凌 荔，方尚玲，牟飛燕，董孝元，陳茂彬，李 良

（1.湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北武漢 430068；2.黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北武漢 430068）

白酒作為中國古老且具有特色的酒類之一而聞名于世界，是以糧食谷物為原料，以大曲、小曲或麩曲及酒母等為糖化發(fā)酵劑，經蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾而制成的蒸餾酒。中國白酒可以分為清香型白酒、濃香型白酒、醬香型白酒和米香型白酒4 個基本香型，在此基礎上出現了芝麻香型、鳳香型、兼香型、馫香型等多種衍生香型白酒。清香型白酒所用的酒曲為中低溫酒曲，是以大麥與豌豆為主要原料，制曲溫度為45～50 ℃，適合各類微生物生長繁殖，許多微生物的發(fā)酵代謝產物酸類、醛類、酯類等影響酒質及風味。

酒曲的分析一直在進步，對于酒曲微生物組成不再局限于傳統篩選分離，近年來高通量測序技術（HTS）作為新一代測序方法可以一次性對幾百萬到十幾億的DNA 分子進行分析和測序，對復雜菌種樣品進行深度測序，其通量高、成本低、準確率高。雷振河[1]應用高通量測序技術對清香型白酒釀造用的大曲和酒醅進行分析，大曲中的優(yōu)勢原核微生物有厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、酸桿菌門，優(yōu)勢真核微生物有曲霉菌屬、熱子囊菌屬、根霉菌屬、嗜熱真菌屬、假絲酵母；羅愛國等[2]利用高通量測序技術對清香型白酒酒糟中微生物進行研究，從門與屬水平分別找出了細菌和真菌的優(yōu)勢菌屬。

大曲中的微生物群受制曲自然環(huán)境條件影響很大，南北方清香型白酒大曲由于氣候、溫度、濕度等的差別，為清香型白酒大曲帶來了特殊的微生物群，進而有不同的發(fā)酵代謝產物，使南北方清香型白酒在風味上有很大差別。本研究分析了清香白酒大曲中的特色微生物，對發(fā)酵過程中的各類功能菌進行深入挖掘，旨在為后續(xù)優(yōu)質清香型白酒大曲復配提供一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：清香白酒型大曲，采自湖北某酒廠與山西某酒廠；中高溫及高溫大曲，采自湖北某酒廠。本實驗用曲均為成品曲。

試劑及耗材：FastDNA? Spin Kit for Soil（DNA 抽提試劑盒）；NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit（建庫試劑盒）；MiSeq Reagent Kit（測序試劑盒）。

儀器設備：高速臺式冷凍離心機，德國，Eppendorf 公司；超微量分光光度計，美國，Thermo Fisher Scientific 公司；酶標儀，美國，Biotek 公司；粉碎研磨儀，中國，上海萬柏生物科技有限公司；微型熒光計，美國，Promega 公司；電泳儀，中國，北京市六一儀器廠；PCR儀，美國，ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理及標記

將全國各酒廠收集用于實際釀酒的成品曲塊用粉碎機粉碎成小塊，湖北清香曲標記為QX1，山西清香曲標記為QX2，中高溫曲標記為ZGW，高溫曲標記為GW，每個樣品取3 個重復，放入-80 ℃超低溫冰箱中保藏以待用。

1.2.2 檢測分析

用FastDNA? Spin Kit for Soil 試劑盒提取總DNA，使用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，進行PCR 產物純化、鑒定及定量，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，進行ITS1區(qū)、16S rDNA高通量測序。利用Illumina 公 司 的Miseq PE300/NovaSeq PE250 平 臺進行測序，使用fastp[3]（https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0）軟件對原始測序序列進行質控，使 用FLASH[4]（http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.7）軟件進行拼接。

2 結果與分析

2.1 不同溫度大曲微生物多樣性

2.1.1 細菌多樣性分析

使用UPARSE 軟件[5]（http://drive5.com/uparse/，version 7.1），根據97 %[5-6]的相似度對序列進行OTU 聚類，選出與OTU 代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。

經分析清香型大曲樣品共得到60718 條有效序列，通過聚類得到236 個OTU；中高溫大曲樣品共得到75628 條有效序列，通過聚類得到181 個OTU；高溫大曲樣品共得到57719 條有效序列，通過聚類得到120 個OTU。物種分布如圖1 不同溫度大曲樣細菌Venn圖所示。由圖1可知，清香型大曲樣品特有OTU 為171 個，中高溫大曲樣品特有OTU 為84 個，高溫大曲樣品特有OTU 為38 個，共有OTU 為40 個。根據兩不同大曲樣品共有OTU數量比較可知中高溫大曲與高溫大曲相近程度更高。

圖1 不同溫度大曲樣細菌Venn圖

Alpha 多樣性是指一個特定區(qū)域或生態(tài)系統內的多樣性，是反映豐富度和均勻度的綜合指標。群落豐富度（Community richness）的指數主要包括Chao 指數和ACE 指數。Chao 指數在生態(tài)學中常用來估計物種總數，指數越大，表明群落的豐富度越高；ACE 指數是用來估計群落中含有OTU 數目的指數群落多樣性，ACE 指數越大，表明群落的豐富度越高。群落多樣性（Community diversity）的指數包括Shannon 指數和Simpson 指數。Shannon 指數表示群落的豐富度和均勻度，Shannon 指數值越高，表明群落的多樣性越高；Simpson指數用來估算樣品中微生物的多樣性，Simpson 指數值越大，說明群落多樣性越低。還有測序深度指數Observed spieces 代表OTUs 的直觀數量統計,coverage 指數表示計算加入豐度為1 的OTUs 數目，加入低豐度影響。不同溫度大曲細菌Alpha 多樣性結果見表1。由表1 可知，清香型大曲細菌物種多樣性和物種豐富度均為最高，其次是中高溫大曲，高溫大曲相對來說最低。

表1 不同溫度大曲樣細菌Alpha多樣性指數表

2.1.2 細菌群落結構差異性分析

在門水平上分析不同溫度大曲樣品細菌群落結構差異，在圖2 微生物群落柱形圖中，將排前23的菌門進行對比，其余歸于others。由圖2(a)可知，清香型白酒大曲的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)與變形菌門(Proteobacteria)，中高溫大曲的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(Firmicutes)，放線菌門(Actinobacteriota)較清香型白酒大曲多，高溫大曲的優(yōu)勢菌門為放線菌門(Actinobacteriota) 。這與大曲制作工藝溫度有關，隨著制曲溫度升高，桿菌數量明顯減少，高溫放線菌占據優(yōu)勢，發(fā)酵產生吡嗪類物質、酚類物質等，使醬香型大曲有豆豉味、焦香味等特殊風味。

在屬水平上分析不同溫度大曲樣品細菌群落結構差異，共鑒定出50 個屬類細菌。Heatmap（熱圖）可以用顏色變化反映二維矩陣或表格中的數據信息，可將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過顏色梯度及相似程度反映多個樣品在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。曲樣heatmap（熱圖）如圖2(b)所示，紅色色塊越深表示該屬類細菌數量越多，藍色則相反。由圖2 可知，清香型白酒大曲微生物群落豐富度明顯高于中高溫大曲和高溫大曲，根據微生物群落多樣性聚類分析，清香型白酒大曲與中高溫大曲相似度更高。清香型白酒大曲以芽孢桿菌屬（Bacillus)為優(yōu)勢菌群，其次以魏斯氏菌屬（Weissella)、片球菌屬（Pediococcus)及其他乳酸菌（Lactobacillus)為主要菌群；中高溫大曲以魏斯氏菌屬（Weissella)為優(yōu)勢菌群，其次以葡萄球菌(Staphylococcus)、其他乳酸菌（Lactobacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)為主要菌群；高溫大曲以糖多胞菌屬(Saccharopolyspora)為優(yōu)勢菌群，其次以假諾卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)、高溫放線菌屬(Kroppenstedtia)、葡萄球菌(Staphylococcus)為主要菌群。

圖2 不同香型大曲樣細菌群落分析圖

在傳統制曲過程中，由于生產工藝、生產條件的不同，大曲中微生物菌群有很大不同。溫度在30 ℃左右，適合大部分中溫微生物生長，制曲溫度達到55～60 ℃時，大部分無芽孢菌類被淘汰，此時的細菌以芽孢桿菌類如地衣型芽孢桿菌、嗜熱芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等與糖高溫放線菌、雙棲高溫放線菌等高溫放線菌構成主要的微生物群。大曲在制曲過程中都會有微生物群落變化，與環(huán)境、水分、溫度、pH值等因素息息相關。

2.1.3 真菌多樣性分析

對所有樣品進行有效序列97%的一致性OTU聚類分析，ITS1區(qū)高通量測序結果經過濾和有效拼接后，清香型大曲樣品共得到60718 條有效序列，聚類得到30 個OTU，中高溫大曲樣品共得到75628條有效序列，聚類得到69 個OTU，高溫大曲樣品共得到57719條有效序列，聚類得到29個OTU。物種分布如圖3 所示。由圖3 可知，清香型大曲樣品特有OTU 為15 個，中高溫大曲樣品特有OTU 為39個，高溫大曲樣品特有OTU 為5 個，共有OTU 為9個。從兩不同大曲樣品共有OTU 數量比較可知中高溫大曲與高溫大曲相近程度更高。根據表2 真菌Alpha 多樣性指數表可看出清香型白酒大曲的真菌群落多樣性最高，中高溫大曲的真菌群落豐富度最高。

圖3 不同香型大曲樣真菌Venn圖

表2 不同香型大曲樣真菌Alpha多樣性指數表

2.1.4 真菌群落結構差異性分析

在綱水平上分析不同溫度大曲樣品真菌群落結構差異，Circos 圖中可反映每個（或組）樣本中優(yōu)勢物種分布比例，以及各優(yōu)勢物種在不同樣本（分組）中分布比例。小半圓（左半圈）表示樣本中物種組成情況，外層彩帶的顏色代表分組來源，內層彩帶的顏色代表物種，長度代表該物種在對應樣本中的相對豐度；大半圓（右半圈）表示該分類學水平下物種在不同樣本中的分布比例情況，外層彩帶代表物種，內層彩帶顏色代表不同分組，長度代表該樣本在某一物種中的分布比例。由圖4(a)可知，高溫大曲與中高溫大曲的優(yōu)勢菌種為散囊菌綱（Eurotiomycetes），清香型白酒大曲的優(yōu)勢菌種為酵母綱（Saccharomycetes），中高溫大曲僅占約15 %酵母綱。

圖4 不同香型大曲樣真菌群落分析圖

在屬水平上分析不同溫度大曲樣品真菌群落結構差異，由圖4(b)可知，中高溫大曲與高溫大曲的優(yōu)勢菌種均為嗜熱霉菌屬(Thermomyces)，中高溫大曲中曲霉屬(Aspergillus)也為主要菌群，清香型白酒大曲的優(yōu)勢菌種為覆膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)，群落多樣性明顯高于中高溫大曲和高溫大曲。清香型白酒大曲中酵母包括覆膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)、伊薩酵母屬(Issatchenkia)、異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces)等。酵母在生產中起到產酯、生香、發(fā)酵的作用，根據制曲頂溫的控制要求，培菌溫度越低，酵母數量越多。

2.2 南北方清香型白酒大曲微生物多樣性

2.2.1 細菌多樣性分析

對所有樣品進行有效序列97%的一致性OTU聚類分析，16s rRNA V4 區(qū)高通量測序結果經過濾和有效拼接后，南方清香型大曲樣品共得到60718條有效序列，聚類得到236 個OTU，北方清香型大曲樣品共得到48612 條有效序列，聚類得到326 個OTU。物種分布如圖5 所示，南方清香型大曲樣品特有OTU 為112 個，北方清香型大曲樣品特有OTU 為202 個，共有的OTU 為124 個。由表3 南北方清香型白酒大曲樣細菌Alpha 多樣性指數表可知，QX1 較QX2 細菌群落豐富度低，群落多樣性高。

圖5 南北方清香型白酒大曲樣細菌Venn圖

表3 南北方清香型白酒大曲樣細菌Alpha多樣性指數表

2.2.2 細菌群落結構差異性分析

在屬水平上分析南北方清香型白酒大曲樣品細菌群落結構差異，圖6(a)中明顯顏色對比可驗證QX1 中群落均勻度高于QX2，但群落豐富度低；由圖6(b)可知，QX1 與QX2 的優(yōu)勢菌種均為芽孢桿菌屬，QX1 中乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、片球菌屬(Pediococcus)等乳酸菌較QX2更豐富，QX1 中的高溫放線菌屬(Kroppenstedtia)也明顯占比較大。

圖6 南北方清香型白酒大曲細菌分析圖

周森等[7]通過對比11 種清香型白酒大曲微生物的組成，結果顯示不同大曲細菌優(yōu)勢菌群為乳酸菌或芽孢桿菌且無規(guī)律性。乳酸菌屬于非芽孢桿菌，乳酸與酒精酯化后生成乳酸乙酯，具有獨特香味，但過量會使酒體呈現澀味，并使曲塊生化能力下降，曲坯酸敗。乳酸菌可將己糖轉化為乳糖、酒精和CO2，也可將果糖發(fā)酵成甘露醇，但有些乳酸菌分解成丁酸，會導致酒臭。大曲中乳酸菌的產生是在制曲高溫轉化時，乳酸菌作用于己糖同化成乳酸，當頂點品溫不足，熱曲時間不足時，乳酸菌會大量生成。清香型白酒大曲中乳酸菌與芽孢桿菌占比對成品酒質量高低影響很大。

2.2.3 真菌多樣性分析

對所有樣品進行有效序列97%的一致性OTU聚類分析，ITS1區(qū)高通量測序結果經過濾和有效拼接后，南方大曲樣品共得到60718 條有效序列，聚類得到30個OTU，北方大曲樣品共得到48612條有效序列，聚類得到56 個OTU。根據圖7 南北方大曲樣真菌Venn 圖可知南方清香型大曲樣品特有OTU 為13 個，北方清香型大曲樣品特有OTU 為39個，共有的OTU 為17 個。由表4 南北方清香型白酒大曲樣真菌Alpha 多樣性指數表可知QX2 真菌群落豐富度與多樣性均大于QX1。

表4 南北方清香型白酒大曲樣真菌Alpha多樣性指數表

圖7 南北方清香型白酒大曲樣真菌Venn圖

2.2.4 真菌群落結構差異性分析

由圖8 可知，在屬水平上分析南北方清香型白酒大曲樣品真菌群落結構差異，QX1 與QX2 的優(yōu)勢菌種均為酵母屬，QX2 群落豐富度高于QX1，但南方清香型白酒大曲中酵母屬除了優(yōu)勢菌種覆膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)外，還包括彎曲假絲酵母(Apiotrichum)、伊薩酵母屬(Issatchenkia)、異常威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces)等，霉菌中曲霉屬(Aspergillus)占比最多；北方清香型白酒大曲中酵母屬主要包括覆膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)和彎曲假絲酵母(Apiotrichum)，霉菌種類較QX1 多，包括曲霉屬(Aspergillus)、被孢霉屬(Mortierella)、枝孢屬(Cladosporium)、赤霉菌屬(Gibberella)等。

圖8 南北方清香型白酒大曲樣品真菌柱形圖(屬水平)

南北方清香型大曲高通量測序結果表明南方清香型白酒大曲細菌群落豐富度高于北方清香型白酒大曲，真菌群落豐富度則相反。氣候條件是影響物種豐富度的重要因素，南方空氣濕潤，有利于微生物繁殖活動，北方地形復雜、起伏大，生物種類豐富。真菌的細胞大小通常比原核生物大，一些真菌甚至可以形成多細胞結構并附著在環(huán)境介質上，導致真菌的傳播能力通常弱于原核生物，但真菌對環(huán)境變化的適應性和抵抗力通常比原核生物強，因此北方清香型白酒大曲中真菌群落豐富度高于南方清香型白酒大曲。

2.3 南北方清香型白酒酒質分析

對南北方清香型白酒進行氣質分析，對風味物質成分進行GC-MS 分離定性分析，由于色譜柱填料主要成分為硅氧烷，剔除檢測結果中含有硅氧烷成分的物質以及匹配度小于70 的物質后，南方清香型白酒共鑒定出52 種揮發(fā)性風味物質，包括酸類物質3 種，醇類物質6 種，酯類物質24 種，醛類物質3 種，芳香族化合物7 種，酚類4 種，其他物質5種；北方清香型白酒共鑒定出49 種揮發(fā)性風味物質，包括酸類物質3 種，醇類物質8 種，酯類物質17種，醛類物質2 種，芳香族化合物9 種，酚類2 種，其他物質3 種。白酒中主要風味呈現物質結果見表5，南方清香型白酒中酯類相對含量最高的是乙酸乙酯，有蘋果和香蕉的生果香氣，較北方清香型白酒高約0.25 g/L，能促進酒體放香呈味，清香型白酒中另一個主體香味成分乳酸乙酯，與北方清香型白酒相差無幾，適當時使酒體微帶甜香，味醇、稠密、凈，含量過高則會有生澀感，起到壓香的反作用；醇類中異戊醇較北方清香型白酒低約0.27 g/L，作為白酒中典型的高級醇，適量可為白酒增大香度，濃甜順口，過量則使酒刺激感變大，甚至帶有澀臭；正丙醇較北方清香型白酒高約0.14 g/L，似酒精氣味，香氣清雅，在白酒中沒有苦澀的氣味，有濃厚陳釀風味，南方清香型白酒中特有的濃陳味，使酒體多了一絲厚重。

表5 南北清香型白酒風味組成分析（g/L）

清香型白酒特點為清香醇正，入口綿甜，尾凈，酒體協調。在酒體酯類化合物中乙酸乙酯和乳酸乙酯是人們長久以來關注的重點，由上述結果可知，南方清香型白酒的乙酸乙酯∶乳酸乙酯約為1∶0.84；北方清香型白酒的乙酸乙酯∶乳酸乙酯約為1∶0.83。南北方清香型白酒酒質分析結果表明，乳酸菌的種群數量對酒體風味影響較大，過多會在后續(xù)酯化過程中生成乳酸乙酯，使酒體變得酸澀，不協調。各類呈香物質豐富則使南方清香型白酒酒體風味富有層次感，在清甜爽口中增添了陳釀的濃厚感，但目前由于微生物代謝途徑復雜且存在彼此之間的相互作用，與風味物質組成或形成機制的相關性有待后續(xù)深入研究。

3 結論

本研究通過高通量測序分別對不同溫度大曲與南北方清香型白酒大曲做了分析，結果表明，清香型大曲細菌物種多樣性和物種豐富度較中高溫曲和高溫曲高，芽孢桿菌（Bacillus)為優(yōu)勢菌群，魏斯氏菌屬（Weissella)、片球菌屬（Pediococcus)及其他乳酸菌（Lactobacillus)為主要菌群；清香型白酒大曲的真菌群落多樣性最高，中高溫大曲的真菌群落豐富度最高，優(yōu)勢菌種為覆膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)，其次是伊薩酵母屬(Issatchenkia)、異常威克漢姆酵母(Wickerhamomyces)等酵母屬。

結果表明，南方清香型白酒大曲較北方清香型白酒大曲細菌群落豐富度低，群落多樣性高；南方清香型白酒大曲與北方清香型白酒大曲的優(yōu)勢菌種均為芽孢桿菌屬，其次為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)、片球菌屬(Pediococcus)等乳酸菌屬；南方清香型白酒大曲真菌群落豐富度與多樣性均低于北方清香型白酒大曲，南方清香型白酒大曲中酵母屬除了優(yōu)勢菌種覆膜孢酵母屬(Saccharomycopsis)外，還包括彎曲假絲酵母(Apiot-richum)、伊薩酵母屬(Issatchenkia)、異常威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces)等其他酵母屬。

以上研究系統了解了各類大曲及不同地域清香型白酒大曲在微生物群落上的相同及差異，對于曲樣高通量測序結果的應用還需結合傳統微生物研究進一步分析，包括部分不可培養(yǎng)分離微生物，現實應用具有一定難度，但具有一定的理論指導意義。