王英超，趙榮茂，張慧瑩，劉?，?，高曉龍，高敏，鄭博君，周德剛，梅力，馮小宇

（1.北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102629；2.北京納百生物科技有限公司，北京 100176）

布魯氏菌病（brucellosis，以下簡(jiǎn)稱布?。┦怯刹剪斒暇˙rucella）感染引起的一種人獸共患傳染病[1]。近年來(lái)，隨著我國(guó)畜牧業(yè)的蓬勃發(fā)展，家畜飼養(yǎng)規(guī)模及數(shù)量不斷增加，布病在人畜間的新發(fā)病例數(shù)量也隨之急劇增加，布病防控形勢(shì)嚴(yán)峻。同時(shí)，布魯氏菌在小動(dòng)物中的傳播被認(rèn)為是公共衛(wèi)生領(lǐng)域的潛在風(fēng)險(xiǎn)，且可能成為新型生物戰(zhàn)劑，嚴(yán)重危害國(guó)家安全和人民健康[2-3]。因此，需要加強(qiáng)畜間布病防控和凈化，保障畜牧業(yè)健康發(fā)展及人民群眾生命財(cái)產(chǎn)安全[4]。

目前，布魯氏菌抗體的檢測(cè)方法主要有凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)以及熒光偏振測(cè)定法、膠體金免疫層析技術(shù)等[1]。凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)是較為傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，其操作較為復(fù)雜，靈敏度低，通常需要由專業(yè)人員操作；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、熒光偏振測(cè)定法，在操作方法和靈敏度上有一定的改善，但仍然需要配備專用儀器進(jìn)行操作，無(wú)法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)；膠體金免疫層析技術(shù)因具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、結(jié)果易判讀、成本低等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用，但仍需進(jìn)一步改善其靈敏度低、樣本差異大等不足。因此，亟需研制一種簡(jiǎn)易、快捷、靈敏度高、穩(wěn)定性好的布魯氏菌抗體快速檢測(cè)試劑，為布病免疫效果監(jiān)控及凈化提供技術(shù)支持，這對(duì)布病防控和凈化具有重要意義[5-6]。

本研究采用間接熒光免疫層析技術(shù)，以熒光微球?yàn)檩d體標(biāo)記兔抗牛IgG，以布魯氏菌脂多糖（LPS）抗原包被固相膜，研制出一種牛布魯氏菌抗體熒光快速檢測(cè)試紙卡，其操作簡(jiǎn)單快捷、靈敏度高、穩(wěn)定性好，能有效進(jìn)行布魯氏菌抗體的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

硝酸纖維素膜（MDI90），購(gòu)自MDI 公司；熒光微球（200 nm），購(gòu)自蘇州為度生物技術(shù)有限公司；樣品墊、吸水紙、聚氯乙烯底板（PVC 底板），購(gòu)自上海金標(biāo)生物科技有限公司；兔抗牛IgG、羊抗兔IgG，購(gòu)自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；2-嗎啉乙磺酸（MES），購(gòu)自TCI 公司；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），購(gòu)自Aladdin 公司；牛血清白蛋白（BSA），購(gòu)自上海西寶生物科技有限公司；甘氨酸（Gly），購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司；牛布魯氏菌抗體陽(yáng)性血清國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品）和LPS 抗原，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

HM3230 型三維滑膜噴金儀、HM3030 型滑膜儀，購(gòu)自上海金標(biāo)生物科技有限公司；BHG-9245A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；V200 型熒光試紙條讀取儀，購(gòu)自蘇州和邁精密儀器有限公司；TGL-6 型離心機(jī)，購(gòu)自湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 兔抗牛IgG-熒光微球偶聯(lián)物制備

1.3.1 封閉液和復(fù)溶液的初步篩選（1）微球活化：將1%熒光微球用標(biāo)記緩沖液（50 mmol/L MES，pH 6.0）做20 倍稀釋；用標(biāo)記緩沖液分別配制0.1 mg/mL NHS 和EDC（現(xiàn)用現(xiàn)配）；將配制好的NHS 和EDC 各取5 μL，依次加入1 mL 熒光微球溶液中，快速混勻，室溫混勻孵育20 min。（2）微球清洗：將活化后的微球12 000 r/min 離心20 min，棄上清；用1 mL 標(biāo)記緩沖液重懸微球，重復(fù)2 次。微球與抗體偶聯(lián)：取0.025 mg 抗體于離心管中，加入活化后的微球，快速混勻后，室溫混勻孵育2 h。（3）封閉：用純水分別配制10%的BSA 和Gly，備用；各取500 μL 標(biāo)記抗體的熒光微球，分別加入5 μL 的10% BSA 和10% Gly，室溫混勻孵育1 h。（4）分離及復(fù)溶：將封閉好的微球，分裝為100 μL/ 管，12 000 r/min 離心20 min；棄上清，用100 μL 復(fù)溶液復(fù)溶。按照配方（表1）分別配制復(fù)溶液。

表1 不同緩存體系復(fù)溶液配方 單位：%

1.3.2 復(fù)溶液的優(yōu)化 按照1.3.1 進(jìn)行微球標(biāo)記，封閉液選擇10% Gly，按照配方（表2）分別配制復(fù)溶液。

表2 不同復(fù)溶液配方 單位：%

1.3.3 兔抗牛IgG 標(biāo)記量的優(yōu)化 按照1.3.1 進(jìn)行微球標(biāo)記，封閉液選擇10% Gly，復(fù)溶液選擇1.3.2 中C 組復(fù)溶液；在微球與抗體的偶聯(lián)中，兔抗牛IgG 標(biāo)記量分別選取0.050、0.025、0.005、0.001 mg/mL。

1.4 劃膜條件優(yōu)化

按照1.3 中的優(yōu)化條件，制備兔抗牛IgG-熒光微球偶聯(lián)物，進(jìn)行熒光試紙條劃膜條件優(yōu)化。

1.4.1 包被質(zhì)量濃度優(yōu)化 將LPS 抗原分別以0.5、1.0、2.0 mg/mL 的質(zhì)量濃度，用滑膜儀按1 μL/cm 的體積噴涂到硝酸纖維素膜的檢測(cè)線（T線）位置；將羊抗兔IgG 分別以0.2、0.5、1.0 mg/mL的質(zhì)量濃度，用滑膜儀按1 μL/cm 的體積噴涂到硝酸纖維素膜的質(zhì)控線（C 線）位置。

1.4.2 包被緩存液優(yōu)化 按照1.4.1 優(yōu)化后包被質(zhì)量濃度，分別選取0.01、0.20 mol/L 兩種濃度進(jìn)行包被緩沖液優(yōu)化。

1.5 檢測(cè)方法建立及評(píng)價(jià)

1.5.1 臨界值確定 按照1.3 及1.4 優(yōu)化后方法，制備試紙條，檢測(cè)67 例陰性樣品，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果確定試紙條的臨界值。

1.5.2 靈敏度分析 將牛布魯氏菌抗體陽(yáng)性血清標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋成50.0、25.0、12.5、6.3、3.1、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 IU/mL，采用本研究建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，分析試紙條的靈敏度。

1.5.3 特異性分析 采用本研究建立的方法，分別檢測(cè)牛布魯氏菌抗體陽(yáng)性血清、牛口蹄疫病毒O 型（FMDV-O）抗體陽(yáng)性血清、牛口蹄疫病毒A型（FMDV-A）抗體陽(yáng)性血清、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）抗體陽(yáng)性血清、牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）抗體陽(yáng)性血清，考察試紙條的特異性。

1.5.4 臨床樣本檢測(cè) 采用本研究建立牛布魯氏菌抗體熒光快速檢測(cè)試紙卡，檢測(cè)來(lái)自養(yǎng)殖場(chǎng)和屠宰場(chǎng)的469 份臨床樣品，并與熒光偏振方法進(jìn)行比較，對(duì)比分析試紙條檢測(cè)臨床樣品的性能。

2 結(jié)果與分析

2.1 兔抗牛IgG-熒光微球偶聯(lián)物制備

2.1.1 封閉液和復(fù)溶液初步篩選 根據(jù)陰陽(yáng)性差異及爬膜狀態(tài)，選擇最佳封閉液及復(fù)溶液。結(jié)果（表3）顯示：當(dāng)使用10% BSA 為封閉液時(shí)，效果都較差；條件1 的陰陽(yáng)性差異及爬膜狀態(tài)均優(yōu)于其他組，因此選擇10% Gly 為封閉液；0.05 mol/L Tris體系復(fù)溶液較優(yōu)，故選擇A組復(fù)溶液為基礎(chǔ)復(fù)溶液，并進(jìn)一步優(yōu)化。

表3 封閉液和復(fù)溶液的初步篩選檢測(cè)結(jié)果

2.1.2 復(fù)溶液優(yōu)化 根據(jù)陰陽(yáng)性差異及爬膜狀態(tài)，選擇最佳復(fù)溶液。結(jié)果（表4）顯示：復(fù)溶液中不宜加入BSA，否則會(huì)導(dǎo)致熒光信號(hào)變?nèi)酰灰膊灰思尤隚ly 和吐溫-20，否則會(huì)導(dǎo)致一定的堆球現(xiàn)象；而C 組配方的陰陽(yáng)性差異及爬膜狀態(tài)均優(yōu)于其他組。因此，選擇C 組配方作為復(fù)溶液。

表4 復(fù)溶液的優(yōu)化檢測(cè)結(jié)果

2.1.3 兔抗牛IgG 標(biāo)記量?jī)?yōu)化 根據(jù)熒光反應(yīng)強(qiáng)度及陰陽(yáng)性差異（S/N），選擇最佳兔抗牛IgG 標(biāo)記量。結(jié)果（表5）顯示：隨著抗體添加量增加，T 線熒光強(qiáng)度有一定的增加，但增加到0.005 mg/mL后，增加幅度減小。故選擇兔抗牛IgG 標(biāo)記量為0.005 mg/mL。

表5 兔抗牛IgG 標(biāo)記量的優(yōu)化檢測(cè)結(jié)果

2.2 劃膜條件優(yōu)化

2.2.1 包被濃度優(yōu)化 根據(jù)熒光強(qiáng)度T/C及陰陽(yáng)性差異（ST/C/NT/C），選擇最佳包被質(zhì)量濃度。對(duì)T、C 線不同包被質(zhì)量濃度進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果（表6）顯示：隨著T 線包被質(zhì)量濃度增加，T 線熒光信號(hào)有一定的增強(qiáng)，故T 線選擇2.0 mg/mL 進(jìn)行包被；隨著C 線包被質(zhì)量濃度增加，C 線熒光信號(hào)也有一定的增加，而T/C逐漸降低，同時(shí)ST/C/NT/C也逐漸降低。故選擇ST/C/NT/C最高的0.5 mg/mL 質(zhì)量濃度進(jìn)行包被。即確定T 線LPS 抗原包被質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL，C 線羊抗兔IgG 包被質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。

表6 包被質(zhì)量濃度的優(yōu)化檢測(cè)結(jié)果

2.2.2 包被緩存液優(yōu)化 根據(jù)熒光強(qiáng)度T/C、陰陽(yáng)性差異（ST/C/NT/C）及線條顯色狀態(tài)，選擇最佳包被緩沖液。結(jié)果（表7）顯示：T 線包被緩沖液增加鹽離子濃度，包被效果較好；C 線包被緩沖液增加鹽離子濃度，包被效果有聚線現(xiàn)象?？紤]與對(duì)應(yīng)原料的原緩沖離子強(qiáng)度有關(guān)，T 線包被緩沖液可選擇0.02 mol/L PBS，C 線包被緩沖液可選擇0.01 mol/L PBS。

表7 包被緩存液的優(yōu)化檢測(cè)結(jié)果

2.3 檢測(cè)方法建立及評(píng)價(jià)

2.3.1 臨界值確定 按照優(yōu)化后方法，制備試紙條，檢測(cè)67 例陰性樣品，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表8。根據(jù)陰性樣品T/C的平均值（6%）+3倍標(biāo)準(zhǔn)差（3×2%），確定該方法的陰陽(yáng)性臨界值為12%，即T/C＜12%判為陰性，≥12%判為陽(yáng)性。

表8 陰性樣本檢測(cè)與分析結(jié)果

2.3.2 靈敏度分析 將牛布魯氏菌抗體陽(yáng)性血清標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋成50.0、25.0、12.5、6.3、3.1、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1 IU/mL，采用本研究建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，分析試紙條的靈敏度，以T/C≥12%表示對(duì)應(yīng)抗體濃度的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。結(jié)果（表9）顯示，該方法的靈敏度可達(dá)0.8 IU/mL。

表9 靈敏度分析檢測(cè)結(jié)果

2.3.3 特異性分析 采用本研究建立的方法，分析試紙條的特異性，結(jié)果見(jiàn)表10、圖1。可以看出，F(xiàn)MDV-O、FMDV-A、BVDV、IBRV 陽(yáng)性血清的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明該方法與常見(jiàn)牛疫病病原抗體無(wú)交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。

圖1 檢測(cè)試紙卡特異性分析結(jié)果

表10 特異性分析檢測(cè)數(shù)據(jù) 單位：%

2.3.4 臨床樣本檢測(cè) 采用本研究建立方法，檢測(cè)469 份具有熒光偏振背景的臨床樣本，比較兩種方法的符合率。檢測(cè)結(jié)果（表11）顯示：本方法檢出9 份牛布魯氏菌抗體陽(yáng)性血清，熒光偏振也檢出9 份陽(yáng)性，且樣品編號(hào)完全一致，說(shuō)明兩種方法的符合率為100%。

表11 臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果 單位：份

3 討論

布病是全球密切關(guān)注的人獸共患病，嚴(yán)重危害人類生命及財(cái)產(chǎn)安全。因此，建立簡(jiǎn)易、快捷、靈敏度高、特異性好，且適用于臨床樣品快速檢測(cè)的方法意義重大。以膠體金標(biāo)記物為基礎(chǔ)的免疫層析技術(shù)，因其操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、結(jié)果易判讀、成本低等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景[7]，但其仍存在靈敏度低、樣本差異大等不足。熒光標(biāo)記物，作為一種新型的熒光標(biāo)記材料，通過(guò)將熒光材料包埋于有機(jī)聚合物中，對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)一步放大，從而顯著提高了檢測(cè)靈敏度。熒光免疫層析技術(shù)既具備膠體金免疫層析法操作便捷，可現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，又兼顧了熒光持續(xù)穩(wěn)定的特性，可較好地克服膠體金免疫層析法檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[8-10]。

本研究采用間接熒光免疫層析技術(shù)，以熒光微球?yàn)檩d體，標(biāo)記兔抗牛IgG，以LPS 抗原包被固相膜，研制牛布魯氏菌抗體熒光快速檢測(cè)試紙卡。通過(guò)單一變量分析法，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)檢測(cè)牛布魯氏菌抗體陰性樣品，確定所建立檢測(cè)方法的臨界值，并分別對(duì)其靈敏度、特異性進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究建立檢測(cè)方法的靈敏度可達(dá)0.8 IU/mL，與牛FMDV-O、FMDV-A、BVDV、IBRV 等病原抗體均無(wú)交叉反應(yīng)，特異性良好。利用建立的方法對(duì)469 份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)結(jié)果與熒光偏振檢測(cè)結(jié)果符合率為100%。研究表明，本研究建立的方法靈敏度高，特異性好，適用于臨床樣品的快速檢測(cè)。

本研究建立的這種新型布魯氏菌抗體快速檢測(cè)方法，其靈敏度高于傳統(tǒng)ELISA 及熒光偏振檢測(cè)法，對(duì)疫苗免疫效果評(píng)估及布病凈化有一定意義。但對(duì)于牛布病的防控與凈化，仍需建立能準(zhǔn)確鑒別自然感染與疫苗免疫抗體的檢測(cè)方法，并通過(guò)多種檢測(cè)方法聯(lián)用，構(gòu)建完善的流行病學(xué)調(diào)查工具以及防控與凈化檢測(cè)系統(tǒng)，從而更好地保護(hù)人類生命及財(cái)產(chǎn)安全。