張 學(xué)，黃紅英，趙順程，李 欣

抑郁癥是一種常見的情感異常類疾病，以持久的情緒低落為主要特征，嚴(yán)重者可導(dǎo)致自殺[1]，并且其患病率逐年增加，嚴(yán)重威脅人類健康和生活質(zhì)量[2]。藥物治療、物理治療和心理治療是目前抑郁癥治療的重要方式，但存在一定的局限性，導(dǎo)致治療效果欠佳[3]。抑郁癥的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，與海馬神經(jīng)元異常凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥損傷等密切相關(guān)[4-7]。異鉤藤堿是從傳統(tǒng)中藥鉤藤中提取的一種四環(huán)羥吲哚生物堿，具有抗心血管疾病和保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)的作用[8]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)，異鉤藤堿可通過減輕神經(jīng)炎癥和增加神經(jīng)營養(yǎng)素發(fā)揮抗抑郁作用[9]，但其對神經(jīng)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響并不清楚。為此本研究通過觀察異鉤藤堿對抑郁小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響，并探討其可能的分子機(jī)制，旨在為異鉤藤堿抗抑郁的應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 體重20～25 g的24只清潔級SD雄性小鼠，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK(黑)2017-007。異鉤藤堿(上海源葉生物公司生產(chǎn)，純度≥98%，批號：B21526)，鹽酸氟西汀分散片(禮來公司生產(chǎn)，規(guī)格：每片20 mg，批號：J20160029)，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)和β-actin抗體購自Abcam公司，c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷酸化JNK(p-JNK)購自美國Santa Cruz公司，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測定法(terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組、抑郁模型制備和給藥 將24只小鼠隨機(jī)分為異鉤藤堿組、陽性對照組、模型組和對照組(正常飼養(yǎng))，每組6只；異鉤藤堿組、陽性對照組、模型組小鼠采用慢性輕度不可預(yù)見性溫和應(yīng)激法[7]制備抑郁小鼠模型，具體刺激方法為每天隨機(jī)給予一種應(yīng)激，包括禁食24 h、禁水24 h、晝夜顛倒24 h、鼠籠45 ℃傾斜24 h、夾尾1 min、4 ℃冰水游泳5 min、45 ℃ 熱水游泳5 min，持續(xù)28 d，并且每3天的應(yīng)激不重復(fù)。造模完成后，異鉤藤堿組小鼠給予40 mg/kg異鉤藤堿[9]灌胃，陽性對照組小鼠給予20 mg/kg氟西汀灌胃，而模型組和對照組小鼠給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)干預(yù)21 d。對照組正常飼養(yǎng)。通過小鼠糖水偏好實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)確定建模情況。

1.3 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 干預(yù)結(jié)束后，4組大鼠給予1%糖水適應(yīng)訓(xùn)練：放置2瓶1%糖水在籠子內(nèi)，24 h后將其中1瓶更換為純水，繼續(xù)放置24 h。適應(yīng)完成后，斷水24 h，而后開始實(shí)驗(yàn)：放置1瓶1%糖水和1瓶純水在籠子內(nèi)，24 h后稱取糖水和純水的消耗量，并計算糖水偏好百分比，糖水偏好百分比=糖水消耗量/(純水消耗量+糖水消耗量)×100%。

1.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 在實(shí)驗(yàn)前1 d，將小鼠放入規(guī)格為20 cm×70 cm且盛有25 ℃溫水的透明水缸中，使其適應(yīng)性游泳6 min；次日，將小鼠放入水中，適應(yīng)2 min后，記錄后4 min內(nèi)小鼠游泳不動時間。

1.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠收集海馬組織，取30 mg海馬組織，加入磷酸緩沖液研磨成漿后，采用BCA法檢測勻漿中總蛋白濃度。參照GSH-Px、MDA和SOD試劑盒說明書檢測4組小鼠海馬中GSH-Px、MDA和SOD水平。

1.6 TUNEL法檢測海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡 將海馬組織以4%多聚甲醛固定2 h后，常規(guī)石蠟包埋制成4 μm的石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟和乙醇脫水后，參照TUNEL試劑盒說明書檢測4組小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況。

1.7 免疫印跡法檢測海馬組織中Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、JNK和p-JNK蛋白表達(dá) 取海馬組織30 mg，加入適量RIPA裂解液，冰上裂解，離心抽提總蛋白，采用BCA法對總蛋白定量測定。取50 μg蛋白進(jìn)行加樣，行12%電泳分離蛋白樣品。結(jié)束后采用半干法電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。封膜2 h，以Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、JNK和p-JNK抗體4 ℃下孵育12 h；次日，以辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫雜交2 h，顯影，曝光，以β-actin標(biāo)定，獲取圖像后分析4組小鼠海馬組織中Bcl-2、Bax、Cleaved Caspase-3、JNK和p-JNK蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 4組小鼠糖水偏好百分比和強(qiáng)迫游泳不動時間比較 與對照組比較，模型組小鼠糖水偏好百分比明顯降低(P<0.05)，強(qiáng)迫游泳不動時間明顯延長(P<0.05)；與模型組比較，異鉤藤堿組和陽性對照組小鼠糖水偏好百分比明顯升高(P<0.05)，而強(qiáng)迫游泳不動時間明顯縮短(P<0.05)；異鉤藤堿組糖水偏好百分比、強(qiáng)迫游泳不動時間與陽性對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 4組小鼠糖水偏好百分比和強(qiáng)迫游泳不動時間比較(±s)

2.2 4組小鼠海馬中SOD、MDA和GSH-Px水平比較 與對照組比較，模型組小鼠海馬中SOD和GSH-Px水平明顯降低(P<0.05)，MDA水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，異鉤藤堿組和陽性對照組小鼠海馬中SOD和GSH-Px水平明顯升高(P<0.05)，而MDA水平明顯降低(P<0.05)；與陽性對照組比較，異鉤藤堿組小鼠海馬中SOD、MDA和GSH-Px水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 4組小鼠海馬中SOD、MDA和GSH-Px水平比較(±s)

2.3 4組小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)比較 與對照組比較，模型組小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多(P<0.05)；與模型組比較，異鉤藤堿組和陽性對照組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少(P<0.05)，與陽性對照組比較，異鉤藤堿組神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 4組小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)比較(±s)

2.4 4組小鼠海馬中Bcl-2、Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較 模型組與對照組比較，模型組小鼠海馬組織中Cleaved Caspase-3和Bax 蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，異鉤藤堿組和陽性對照組Bax和Cleaved Caspase-3的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，而Bcl-2的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與陽性對照組比較，異鉤藤堿組中Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3的表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖1、表4。

圖1 免疫印跡法檢測海馬中Bcl-2、Bax和Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)

表4 4組小鼠海馬中Bcl-2、Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平比較(±s)

2.5 4組小鼠海馬中JNK和p-JNK蛋白表達(dá)水平比較 對照組、模型組、陽性對照組和異鉤藤堿組海馬組織中JNK蛋白表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與對照組比較，模型組中p-JNK表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，陽性對照組和異鉤藤堿組p-JNK蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組(P<0.05)，陽性對照組p-JNK蛋白表達(dá)水平與異鉤藤堿組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖2、表5。

圖2 免疫印跡法檢測海馬中JNK和p-JNK蛋白的表達(dá)

表5 4組小鼠海馬中JNK和p-JNK蛋白表達(dá)水平比較(±s)

3 討 論

慢性輕度不可預(yù)見性溫和應(yīng)激法是構(gòu)建抑郁模型的常用方法[10-12]，本研究采用該法建模后發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠糖水偏好百分比明顯降低，然而強(qiáng)迫游泳不動時間明顯延長；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小鼠出現(xiàn)了明顯的抑郁行為，抑郁模型構(gòu)建成功。在建?；A(chǔ)上，給予異鉤藤堿治療后，小鼠的抑郁行為明顯得到改善。這與Xian等[13]研究所得出的異鉤藤堿具有抗抑郁的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。本研究進(jìn)一步證實(shí)了異鉤藤堿的抗抑郁作用。

氧化應(yīng)激與抑郁癥的發(fā)生密切相關(guān)，其可引起神經(jīng)細(xì)胞損傷，影響神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺的表達(dá)，造成抑郁行為的產(chǎn)生[7]。MDA是一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其水平可反映脂質(zhì)過氧化損傷的程度；SOD和GSH-Px是重要的抗氧化酶，能夠有效清除機(jī)體自由基[14-15]。有研究報道，異鉤藤堿可通過調(diào)控細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal reguluated kinase，ERK)1/2和糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)途徑抑制1-甲基-4-苯基吡啶誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠海馬中SOD和GSH-Px水平明顯降低，而MDA水平明顯升高；給予異鉤藤堿后SOD和GSH-Px水平明顯升高，而MDA水平明顯降低。這表明異鉤藤堿可抑制抑郁小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。提示異鉤藤堿抗抑郁作用可能與其抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激有關(guān)。

海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的重要組織，在情感、記憶和內(nèi)分泌整合等過程中起著重要作用；海馬神經(jīng)元丟失可引起海馬腦區(qū)萎縮，進(jìn)而影響神經(jīng)可塑性，導(dǎo)致抑郁發(fā)生[17]。神經(jīng)細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致神經(jīng)元丟失的重要方式之一，因此，減少海馬神經(jīng)細(xì)胞的過度凋亡對改善抑郁具有重要意義。Bcl-2和Bax是Bcl-2基因家族成員，前者是凋亡抑制基因，后者為促凋亡基因，兩者均在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用；Caspase-3是重要的凋亡執(zhí)行因子，Caspase-3切割(cleaved)活化后，在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的作用[18-19]。有研究指出，在阿爾茨海默病中，異鉤藤堿不僅可通過減少M(fèi)DA水平和增加SOD、GSH-Px水平發(fā)揮抗神經(jīng)PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)外，還可通過增強(qiáng)Bcl-2表達(dá)和抑制Bax、Caspase-3表達(dá)發(fā)揮抑制神經(jīng)PC12細(xì)胞凋亡的作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，抑郁模型小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增多，且海馬組織中Bcl-2蛋白表達(dá)減少，而Cleaved Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)明顯增多；給予異鉤藤堿治療后，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡明顯減少；同時，Cleaved Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯升高。結(jié)果表明，異鉤藤堿可通過調(diào)控Bcl-2、Bax和Cleaved Caspase-3表達(dá)發(fā)揮抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的作用。提示異鉤藤抗抑郁作用可能與其抑制海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡有關(guān)。

JNK是絲裂原激活的蛋白激酶家族成員，有研究顯示，JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與多種疾病(包括抑郁癥)的發(fā)生和進(jìn)展[21-22]。有研究表明，在抑郁癥中，JNK信號通路異常激活不僅通過調(diào)控Bcl-2和Bax等表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡；還能夠促進(jìn)活性氧以及與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)的環(huán)氧化酶-2和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的產(chǎn)生，加重氧化應(yīng)激損傷；干預(yù)JNK信號通路被認(rèn)為是抑郁癥研究和治療的新靶標(biāo)[23]。有研究顯示，異鉤藤堿可通過抑制JNK通路減弱1-甲基-4-苯基吡啶誘導(dǎo)神經(jīng)PC12細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激而發(fā)揮帕金森病神經(jīng)保護(hù)作用[24]。本研究在抑郁小鼠模型中發(fā)現(xiàn)p-JNK蛋白表達(dá)水平明顯升高，JNK信號通路異常激活；給予異鉤藤堿治療后p-JNK蛋白表達(dá)水平降低，JNK信號通路的活化明顯受到抑制。表明異鉤藤堿具有抑制JNK信號通路活化的作用，提示異鉤藤堿可能通過抑制JNK信號通路活化抑制海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷而發(fā)揮抗抑郁作用。

綜上所述，異鉤藤堿可通過抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激改善抑郁小鼠的抑郁行為，其作用機(jī)制可能與抑制JNK信號通路活化有關(guān)。該結(jié)果進(jìn)一步揭示了異鉤藤堿抗抑郁的分子機(jī)制，為異鉤藤堿成為臨床抗抑郁藥物提供了新的參考依據(jù)。