賈慶超，宋志強(qiáng)

(鄭州科技學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院 鄭州市食品安全快速檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450064)

大蒜是蔥科蔥屬植物中一種十分有效的功能性食品原料[1]，性溫味辛，常被人們譽(yù)為“天然的抗生素”，醫(yī)學(xué)研究表明[2]，大蒜在心血管疾病、感染性疾病、腫瘤及糖尿病等的預(yù)防與治療方面具有活性作用。然而，其辛辣的味道和特有的氣味讓很多人望而生卻，尤其是未加工的生大蒜。黑蒜又稱為發(fā)酵黑蒜，是在不添加任何添加劑的情況下，通過控制溫度對(duì)整個(gè)大蒜進(jìn)行數(shù)天發(fā)酵生產(chǎn)而成[3-4]，大蒜顏色在發(fā)酵過程中逐漸從白色或黃色變?yōu)樯钭厣玔5]，主要發(fā)生非酶褐變、酚類氧化和多糖解聚等化學(xué)反應(yīng)[6-7]，發(fā)酵過程的熱量加速了高分子量多糖降解為低分子量低聚糖和單糖，從而轉(zhuǎn)化為水溶性生物活性化合物，如S-烯丙基半胱氨酸、生物堿、多酚和類黃酮化合物，這些化合物與黑蒜的抗氧化、抗腫瘤、抗癌、抗過敏和降血脂等保健功能有關(guān)，黑蒜的這些具有保健功能的物質(zhì)取決于其加工的工藝條件[8]。研究表明[9]，預(yù)處理工藝可以改變黑蒜保健功能的活性物質(zhì)。一般來說，高溫會(huì)破壞大蒜基質(zhì)中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促使黑蒜在發(fā)酵過程中物質(zhì)的釋放進(jìn)而相互反應(yīng)。蒸汽處理是水果和蔬菜加工中使用的一種常見的熱處理方法，它通過果膠多糖的解聚導(dǎo)致細(xì)胞膜損壞[10-11]，就加工時(shí)間和黑蒜的特性而言，蒸汽預(yù)處理工藝可能是提高黑蒜產(chǎn)品加工效率的一種簡(jiǎn)單替代技術(shù)。本研究的目的是研究蒸汽預(yù)處理工藝對(duì)黑蒜品質(zhì)的影響，主要研究了不同蒸汽預(yù)處理時(shí)間制備的黑蒜的一些性能指標(biāo)和抗氧化活性，為黑蒜的發(fā)展研究提供了有力的數(shù)據(jù)參考和支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮大蒜：市購；EDTA-2Na、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、焦性沒食子酸、沒食子酸、無水乙醇、氯化鐵、硫酸亞鐵、鄰二氮菲、雙氧水、鄰苯三酚：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水碳酸鈉：鄭州派尼化學(xué)試劑廠；苯酚、巴比妥酸：上海展云化工有限公司；濃硫酸、濃鹽酸：洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；蔗糖：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；鐵氰化鉀、濃鹽酸、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、乙酸鋅、冰乙酸、硼酸鈉、亞硝酸鈉：鄭州市德眾化學(xué)試劑廠；Tris、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、茚三酮、福林酚(1 mol/L)：福州飛凈生物科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004 Bsartorius電子天平 賽多利斯公司；PXSJ-216離子分析儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；恒溫發(fā)酵箱 上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司；Anke TDL-50B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；電熱恒溫水溫箱、電子萬用爐 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；KQ5200B機(jī)械型超聲波清洗儀 上海合金超聲設(shè)備有限公司；UV-4802H紫外分光光度計(jì) 尤尼柯儀器有限公司；CR-400 型色差儀 日本Minolta公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大蒜的蒸汽預(yù)處理

首先選取新鮮大蒜去皮、去根蒂清洗，將蒸汽鍋內(nèi)水燒開5 min，使汽蒸鍋內(nèi)的蒸汽達(dá)到飽和，將清洗過的大蒜瓣迅速放在蒸鍋的篦子上，進(jìn)行蒸汽預(yù)處理。預(yù)處理時(shí)間分別為3，5 min(以下分別簡(jiǎn)寫為PT3、PT5)，將處理好的蒜瓣于室溫下，通風(fēng)櫥中干燥1 h，同時(shí)和未進(jìn)行任何處理的大蒜(以下簡(jiǎn)寫為PN)，一起用于制備黑蒜。

1.3.2 黑蒜的制備

根據(jù)趙雪晴等[12]和Zhang等的研究，將預(yù)處理好的大蒜PT3、PT5和未進(jìn)行預(yù)處理的大蒜PN放入發(fā)酵箱內(nèi)，保持濕度不變，設(shè)定發(fā)酵溫度為70 ℃，進(jìn)行發(fā)酵，每隔2 d定量取出發(fā)酵的黑蒜進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定，發(fā)酵的總時(shí)間為18 d。

1.3.3 褐變程度的測(cè)定

根據(jù)Li等[13]的方法，使用色差計(jì)測(cè)量色度。在色差計(jì)中，樣品的顏色由3個(gè)維度L*、a*和b*表示。L*值(反射率)衡量產(chǎn)品對(duì)光的反射，范圍從完美白色的 100 到黑色的 0。紅色/綠色和黃色/藍(lán)色分別用a*和b*值表示。色差計(jì)在測(cè)量前使用白色和黑色標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校準(zhǔn)。褐變程度以ΔE表示：

ΔE=[(L*-L0)2+(a*-a0)2+(b*-b0)2]1/2。

式中：L*、a*、b*分別為色差計(jì)的測(cè)定值；L0、a0、b0分別為未進(jìn)行任何處理的大蒜的測(cè)定值。

1.3.4 水分含量的測(cè)定

采用GB 5009.3—2016中的第一法直接干燥法對(duì)水分含量進(jìn)行測(cè)定，干燥溫度為60～65 ℃。

1.3.5 氨基酸-N含量的測(cè)定

采用電位滴定法進(jìn)行氨基酸-N含量的測(cè)定。

1.3.6 總酚含量的測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu法[14-15]測(cè)定總酚含量。在760 nm下測(cè)定吸光度，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=94.893X+0.009 6，R2=0.999 6。

1.3.7 還原糖含量的測(cè)定

采用DNS法[16](3,5-二硝基水楊酸顯色法)測(cè)定還原糖含量，在494 nm處測(cè)定吸光度，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.006 2X—0.002 1，R2=0.999 5。

1.3.8 5-HMF(5-羥甲基糠醛)含量的測(cè)定

采用李良等[17]和Li等的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.9 總黃酮含量的測(cè)定

參考鄭清等[18]、趙曉娟等[19]的方法，配制0.2 mg/mL的蘆丁溶液，分別取0，1，2，3，4，5 mL，用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法處理，在510 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=1.986 3X—0.002 8，R2=0.999 2。黃酮含量計(jì)算公式為：

式中：X為黃酮含量(mg/g)；C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的質(zhì)量濃度(mg/mL)；V為所取液體的體積(mL)；A為所取待測(cè)液的稀釋倍數(shù)；B為黑蒜粉末質(zhì)量(g)。

1.3.10 總酸含量的測(cè)定

參考加雪梅[20]的方法進(jìn)行總酸含量的測(cè)定。

1.3.11 DPPH·、·OH清除率的測(cè)定

參考趙曉娟等的DPPH·、·OH清除活性測(cè)定方法，進(jìn)行抗氧化性的測(cè)定。

1.3.12 發(fā)酵終點(diǎn)的判斷

結(jié)合黑蒜的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)Q/LYY 0001S-2010、Q/SJC 0001S-2010、Q/STY 0001S-2013、Q/SHD 0001S-2011等，參考趙雪晴等的研究結(jié)果，黑蒜的發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)制定為：水分含量(g/100 g)≤40，還原糖含量(g/100 g)≥25，總酚含量(mg/g)≥8，5-HMF(mg/g)≤13.0，氨基酸-N含量(g/100 g)≥5.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑蒜的褐變程度

圖1 褐變程度Fig.1 Browning degree

ΔE的大小意味著黑蒜顏色的深淺，ΔE值越大，大蒜的褐變程度越大，黑蒜的顏色越深[21]。由圖1可知，PT3和PT5的ΔE在發(fā)酵18 d內(nèi)均比未處理的大蒜的ΔE要大，說明蒸汽處理可以促進(jìn)美拉德反應(yīng)的發(fā)生，促進(jìn)黑蒜更快發(fā)酵。PT3和PT5的ΔE分別在發(fā)酵第10天和第12天基本趨于穩(wěn)定，說明這時(shí)候黑蒜基本發(fā)酵形成。另外，PT3和PT5的褐變程度均大于PN，Nugrahedi和Li等指出，蒸前處理可能通過破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞結(jié)構(gòu)來誘發(fā)黑蒜的發(fā)黑，大蒜中還原糖、氨基酸-N含量、酚類化合物等成分更加容易釋放出來，促進(jìn)美拉德褐變反應(yīng)的發(fā)生。PT3的ΔE大于PT5，F(xiàn)ante等[22]指出可能是由于PT5促使多酚氧化酶(PPO)失活，從而不利于美拉德反應(yīng)的發(fā)生，而PT3則不足以使大蒜PPO活性完全失活，以上說明3 min的蒸汽預(yù)處理時(shí)間比較適宜。

2.2 水分含量

由圖2可知，3種條件下的大蒜在發(fā)酵過程中水分含量均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，尤其是PT3水分含量下降得更加明顯一些，說明PT3美拉德反應(yīng)更加強(qiáng)烈。根據(jù)1.3.12中黑蒜指標(biāo)的要求，在發(fā)酵第18天時(shí)，由未處理大蒜發(fā)酵制備的黑蒜的水分含量才符合黑蒜的指標(biāo)要求，PT3和PT5在第6天、第10天就已經(jīng)符合要求，說明蒸汽預(yù)處理可以大大縮短黑蒜發(fā)酵所需的時(shí)間，節(jié)約時(shí)間成本，且在第18天時(shí)，水分含量PT3

圖2 水分含量Fig.2 Moisture content

2.3 還原糖含量

在黑蒜加工過程中，黑蒜中的還原糖含量取決于兩個(gè)因素：一是大蒜中的多糖被降解為還原糖，二是還原糖在美拉德反應(yīng)過程中被消耗，黑蒜中還原糖含量的變化是二者共同作用的結(jié)果。由圖3可知，在黑蒜的發(fā)酵前期，PT3、PT5和PN均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，是由于多糖的降解生成還原糖的速率大于美拉德反應(yīng)消耗還原糖的速率，而后期還原糖含量下降則是美拉德反應(yīng)的速率大于多糖的降解速率所致。在黑蒜發(fā)酵18 d內(nèi)，PT3、PT5的還原糖含量均比PN的還原糖含量高一些，尤其是對(duì)于PT3、PT5，還原糖含量分別在第12天和第10天達(dá)到最大值，分別為60.18 g/100 g和61.36 g/100 g，而此時(shí)PN的還原糖含量為47.11 g/100 g和48.29 g/100 g，均增大了25%左右，說明蒸汽預(yù)處理可以破壞大蒜的細(xì)胞壁和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促使還原糖更好地釋放出來。

圖3 還原糖含量Fig.3 Reducing sugar content

2.4 5-HMF含量

5-HMF 主要通過美拉德反應(yīng)和糖類脫水形成[23]，是美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物，味道略苦，它的積累與黑蒜的甜味有關(guān)。由圖4可知，在發(fā)酵過程中，5-HMF的含量逐漸增加，且PN>PT5>PT3，說明蒸汽預(yù)處理可以降低5-HMF的含量，增加所加工的黑蒜的甜度。王聰聰?shù)萚24]指出，pH值是影響5-HMF的重要因素，在黑蒜的加工過程中，酸性條件有利于5-HMF的生成，堿性條件則抑制5-HMF的生成。在黑蒜的加工過程中，PN的pH值較小，一定程度上加速了5-HMF的生成。另外，還原糖的含量也是影響5-HMF的重要條件，PT3和PT5分別在發(fā)酵第12天和第10天還原糖含量出現(xiàn)最大值，5-HMF的含量隨后也出現(xiàn)較大程度的增長(zhǎng)。

圖4 5-HMF含量

2.5 氨基酸-N含量

氨基酸是美拉德反應(yīng)的重要底物，其含量直接影響黑蒜的品質(zhì)，主要取決于兩個(gè)因素：一是美拉德反應(yīng)的消耗，二是大蒜在加工過程中蛋白質(zhì)的分解。由圖5可知，隨著黑蒜加工時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)的生成量大于美拉德反應(yīng)的消耗量[25]，且大蒜發(fā)酵過程中水分減少，均促使氨基酸-N含量上升。后來由于美拉德反應(yīng)的消耗量大于蛋白質(zhì)的分解生成量，使其呈現(xiàn)減小的趨勢(shì)。另外，氨基酸也可與 5-HMF 發(fā)生美拉德反應(yīng)[26-27]，從而減少5-HMF 的積累，增加黑蒜的風(fēng)味。從發(fā)酵的第10天開始，氨基酸-N含量均小于PN，大蒜加工結(jié)束后，蒸汽預(yù)處理的大蒜氨基酸-N含量比PN分別降低了27.56%和20.10%。美拉德反應(yīng)在黑蒜加工中很重要，褐變程度反映了美拉德反應(yīng)的速度。在同一加工時(shí)間下蒸汽預(yù)處理大蒜的褐變程度明顯大于PN，因此蒸汽預(yù)處理大蒜對(duì)氨基酸-N的消耗量高于PN。

圖5 氨基酸-N含量Fig.5 Amino acid-N content

2.6 總黃酮和總酚含量

黃酮類和酚類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，廣泛存在于自然界動(dòng)物和植物體中，是理想的天然抗氧化劑[28]。由圖6可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，PT3、PT5和PN總黃酮和總酚含量均呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，在發(fā)酵第10天時(shí)，PT3的總黃酮和總酚含量超過PN，在發(fā)酵第18天時(shí)，總黃酮和總酚含量PT3>PN>PT5，PT3的總黃酮和總酚含量相對(duì)PN分別提升了84.2%和58.7%，說明PT3有利于提升發(fā)酵黑蒜的黃酮和酚類化合物的含量，增強(qiáng)發(fā)酵黑蒜的抗氧化性，而PT5不利于提升二者的含量。據(jù)報(bào)道，大蒜中的生物活性物質(zhì)在發(fā)酵過程中增加，尤其是多酚和類黃酮等抗氧化活性物質(zhì)，這可能是由于高分子量多酚類化合物的分解，釋放出新的低分子量衍生物。同時(shí)大蒜熱處理可導(dǎo)致蒜氨酸酶失活，進(jìn)而阻斷γ-谷氨?；腚装彼崴夂脱趸杉?xì)胞毒性化合物，可能有利于γ-谷氨?；腚装彼嵩诤谒獍l(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化為黃酮和酚類等功能性化合物[29]。此外，蒸汽預(yù)處理可通過破壞大蒜基質(zhì)中的細(xì)胞膜而誘導(dǎo)一些化合物的釋放，從而提高美拉德反應(yīng)速率，促使黑蒜在發(fā)酵過程中生成更多的功能活性化合物[30]。

圖6 總黃酮和總酚含量Fig.6 Total flavonoid and total phenol content

2.7 總酸含量

美拉德反應(yīng)是一個(gè)產(chǎn)酸的過程，其中間產(chǎn)物α-二羰基化合物能夠通過降解生成甲酸、乙酸等有機(jī)酸[31]。由圖7可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，PT3、PT5和PN總酸含量均增加，在發(fā)酵第18天時(shí)均達(dá)到最大值，且總酸含量PT3>PT5>PN，說明大蒜的蒸汽預(yù)處理可以增加黑蒜的總酸含量，其酸度增加與發(fā)酵過程中形成的褐變物質(zhì)有關(guān)，此時(shí)其總酸含量均小于40 mg/g，可產(chǎn)生令人愉快的酸味，張曉溪等[32]關(guān)于美拉德反應(yīng)研究的結(jié)果亦表明，pH值均隨著美拉德反應(yīng)的進(jìn)行而降低，反應(yīng)體系的酸度逐漸增加。綜上所述，在發(fā)酵第18天時(shí)，制備的黑蒜完全符合要求，蒸汽預(yù)處理可大大縮短黑蒜的制備時(shí)間。

圖7 總酸含量Fig.7 Total acid content

2.8 抗氧化性

DPPH·溶于乙醇，在517 nm波長(zhǎng)處有最大吸光度，是一種穩(wěn)定的自由基。當(dāng)DPPH·遇到抗氧化性物質(zhì)時(shí)，接受被測(cè)樣品提供的電子或氫后，形成穩(wěn)定的分子，溶液顏色減退，導(dǎo)致其吸光度減小。根據(jù)吸光度的大小可以判斷被測(cè)樣品抗氧化能力的強(qiáng)弱[33]。

圖8 DPPH·的清除能力Fig.8 Scavenging ability of DPPH· free radicals

由圖8可知，隨著黑蒜發(fā)酵時(shí)間的增加，其抗氧化性逐漸增大，最大時(shí)PT3、PT5和PN三者分別達(dá)到76.3%、73.8%和55.8%，尤其是發(fā)酵8 d以后，DPPH·清除率增加的幅度更大，這與其總酚和總黃酮的變化趨勢(shì)是一致的。另外，PT3的DPPH·清除率稍大于PT5，且二者均比PN大，尤其是8 d以后，PT3和PT5比PN更大一些，最大時(shí)分別相對(duì)PN增加36.3%和32.2%。以上說明PT3更有利于提升黑蒜對(duì)DPPH·的清除率，同時(shí)也說明蒸汽預(yù)處理可以提升黑蒜對(duì)DPPH·的清除率。

圖9 ·OH的清除能力Fig.9 Scavenging ability of ·OH free radicals

·OH具有較強(qiáng)的得電子能力，會(huì)誘導(dǎo)DNA 鏈斷裂和堿基改性，從而引起如癌癥等一系列疾病，其產(chǎn)生的Fenton反應(yīng)為：Fe2++H2O2→Fe3++·OH +OH-?？寡趸缘奈镔|(zhì)可以直接清除羥自由基，減少羥自由基的產(chǎn)生量，吸光度值降低[34]。

由圖9可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，PT3、PT5和PN對(duì)·OH的清除率均逐漸增大，且PT3>PT5>PN，PT3、PT5與PN之間的差距隨著發(fā)酵時(shí)間的增加逐漸增大，PT3和PT5最大時(shí)分別達(dá)到53.7%和50.6%，相對(duì)PN分別增大了44.7%和36.3%。以上說明PT3更有利于提升黑蒜對(duì)·OH的清除率，同時(shí)也說明蒸汽預(yù)處理可以提升黑蒜對(duì)·OH的清除率。

Bae和Lu等指出，在一定發(fā)酵溫度下，黑蒜的顏色深淺取決于其發(fā)生的美拉德、酚類氧化和多糖降解等復(fù)雜反應(yīng)，這些復(fù)雜反應(yīng)提供了各種各樣的生物活性化合物，如美拉德反應(yīng)中間物、多酚和黃酮類等化合物，這些物質(zhì)對(duì)于提升黑蒜的抗氧化性是非常有利的，而其質(zhì)量和數(shù)量取決于所使用的生產(chǎn)工藝[35-36]。綜上所述，蒸汽預(yù)處理可提高黑蒜的抗氧化活性，且PT3優(yōu)于PT5。為了進(jìn)一步探索蒸汽預(yù)處理制備黑蒜的最佳工藝，下一步的工作重點(diǎn)是將蒸汽預(yù)處理的時(shí)間設(shè)置更加細(xì)致一些，比如預(yù)處理50 s、1 min、2 min等，結(jié)果值得期待。

3 結(jié)論

相對(duì)PN而言，蒸汽預(yù)處理使黑蒜的褐變程度ΔE在更短時(shí)間內(nèi)趨于穩(wěn)定，還原糖更加容易生成，根據(jù)黑蒜的標(biāo)準(zhǔn)，PT3形成黑蒜的時(shí)間為第10天，PT5形成黑蒜的時(shí)間為第12天，而PN形成黑蒜的時(shí)間為第18天，說明PT3是比較好的蒸汽預(yù)處理時(shí)間，此時(shí)5-HMF含量較低，總黃酮、總酚等抗氧化性物質(zhì)含量較高，黑蒜具有較強(qiáng)的抗氧化活性，而且在更短的時(shí)間內(nèi)制備出黑蒜，節(jié)約了時(shí)間成本，具有更廣闊的發(fā)展空間。所以進(jìn)一步研究蒸汽預(yù)處理的價(jià)值很高，同時(shí)也可以結(jié)合目前部分研究者提出的冷凍預(yù)處理，將二者預(yù)處理工藝聯(lián)合也將是下一步研究的重點(diǎn)。