劉 宇，萬自然，徐希望，焦祥啟，房 玲，李 濤，郭 壯

（1.山東蘭陵美酒股份有限公司，山東臨沂 277731；2.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北襄陽 441053）

“曲乃酒之骨”，充分說明了大曲在白酒釀造中的重要性[1]。大曲是一種富含多酶多菌的微生物發(fā)酵劑，具有“糖化、發(fā)酵、生香”等功能，釀酒先輩們從釀酒實(shí)踐中總結(jié)出了“有好酒必有好曲”的精辟論斷，充分說明大曲是傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵大曲酒的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，對白酒的香型、風(fēng)格特點(diǎn)具有不可或缺的作用[2-3]。復(fù)雜開放的制曲工藝，使得大曲可以網(wǎng)羅到自然界中豐富多樣的微生物，最終經(jīng)過群落演替定向富集了獨(dú)具特色的種群結(jié)構(gòu)。制曲過程中，微生物產(chǎn)生了多種生物酶和代謝產(chǎn)物，這些都對大曲品質(zhì)起著決定性的作用，進(jìn)而影響到白酒的感官風(fēng)味。

小麥?zhǔn)侵魄闹饕?，品種的優(yōu)劣直接影響著大曲質(zhì)量的好壞，硬質(zhì)麥潤料后制曲感官和理化質(zhì)量比不過軟質(zhì)麥大曲[4]。一般地，根據(jù)制曲過程中對品溫控制的不同，大曲可分為低溫曲、中溫曲和高溫曲，主要包括醬香型大曲、濃香型大曲和清香型大曲[5]。目前，濃香型大曲酒占據(jù)著白酒70%的市場份額，為當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)的發(fā)展做出了重要貢獻(xiàn)[6]。蘭陵濃香型白酒采用中偏高溫曲進(jìn)行釀造，制曲品溫較醬香型大曲略低。本試驗(yàn)對軟質(zhì)麥大曲和硬質(zhì)麥大曲進(jìn)行了對比分析，結(jié)合成熟大曲的微生物種群結(jié)構(gòu)和制曲工藝，解析了小麥軟硬度對濃香型大曲品質(zhì)影響的內(nèi)在原因，對白酒行業(yè)中制曲工藝的優(yōu)化升級(jí)具有一定的借鑒意義，有利于賦能濃香型白酒的高質(zhì)量發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

大曲樣品：取自山東蘭陵美酒股份有限公司制曲車間，軟質(zhì)麥制曲工藝和硬質(zhì)麥制曲工藝相同、制曲時(shí)間一致，制曲過程中主要跟蹤溫度、水分和糖化力等指標(biāo)，并分析成熟大曲的常規(guī)理化指標(biāo)、可培養(yǎng)微生物及高通量測序。取樣時(shí)間點(diǎn)為鮮曲、入房1 d、2 d（倒?jié){）、4 d、6 d、7 d、8 d、10 d、12 d（拼房）、17 d、22 d和27 d（出房）等，樣品采集后迅速進(jìn)行粉碎抽真空，分別置于4 ℃冷藏和-20 ℃冷凍儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

原料耗材：硬質(zhì)麥產(chǎn)自山東棗莊，軟質(zhì)麥產(chǎn)自河南信陽；可培養(yǎng)微生物檢測合成培養(yǎng)基，青島海博生物；用于真菌ITS 間區(qū)擴(kuò)增的通用引物對ITS3F（5'-GCATCGATGAAGAACGC AGC-3'）和ITS4R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）、用于細(xì)菌16S rRNA V3～V4 區(qū)擴(kuò)增的通用引物對338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTA CHVGGGTWTCTAAT-3'），武漢天一輝遠(yuǎn)有限公司合成；dNTPs Mix、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、5×PrimeSTAR Buffer，寶生物工程大連有限公司；E.Z.N.A.?土壤DNA 試劑盒，美國Omega Bio-tek公司。

儀器設(shè)備：YXQ-LS-75SN 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅；Vetiri 梯度基因擴(kuò)增儀，美國ABI 公司；WD-9413B 型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)、DYY-6C 型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；ND-2000C 型微量紫外分光光度計(jì)，美國Nano Drop公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大曲的理化指標(biāo)檢測

每天定時(shí)測定三溫（室溫、曲芯和曲表溫度），并對制曲過程中的水分和糖化力進(jìn)行跟蹤檢測，按照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》檢測入房27 d成熟大曲的水分、糖化力、液化力、發(fā)酵力和酯化力等指標(biāo)，并結(jié)合大曲鑒評結(jié)果進(jìn)行分析。大曲的質(zhì)量鑒評參照公司《濃香型大曲技術(shù)要求及質(zhì)量鑒定標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行評分。

1.2.2 可培養(yǎng)微生物檢測

將采集的樣品加入生理鹽水振蕩3 min，取上清液用無菌水將其稀釋至10-1～10-5等系列梯度，分別吸取200 μL 各樣本梯度稀釋菌液涂布于培養(yǎng)基。細(xì)菌、酵母和霉菌的微生物可培養(yǎng)分析分別使用肉湯培養(yǎng)基、WL 合成培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基。

1.2.3 樣品DNA提取與高通量測序

大曲樣品的DNA提取使用E.Z.N.A.?DNA試劑盒，參照說明書進(jìn)行。將提取到的DNA 使用瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，分別用于細(xì)菌和真菌的PCR 擴(kuò)增。真菌的PCR 擴(kuò)增引物使用帶有barcode的通用引物ITS3F 與ITS4R 進(jìn)行，細(xì)菌的使用16S rRNA“V3～V4”擴(kuò)增的通用引物338F 和806R 進(jìn)行。PCR 產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳與微量紫外分光度計(jì)檢測。將真菌和細(xì)菌的PCR 產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技公司基于Illumina MiSeq 第2 代測序平臺(tái)測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥及其曲坯的理化指標(biāo)和感官特征

與硬質(zhì)麥相比，軟質(zhì)麥適宜生長在濕度大、光照不足、晝夜溫差小的地區(qū)[7]，更適宜微生物的生長，因此軟質(zhì)麥曲坯的初始糖化力比硬質(zhì)麥高105 U（表1）。由于硬質(zhì)麥的角質(zhì)含量高，脆性較大[8]，表皮粉碎后的細(xì)粉率較高、曲坯水分較低、曲坯成型緊度欠佳，容易出現(xiàn)飛邊掉角的現(xiàn)象。

建構(gòu)主義作為認(rèn)知學(xué)派學(xué)習(xí)理論的一個(gè)新的分支,在20世紀(jì)80年代流行于西方,20世紀(jì)九十年代開始引起我國教育界的極大關(guān)注，2000年-2018年中國知網(wǎng)上以建構(gòu)主義為主題的期刊論文就達(dá)21000多篇。建構(gòu)主義的教學(xué)理念對我國的英語教學(xué)產(chǎn)生了重大的影響，現(xiàn)代教育技術(shù)也開始全面融入英語教學(xué)，但是建構(gòu)主義教學(xué)理念在英語教學(xué)中的運(yùn)用效果尚不理想。本文擬以英語專業(yè)《基礎(chǔ)英語》課程教學(xué)為例，闡述基于建構(gòu)主義教學(xué)理念的英語教學(xué)實(shí)踐效果和意義。

表1 硬質(zhì)麥和軟質(zhì)麥及其曲坯的理化指標(biāo)、感官特征對比

2.2 制曲過程中溫度的變化規(guī)律

曲表溫度為兩個(gè)曲塊緊靠在一起所形成的接觸面溫度，曲芯溫度為曲塊內(nèi)部的最高溫度。由圖1 可知，曲坯入房后迅速起溫，倒?jié){前后3 個(gè)溫度差別最小。倒?jié){后曲坯緩慢升溫，5 d 時(shí)達(dá)到50 ℃品溫控制線，隨后曲表溫度維持在控制線附近，此階段為前火期；10 d 后曲芯溫度開始緩慢下降進(jìn)入中火期，可根據(jù)生產(chǎn)情況進(jìn)行拼房。拼房前后曲芯和曲表溫度相差最大，隨后3 個(gè)溫度逐漸下降至控制線進(jìn)入后火期。由于曲坯水分逐漸減少，3 個(gè)溫度差別逐漸減小，當(dāng)室溫低于40 ℃時(shí)后火期結(jié)束，可綜合大曲水分和生產(chǎn)情況進(jìn)行出房。

圖1 硬質(zhì)麥大曲(a)、軟質(zhì)麥大曲(b)制作過程中溫度變化

對比兩種大曲的三溫曲線可知，倒?jié){后硬質(zhì)麥大曲升溫較快，前火期曲芯溫度較高，曲表溫度達(dá)到控制線溫度的時(shí)間較長；軟質(zhì)麥大曲前火期升溫緩慢，中火期溫度較高，高溫維持時(shí)間較長，后火期降溫緩慢，有利于保溫和排潮。

2.3 制曲過程中的常規(guī)理化指標(biāo)

兩種大曲入房后的初始糖化力均比較高，此時(shí)的糖化力為小麥自帶的原始糖化力，不具備釀酒所需糖化、發(fā)酵、產(chǎn)酒和提香等功能。倒?jié){之后品溫繼續(xù)升高，糖化力隨之下降，6～7 d 降到最低水平，曲表糖化力基本定型（圖2）。微生物繼續(xù)向曲芯生長，10 d 時(shí)大曲水分降至22%，糖化力逐步升至600 U，拼房時(shí)大曲糖化力達(dá)到最高水平。拼房后，大曲品溫迅速升至55～60 ℃，糖化力有不同程度的回落。當(dāng)水分降至18 %時(shí)，糖化力變化趨于平穩(wěn)，大曲糖化力基本定型。對比硬質(zhì)麥大曲、軟質(zhì)麥大曲糖化力和水分的變化曲線可知，硬質(zhì)麥大曲糖化力在前火期的波動(dòng)幅度較大，中火期平均糖化力較高，拼房后糖化力回落幅度較小。

圖2 硬質(zhì)麥大曲(a)、軟質(zhì)麥大曲(b)制作過程中糖化力和水分的變化

由于曲坯的理化指標(biāo)、感官特征存在較大的差異，使得兩種大曲的曲表溫度和曲芯溫度均表現(xiàn)出如前所述的差異性，進(jìn)而影響到大曲糖化力、液化力、酯化力和發(fā)酵力的形成（表2）。對比兩種大曲的理化指標(biāo)及感官質(zhì)量可知，軟質(zhì)麥大曲綜合得分較高、掛衣較好、曲質(zhì)緊密無裂縫，硬質(zhì)麥大曲曲香濃郁舒適、糖化力和液化力較高。

表2 硬質(zhì)麥大曲、軟質(zhì)麥大曲常規(guī)理化指標(biāo)及質(zhì)量鑒評結(jié)果

2.4 制曲過程中微生物的可培養(yǎng)分析

大曲的制作是開放式自然發(fā)酵的過程，微生物主要來源于原料、水、空氣、工具、麥草或稻草等。軟質(zhì)麥大曲的微生物總量稍高、細(xì)菌種類較為豐富，硬質(zhì)麥大曲和軟質(zhì)麥大曲中霉菌、細(xì)菌和酵母的變化規(guī)律基本一致。因此，制曲過程中微生物菌落的變化（圖3）未區(qū)分大曲的類別。

圖3 制曲過程中微生物菌落的變化曲線

細(xì)菌在整個(gè)制曲過程中占明顯優(yōu)勢，臥曲后細(xì)菌和酵母迅速進(jìn)行增殖，曲坯散發(fā)出濃郁的發(fā)酵氣，這是曲坯“掛衣”的關(guān)鍵期，也是曲坯微生物代謝最為活躍的時(shí)期。4 d 后品溫逐漸升至45 ℃以上，細(xì)菌和酵母的總數(shù)迅速下降，霉菌進(jìn)行了適量增殖，分離得到的絕大多數(shù)為嗜熱微生物。拼房之后，曲坯培養(yǎng)至15 d 時(shí)曲溫逐漸降至45 ℃以下，細(xì)菌和霉菌的生物量有了小幅度的增加，酵母數(shù)一直維持在較低水平。

2.5 微生物種群結(jié)構(gòu)解析

真菌的群落組成如圖4b 所示，成熟大曲的優(yōu)勢類群主要是畢赤酵母屬（Pichia）、假絲酵母屬（Candida）、根霉屬（Rhizopus）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、根毛霉屬（Rhizomucor）、犁壺菌屬（Apiotrichum）、復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）等，相對豐度共計(jì)82.19 %。對比兩種大曲的真菌種群結(jié)構(gòu)可知，軟質(zhì)麥大曲中假絲酵母屬的相對含量較高，硬質(zhì)麥大曲中畢赤酵母屬、根霉屬和橫梗霉屬的相對含量較高，與兩種大曲發(fā)酵力和酯化力等指標(biāo)的差異相吻合。

圖4 硬質(zhì)麥大曲、軟質(zhì)麥大曲細(xì)菌(a)和真菌(b)在屬水平的種群結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論

通過對比硬質(zhì)麥大曲和軟質(zhì)麥大曲的感官指標(biāo)、理化指標(biāo)以及微生物種群結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：軟質(zhì)麥大曲的感官質(zhì)量和理化指標(biāo)更有利于提高濃香型白酒的優(yōu)質(zhì)品率，硬質(zhì)麥大曲的香氣更濃郁舒適、糖化能力更好；按照軟質(zhì)麥40 %～50 %的使用比例配合硬質(zhì)麥制曲，可能更有利于提高濃香型大曲的優(yōu)質(zhì)曲率。

（1）硬質(zhì)麥表皮粉碎后的細(xì)粉率較高，壓曲成型后鮮曲水分較低、曲坯成型緊度不好。兩種大曲的曲表溫度和曲芯溫度差異明顯，硬質(zhì)麥大曲升溫較快，軟質(zhì)麥大曲前火期升溫緩慢，中火期溫度較高、高溫維持時(shí)間較長，后火期降溫緩慢，更有利于排潮。

（2）硬質(zhì)麥大曲糖化力的波動(dòng)幅度較大，成熟大曲的糖化力比軟質(zhì)麥大曲高207 U；軟質(zhì)麥大曲綜合得分較高、掛衣較好、曲質(zhì)緊密無裂縫，硬質(zhì)麥大曲酸度較小、曲香濃郁舒適、糖化力和液化力較高。

（3）硬質(zhì)麥大曲和軟質(zhì)麥大曲在香氣、酸度、糖化力、液化力、發(fā)酵力和酯化力等方面的差異，主要是魏斯氏菌屬、乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、根霉屬和橫梗霉屬等優(yōu)勢類群在兩種大曲中相對豐度不同的原因。

本試驗(yàn)僅從硬質(zhì)麥和軟質(zhì)麥制曲過程進(jìn)行了對比分析，還未涉及到成品大曲在濃香型白酒生產(chǎn)過程中的應(yīng)用，有待于進(jìn)一步的研究。