán)化合物有助于白酒風(fēng)味的形成[7]，2006 年吳建峰提出TTMP 是白酒中的主要功能性成分之一，在不同香型白酒中普遍存在，引起行業(yè)關(guān)注[5-6]，2012 年徐巖團(tuán)隊(duì)[8]依托“中國(guó)白酒169 計(jì)劃”分析檢測(cè)到茅臺(tái)酒中有重要風(fēng)味貢獻(xiàn)度的物質(zhì)中TTMP 等吡嗪類化合物有較高濃度，為白酒“健康因子”概念的引入奠定基礎(chǔ)。

隨著人們對(duì)健康關(guān)注度的提高和日常檢驗(yàn)分析技術(shù)的提升，近年來(lái)TTMP 在白酒領(lǐng)域的研究熱度逐漸升溫，熱點(diǎn)集中于探究白酒發(fā)酵過(guò)程中TTMP 的生成方式和重要積累環(huán)節(jié)，高產(chǎn)TTMP 功能菌株的分離、篩選及強(qiáng)化應(yīng)用，利用多種檢測(cè)手段對(duì)白酒生產(chǎn)過(guò)程與成品酒中的TTMP 進(jìn)行定性與定量分析等[9]。

1.1 白酒釀造過(guò)程中TTMP的生成和積累

1.1.1 TTMP的生成方式

早期學(xué)者對(duì)于TTMP 在白酒發(fā)酵過(guò)程中的生成方式普遍認(rèn)為有兩種路徑：葡萄糖和氨基酸在高溫作用下通過(guò)美拉德反應(yīng)生成；微生物引發(fā)糖降解產(chǎn)生丙酮酸，兩分子的丙酮酸縮合生成α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸脫羧產(chǎn)生乙偶姻，發(fā)酵體系中的乙偶姻和氨基酸在相關(guān)酶的催化作用下生成TTMP[8，10]。隨著研究的深入，通過(guò)第二種路徑生成TTMP的結(jié)論被不斷證實(shí)。

吳建峰[6]于2013 年發(fā)現(xiàn)并證明在固態(tài)發(fā)酵條件下，功能菌株枯草芽孢桿菌S12 代謝產(chǎn)生3-羥基丁酮（又名：乙偶姻），同時(shí)S12 分泌蛋白酶將蛋白質(zhì)降解為氨基酸，氨基酸脫氫得到氨，3-羥基丁酮和氨通過(guò)縮合作用合成TTMP，且高溫有利于此縮合反應(yīng)的發(fā)生。

張溫清[9]基于功能菌株強(qiáng)化接種與TTMP 產(chǎn)生情況，證實(shí)糟醅中TTMP 含量與溫度和功能菌株豐度呈正相關(guān)，釀酒過(guò)程中TTMP 是由釀造微生物通過(guò)生物途徑代謝產(chǎn)生，并且高溫對(duì)其形成有促進(jìn)作用，進(jìn)一步證實(shí)固態(tài)發(fā)酵條件下的TTMP 生成方式并非傳統(tǒng)認(rèn)為的美拉德反應(yīng)，而是生物反應(yīng)。

侯孝元[11]總結(jié)了前人對(duì)于TTMP 的合成路徑研究經(jīng)驗(yàn)，總結(jié)出提高微生物發(fā)酵生成TTMP 的兩種方法：一是獲得優(yōu)良菌株，提高前體乙偶姻的積累量；二是向發(fā)酵液中添加銨鹽提高乙偶姻轉(zhuǎn)化率和四甲基吡嗪的產(chǎn)率。

綜上所述，TTMP 的生物代謝途徑為通過(guò)性能優(yōu)良菌株獲得TTMP的前體物質(zhì)3-羥基丁酮，3-羥基丁酮與氨在高溫作用下發(fā)生縮合反應(yīng)生成TTMP，氨的來(lái)源包括外部環(huán)境添加、底物中蛋白質(zhì)降解脫氫等。

1.1.2 TTMP的重要產(chǎn)生環(huán)節(jié)

白酒釀造過(guò)程涉及制曲、發(fā)酵、蒸餾等多個(gè)環(huán)節(jié)，不同企業(yè)在發(fā)展過(guò)程中摸索形成了自身獨(dú)具特色的釀造工藝，加之地域差異導(dǎo)致的菌群差異，從而形成國(guó)內(nèi)十二大白酒香型?；谀壳暗难芯繄?bào)道，醬香型和芝麻香型白酒中吡嗪類物質(zhì)的含量相較于其他香型白酒是最高的，與其生產(chǎn)工藝密切相關(guān)[12]。醬香型白酒和芝麻香型白酒釀造工藝都具有高氮原料、高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵以及高溫餾酒的特點(diǎn)。這與上述吳建峰與張溫清提出的高溫對(duì)TTMP 形成有促進(jìn)作用的結(jié)論相印證。同時(shí)二位學(xué)者以芝麻香型白酒酒曲、酒醅和基酒等為研究對(duì)象，對(duì)TTMP 的積累環(huán)節(jié)進(jìn)一步驗(yàn)證，得到多糧曲高于小麥純糧曲，高溫曲（頂溫近67 ℃）高于中溫曲（頂溫50～55 ℃），細(xì)菌曲高于真菌曲的結(jié)論，吡嗪類物質(zhì)在堆積后含量增加，高溫發(fā)酵和高溫蒸餾也有利于TTMP 形成，原酒儲(chǔ)存中不產(chǎn)生TTMP[6，9]。

圖1 基于酶與熱力學(xué)耦連的TTMP合成路徑圖

相較小麥純糧曲，多糧曲中增加了高含蛋白的豌豆、大麥等原料，為TTMP 的形成提供了更多必要的氮類前體物質(zhì)。高產(chǎn)TTMP 前體物質(zhì)3-羥基丁酮的優(yōu)良菌株主要為細(xì)菌而非真菌，高溫是縮合反應(yīng)生成TTMP 的必要條件。TTMP 在釀酒過(guò)程中的重要產(chǎn)生環(huán)節(jié)包括高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵等。

1.2 TTMP功能菌株分離、篩選及強(qiáng)化應(yīng)用

1.2.1 功能菌株的分離與篩選

與上述TTMP 的主要產(chǎn)生環(huán)節(jié)相關(guān)聯(lián)，野生型功能菌株的主要來(lái)源為高溫大曲和高溫堆積料等，已報(bào)道的功能菌株主要集中在芽孢桿菌屬（Bacillus），包括枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）等，也與上述細(xì)菌曲高于真菌曲的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相印證[6，9]。功能菌株的分離多依賴傳統(tǒng)培養(yǎng)方式，以基于感官評(píng)價(jià)的產(chǎn)醬香能力[13]或基于生化反應(yīng)（V-P 實(shí)驗(yàn)）的產(chǎn)乙偶姻（TTMP 前體物質(zhì)）能力作為篩選指標(biāo)[14]，也有學(xué)者將產(chǎn)蛋白酶能力與產(chǎn)乙偶姻能力作為雙篩指標(biāo)[9]，以獲得功能菌株。V-P 實(shí)驗(yàn)基本原理為乙偶姻在強(qiáng)堿環(huán)境下，氧化為雙乙酰，雙乙酰與胍基反應(yīng)生成紅色化合物，甲萘酚的存在可以促進(jìn)并加速紅色物質(zhì)生成，于500～600 nm 范圍內(nèi)有光吸收，吸光度在一定范圍內(nèi)與乙偶姻濃度呈正相關(guān)，基于此原理，學(xué)者們開(kāi)發(fā)了平板篩選、高通量篩選等方法。

野生型菌株生產(chǎn)TTMP 產(chǎn)量低的問(wèn)題普遍存在，學(xué)者們采用誘變育種、基因工程等手段對(duì)產(chǎn)TTMP菌株進(jìn)行改造與調(diào)控，以期獲得高產(chǎn)菌株。許平等[15]采用亞甲基胍誘變方式對(duì)出發(fā)菌株做誘變篩選，以期提高誘變菌株產(chǎn)TTMP 能力；郭維偉[16]對(duì)從景芝芝麻香白酒高溫大曲中分離的野生地衣芽孢桿菌進(jìn)行等離子誘變，篩選獲得高產(chǎn)突變株，發(fā)酵液產(chǎn)量達(dá)到20.24 g/L，比原始菌株提高了72.67%，遺傳性狀穩(wěn)定；黃曉潤(rùn)[17]對(duì)枯草芽孢桿菌產(chǎn)醬香相關(guān)基因進(jìn)行篩選與功能研究，鎖定得出3個(gè)產(chǎn)醬香候選基因cdo A（半胱氨酸雙加氧酶）、pan E（酮泛解酸還原酶）、lsp A（脂蛋白信號(hào)肽酶Ⅱ），并證實(shí)3 個(gè)基因最終作用于丙酮酸途徑，從而影響四甲基吡嗪合成；Wu 等[18]通過(guò)敲除枯草芽孢桿菌BS2 中的bdh A（2,3-丁二醇脫氫酶）基因，增加乙偶姻的積累從而增加發(fā)酵終產(chǎn)物中的TTMP產(chǎn)量，為從基因?qū)用鎸?shí)現(xiàn)產(chǎn)物表達(dá)調(diào)控提出了研究思路。

圖2 V-P實(shí)驗(yàn)反應(yīng)

1.2.2 功能菌株的強(qiáng)化應(yīng)用

白酒釀造過(guò)程中功能菌株的強(qiáng)化應(yīng)用場(chǎng)景多發(fā)生于TTMP 的主要產(chǎn)生環(huán)節(jié)，包括制曲、堆積和發(fā)酵等。

1.2.2.1 強(qiáng)化制曲

強(qiáng)化制曲分為強(qiáng)化麩曲與強(qiáng)化大曲兩個(gè)工藝方向，強(qiáng)化麩曲的研究與應(yīng)用最為多見(jiàn)。強(qiáng)化麩曲的應(yīng)用場(chǎng)景之一是在傳統(tǒng)釀造工藝的基礎(chǔ)上，引入強(qiáng)化麩曲或改良麩曲以實(shí)現(xiàn)酒體風(fēng)味的改變與提升，如張溫清[9]對(duì)芝麻香麩曲原料配比、酸堿度、含水量和接種量等因素進(jìn)行工藝優(yōu)化，獲得的功能麩曲中TTMP 含量達(dá)607.58 mg/kg，以丟糟作為功能麩曲原料之一進(jìn)一步優(yōu)化制備工藝，TTMP 產(chǎn)量達(dá)1.28×103mg/kg，為目前報(bào)道的最高水平；葛向陽(yáng)等[19]將接有功能菌株的大曲應(yīng)用到釀造環(huán)節(jié)以探索濃香型白酒高產(chǎn)TTMP 的釀造工藝，結(jié)果表明，60%的功能曲與40%的大曲結(jié)合可以使?jié)庀阈驮芓TMP 含量提高到3～6 mg/L，是原始工藝的5～20 倍；李曉霞[20]從汾酒大曲中分離獲得高產(chǎn)TTMP菌株，制備成固態(tài)菌劑后，在不干擾正常的釀酒生產(chǎn)下，以1 %添加量同大曲一并加至酒醅中，進(jìn)行入缸發(fā)酵，結(jié)果表明TTMP 含量增加到5.3 μg/mL，為對(duì)照組的3倍。

1.2.2.2 強(qiáng)化發(fā)酵

強(qiáng)化發(fā)酵包括強(qiáng)化堆積發(fā)酵與強(qiáng)化入池發(fā)酵兩個(gè)方向。王西等[21]將從高溫大曲中篩選得到的枯草芽孢桿菌分別接種到醬香型二次酒高溫堆積前和入池前的糟醅中，模擬醬香型白酒生產(chǎn)完成堆積與入池發(fā)酵過(guò)程，“堆積組”發(fā)酵后的TTMP 含量是“空白組”的3.08 倍，“入池組”發(fā)酵后的TTMP 含量是“空白組”的2倍。王曉丹等[22]將從高溫大曲中分離得到的地衣芽孢桿菌添加到粹沙酒窖池中層的糟醅中，發(fā)酵后TTMP含量是對(duì)照組的3.03倍。

1.2.2.3 多環(huán)節(jié)強(qiáng)化工藝結(jié)合

除上述單一強(qiáng)化手段外，學(xué)者們也將功能菌株強(qiáng)化應(yīng)用于白酒釀造的多個(gè)環(huán)節(jié)中，或在原有工藝基礎(chǔ)上改良多個(gè)環(huán)節(jié)。艾金鐘等[23]在紅星二鍋頭原有工藝基礎(chǔ)上，增加高溫堆積環(huán)節(jié)，將蛋白酶活性較高的芽孢桿菌制備為功能麩曲，聯(lián)合高溫大曲共同用于堆積發(fā)酵，在原酒風(fēng)格基本不變的情況下，TTMP 含量由原工藝的0.03 mg/L 提高至約10 mg/L；馬美榮等[24]從北京紅星（清香型）大曲中分離獲得高產(chǎn)TTMP 芽孢桿菌用于麩曲制作，結(jié)合高溫堆積發(fā)酵過(guò)程用于清香型白酒生產(chǎn)，原酒風(fēng)格整體不變，TTMP 含量由傳統(tǒng)工藝的0.11 mg/L 提升至10 mg/L 以上；盧君[25]將功能菌株制備為固體菌劑，分別通過(guò)在入池發(fā)酵前進(jìn)行強(qiáng)化接種、將菌劑加入尾酒中用于酒糟串蒸以及將上述兩種方法相結(jié)合的方式進(jìn)行工藝優(yōu)化，醬香型白酒基酒中TTMP 的含量分別提高160.71%、85.75%和202.75%。

盡管功能菌株的強(qiáng)化應(yīng)用研究如火如荼，但大家的關(guān)注點(diǎn)普遍在于基酒中四甲基吡嗪含量的變化，對(duì)于強(qiáng)化應(yīng)用后整體酒質(zhì)風(fēng)味、風(fēng)格的改變，發(fā)酵過(guò)程中強(qiáng)化菌株對(duì)于原始菌群的擾動(dòng)情況并未做深入分析，行業(yè)也暫無(wú)實(shí)際強(qiáng)化應(yīng)用的案例，可見(jiàn)對(duì)于功能菌株的應(yīng)用仍需建立在對(duì)發(fā)酵機(jī)理研究更為透徹的基礎(chǔ)之上。

2 TTMP的檢測(cè)

2016 年國(guó)家發(fā)布了GB 1886.295—2016《食品添加劑2,3,5,6-四甲基吡嗪》，該方法適用于由2,3-丁二胺和丁二酮，或者由乙偶姻和銨鹽制備而得的食品添加劑TTMP，此國(guó)標(biāo)方法的檢測(cè)對(duì)象為高純度TTMP。白酒在釀造過(guò)程中發(fā)酵底物復(fù)雜，狀態(tài)多樣，代謝化合物種類繁多，TTMP 作為白酒中的微量組分，對(duì)檢測(cè)方法的適用性和準(zhǔn)確度提出挑戰(zhàn)。目前，白酒中TTMP 的分析步驟涉及萃取和檢測(cè)過(guò)程。

2.1 萃取方法

白酒過(guò)程樣品及成品酒樣中TTMP 的常見(jiàn)萃取方法包括液液萃取（LLE）、固相萃取（SPE）、液液微萃?。↙LME）、固相微萃?。⊿PME）和頂空固相微萃取（HS-SPME）等[26]，不同提取方法有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

在此基礎(chǔ)上學(xué)者們也對(duì)提取方法做了進(jìn)一步優(yōu)化，如孫嘯濤等[26]建立了渦旋輔助液液微萃取技術(shù)，使待測(cè)化合物在樣品溶液及萃取劑之間1 min達(dá)到萃取平衡，具有高效、快速和低溶劑消耗的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了快速萃取技術(shù)的開(kāi)發(fā)。

2.2 檢測(cè)方法

早期學(xué)者多使用液相色譜法（LC）[35-36]和氣相色譜法（GC）[34，37]完成白酒過(guò)程樣品及成品樣品中TTMP 的檢測(cè)，上述檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，精密度較高，對(duì)白酒廠的儀器設(shè)備條件要求不高，便于推廣。隨著檢測(cè)技術(shù)的提升與各種高端質(zhì)譜的引進(jìn)，氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）與液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）在白酒行業(yè)興起，質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)極大提高了檢測(cè)準(zhǔn)確度，降低了目標(biāo)物檢出的限量值。司冠儒等[38]基于芝麻香型白酒樣品對(duì)氣相色譜法、液相色譜法和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法的重復(fù)性和精確度進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)上述技術(shù)均可以滿足白酒廠日常檢測(cè)分析的要求?；谌粘z測(cè)經(jīng)驗(yàn)，針對(duì)大曲、糟醅等TTMP 含量較低的復(fù)雜基質(zhì)，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢出限更低，靈敏度更高，為后續(xù)學(xué)者開(kāi)展檢測(cè)工作提供參考。

黃杰等[39]建立了白酒中TTMP 的氣相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜（GC-QQQ）測(cè)定法，該法樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，分離度高，測(cè)定低限0.2 mg/L，為定量測(cè)定白酒中TTMP 提供了一種有益探索；Zhu 等[40]使用全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（GC×GC-TOFMS）技術(shù)對(duì)茅臺(tái)中的重要風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性與定量識(shí)別，有效識(shí)別出含氮類物質(zhì)19 種，包括TTMP；王柏文等[28]應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）與氣相色譜-氮磷檢測(cè)器（GC-NPD）技術(shù)對(duì)國(guó)井芝麻香型白酒中含氮化合物進(jìn)行分析，含氮化合物專用檢測(cè)器相較傳統(tǒng)質(zhì)譜檢測(cè)器靈敏度更高，提高了白酒中含氮化合物檢測(cè)的精度。

表1 TTMP的常見(jiàn)萃取方法

3 結(jié)語(yǔ)

隨著國(guó)民生活水平的顯著提高，我國(guó)已經(jīng)進(jìn)入了消費(fèi)者對(duì)美酒追求的時(shí)代，但白酒行業(yè)整體產(chǎn)能過(guò)剩，優(yōu)質(zhì)酒產(chǎn)能不足，成為優(yōu)質(zhì)白酒在消費(fèi)市場(chǎng)供應(yīng)的關(guān)鍵矛盾點(diǎn)，因此白酒產(chǎn)品勢(shì)必要向“風(fēng)味與品質(zhì)”雙導(dǎo)向轉(zhuǎn)變。

白酒中TTMP 的相關(guān)研究已經(jīng)持續(xù)數(shù)十年，隨著健康因子概念的提出，更是成為行業(yè)研究熱點(diǎn)。但目前仍存在一些問(wèn)題有待探討，如高產(chǎn)TTMP 菌株的強(qiáng)化接種操作對(duì)整個(gè)白酒釀造體系中繁雜的菌系、酶系和物系存在更多積極或消極的影響還未知，功能菌劑的實(shí)際應(yīng)用仍屬于起步階段，TTMP在白酒領(lǐng)域的檢測(cè)方法仍沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)等。

白酒中微量成分多種多樣，健康因子種類眾多，除文中提到的TTMP，還包括萜烯類、多元醇和生物活性肽等[3]，對(duì)于白酒中功能成分的研究將有助于消費(fèi)者正確認(rèn)識(shí)白酒，樹(shù)立白酒正確的消費(fèi)觀和價(jià)值觀，真正實(shí)現(xiàn)“少喝酒，喝好酒”，“理性飲酒，健康消費(fèi)”。