張東霞，張火旺

（廣東省河源市藥品檢驗(yàn)所，廣東 河源 517000）

復(fù)方半夏片由姜半夏、麻黃、遠(yuǎn)志、桔梗、前胡、陳皮、白前、款冬花、細(xì)辛9味中藥組方。方中，陳皮為蕓香科植物橘Citrus reticulataBlanco 及其栽培變種的干燥成熟果皮，具有理氣健脾、燥濕化痰功效，常用于治療脘腹脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多等；款冬花為菊科植物款冬Tussilago farfaraL. 的干燥花蕾，具有潤(rùn)肺下氣、止咳化痰功效，常用于治療新舊咳嗽、喘咳痰多、勞嗽咳血等［1］199-200，346-347。橙皮苷是陳皮和款冬花的主要有效成分，為二氫黃酮衍生物，在提高人體免疫力、抗炎、抗菌、抗病毒、保護(hù)心血管系統(tǒng)等方面具有重要作用［2］?！吨腥A人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑（第三冊(cè)）》WS3-B-0581-91 中僅有鑒別項(xiàng)［3］，難以控制其質(zhì)量。為有效控制含橙皮苷的藥品質(zhì)量［4-16］，本研究中建立了測(cè)定復(fù)方半夏片中橙皮苷含量的高效液相色譜法。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC - 20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；CPA225D 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器< 北京> 有限公司，精度為十萬(wàn)分之一）；DTC-15F 型超聲波清洗機(jī)（湖北鼎泰生化科技設(shè)備制造有限公司，功率為300 W，頻率為40 kHz）；UPW-20N型超純水器（北京歷元電子儀器有限公司）。

1.2 試藥

橙皮苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110721-202019，純度≥95.3%）；復(fù)方半夏片（河源市源城區(qū)譽(yù)盛大藥房，批號(hào)分別為210301028，210601015，210701036）；乙腈、磷酸均為色譜純，甲醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Capcell PAK C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈 -0.1%磷酸水溶液（20∶80，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 溶液制備

取橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得質(zhì)量濃度為0.206 6 mg/mL的對(duì)照品溶液。取樣品10 片，研細(xì)，取1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為300 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，用0.45μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方及工藝［3］制備缺陳皮和款冬花陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別吸取2.2 項(xiàng)下3 種溶液各適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，供試品溶液色譜圖中，在與對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處有相應(yīng)吸收峰，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。橙皮苷峰理論板數(shù)均大于6 000，分離度均大于2。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液1，3，5，7，10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1 708 158.63X+10 857.02（r= 1.000，n =5）。結(jié)果表明，橙皮苷進(jìn)樣量在0.206 6～2.066 0 μg 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液5μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.06%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為210301028）樣品適量，共6 份，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果橙皮苷含量的RSD為0.44%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為210301028）樣品適量，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，12 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.03%（n=5），表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為210301028）0.75 g，精密稱定，共 6 份，置 25 mL 容量瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為1.406 0，2.812 0，4.218 0 mg/mL的對(duì)照品溶液，平行2 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取 3 批（批 號(hào) 分 別 為 210301028，210601015，210701036）樣品各適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算樣品含量，每批樣品測(cè)3次，取平均值。結(jié)果樣品中橙皮苷含量分別為3.751 3，3.165 9，3.968 2 mg/g（n=3），故暫定復(fù)方半夏片中橙皮苷定量限為3.0 mg/g。

3 討論

3.1 提取方法選擇

以甲醇為溶劑，分別對(duì)同一批（批號(hào)為210301028）樣品超聲提取30，45，60 min。結(jié)果超聲30 min 和45 min時(shí)橙皮苷的含量較高，提取效果差異不明顯。故認(rèn)為在超聲30 min時(shí)可基本提取完全。

3.2 流動(dòng)相選擇

以橙皮苷常用流動(dòng)相乙腈-水溶液、甲醇-醋酸-水溶液、乙腈- 0.1%磷酸水溶液進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)橙皮苷能與其他組分的色譜峰很好地分離，分離度符合要求，且峰形對(duì)稱而尖銳，理論板數(shù)達(dá)到6 000 以上。故確定乙腈 -0.1%磷酸水溶液（20∶80，V/V）為流動(dòng)相。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

采用二極管陣列檢測(cè)器，在190～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)橙皮苷對(duì)照品溶液進(jìn)行掃描，結(jié)果在283 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，與2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》［1］199中橙皮苷的測(cè)定波長(zhǎng)一致。故確定283 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的HPLC 法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好，可用于復(fù)方半夏片的質(zhì)量控制。