楊 亮 ，王 超 ，章子臻 ，張 彥 ，陶 瑞 ，耿嘉浩 ，董 艷 ，王紫翰 ，胡慧子 ，儲兆億 ，馬增春 ，洪 倩

（1. 徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮海醫(yī)院·中國人民解放軍陸軍第七十一集團(tuán)軍醫(yī)院，江蘇 徐州 221004； 2. 合肥師范學(xué)院化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 合肥 230601； 3. 吉林敖東醫(yī)藥有限責(zé)任公司，吉林 延吉 133700； 4. 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院，北京 100850）

小兒柴桂退熱口服液主要成分為柴胡、桂枝、黃芩，具有發(fā)汗解表、清里退熱功效，對三聯(lián)菌致發(fā)熱模型家兔和酵母菌致發(fā)熱模型大鼠均有明顯的解熱作用，對小鼠耳腫脹、大鼠足腫脹和毛細(xì)血管通透性等有抑制作用，抗炎作用顯著［1］。此外，還具有顯著的抗病毒作用，能明顯降低小鼠熱痛反應(yīng)和醋酸致小鼠抱體反應(yīng)次數(shù)，提高小鼠單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬功能及血清溶血素水平，可用于鎮(zhèn)痛和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能［2］。中藥復(fù)方對新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）患者的康復(fù)有重要作用［3］。脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠肺組織感染模型與臨床病毒感染相似，是模擬新型冠狀病毒感染的理想替代動(dòng)物模型［4-5］。核轉(zhuǎn)錄因子 - κB（NF- κB）蛋白最早是由David Baltimore 發(fā)現(xiàn)，該蛋白家族可選擇性地結(jié)合在B 細(xì)胞κ - 輕鏈增強(qiáng)子上調(diào)控許多基因的表達(dá)。幾乎所有動(dòng)物細(xì)胞中都能發(fā)現(xiàn)NF - κB，其參與細(xì)胞對外界刺激的響應(yīng)，如細(xì)胞因子、輻射、病毒等。免疫細(xì)胞通過Toll 樣受體（TLR）、視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白I（RIG - I）樣受體（RLR）、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域（NOD）樣受體（NLR）等模式識別受體（PRR）對機(jī)體內(nèi)環(huán)境的變化進(jìn)行免疫監(jiān)視，實(shí)現(xiàn)固有免疫系統(tǒng)功能。NLR 家族是位于胞質(zhì)內(nèi)的一類PRR，可識別病原相關(guān)分子模式或損傷相關(guān)分子模式，與銜接蛋白結(jié)合形成致密的蛋白復(fù)合體，即炎性小體，誘導(dǎo)半胱氨酸活化酶1（Caspase-1）剪切活化［6］，活化的 Caspase-1可促進(jìn)炎性因子白細(xì)胞介素1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素18（IL-18）加工、成熟和分泌，并介導(dǎo)細(xì)胞焦亡?；罨腘OD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）炎性小體在各種病原體感染、腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用［7］。因此，本研究中探討了小兒柴桂口服液對LPS誘導(dǎo)肺損傷模型小鼠的作用及機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：NIKON E80i型顯微鏡（尼康儀器<上海>有限公司）；HF90 型37 ℃恒溫箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；FC5515R 型微量高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司）；85-2型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（常州普天儀器制造有限公司）；EPS 300 型電泳儀（北京中西華大科技有限公司）；DS-H200 型水平搖床（武漢塞維爾生物科技有限公司）；DW - 86L626 型醫(yī)用低溫冰箱、BCD - 248W 型普通冰箱（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司）；IMS - 20 型制冰機(jī)（上海燕豐廚業(yè)有限公司）；GDSFJ 型酶標(biāo)儀（三豐精密量儀有限公司）；5200 Multi 型化學(xué)發(fā)光成像儀（上海天能科技有限公司）；BC-2800 vet 型邁瑞獸用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）。

試藥：LPS（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號為J2111625）；小兒柴桂退熱口服液（吉林敖東藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號為2107005）；連花清瘟膠囊（石家莊以嶺藥業(yè)有限股份公司，批號為A2111057）；蘇木素-伊紅染液（HE，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號為081120201016）；腫瘤壞死因子 - α（TNF- α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號為DG30048M -96），IL-1β ELISA試劑盒（批號為DG30045M-96），均購自北京東歌博業(yè)生物科技有限公司；超敏增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號為CR2120085）；甘油醛 - 3- 磷酸脫氫酶（GAPDH，批號為 301341）；NF - κB（批號為 ab32536），NLRP3（批號為ab263899），IL - 1β（批號為ab254360），均購自艾博抗上海貿(mào)易有限公司。

動(dòng)物：60只雄性KM 小鼠，體質(zhì)量（20 ± 2）g，購于安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號為SYXK（皖）2020 - 001，飼養(yǎng)于12 h/ 12 h 明暗交替、溫度23～25 ℃的環(huán)境中。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)合肥師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會審批，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)符合動(dòng)物倫理要求，實(shí)驗(yàn)操作人員經(jīng)過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)考核合格。

1.2 方法

分組、建模與給藥：按隨機(jī)數(shù)字表法將60只小鼠分為空白對照組（A組），模型對照組（B組），小兒柴桂口服液低、中、高劑量組（C1組、C2組、C3組），陽性對照組（D 組），各10 只。除A 組外，其余各組小鼠均一次性尾靜脈注射LPS 5 mg/kg，以建立肺損傷模型。D組小鼠灌胃溶于生理鹽水的連花清瘟膠囊5 mg/kg，C1組、C2組、C3組小鼠分別灌胃8，16，32 mg/ kg 小兒柴桂口服液，A組和B組小鼠灌胃等量生理鹽水，均連續(xù)給藥3 d。

肺組織干/濕質(zhì)量比測定：取肺組織適量，稱定質(zhì)量，即為濕重；60 ℃烘干72 h，稱定質(zhì)量，即為干重。干/濕質(zhì)量比（%）=干重/濕重×100%。

血液常規(guī)分析：采用BC-2800vet 型邁瑞獸用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀檢測各組小鼠的血常規(guī)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（NEUT）、紅細(xì)胞比容（HCT）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、血紅蛋白（Hb）、紅細(xì)胞分布寬度變異系數(shù)（RDW-CV）、紅細(xì)胞分布寬度的標(biāo)準(zhǔn)差（RDW -SD）、淋巴細(xì)胞（LYMPH）、單核細(xì)胞（MONO）、嗜堿性粒細(xì)胞（BASO）。

小鼠肺組織病理變化觀察：每組隨機(jī)選取3 只小鼠，取肺組織，用4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋并制作厚度為1 mm 的切片，用HE 染色，顯微鏡下觀察肺組織的病理變化。

炎性因子水平測定：按ELISA試劑盒說明書測定各組小鼠血漿中炎性因子TNF-α和IL-1β的水平。

免疫印跡（Western blot）法檢測小鼠肺相關(guān)蛋白表達(dá)水平：每組隨機(jī)選取3 只小鼠，取肺組織，提取總蛋白，BCA 法檢測總蛋白含量。進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS - PAGE），300 mA 轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入GAPDH（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、NF- κB（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000）一抗，4 ℃下孵育過夜，TBST 洗滌 3 次，每次 5 min，加入二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，最后加入ECL 超敏發(fā)光液，曝光，使用Image J軟件統(tǒng)計(jì)灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肺干/濕質(zhì)量比

與A 組比較，B 組小鼠肺組織干/濕質(zhì)量比顯著降低（P<0.01）；與B組比較，C2組、C3組、D組小鼠肺組織干/濕質(zhì)量比均顯著升高（P<0.01）。詳見圖1。

圖1 小兒柴桂退熱口服液對脂多糖致肺損傷模型小鼠肺干/濕質(zhì)量比的影響Fig.1 Effect of Xiaoer Chaigui Antipyretic Oral Liquid on the dry/wet weight ratio of lung tissue of LPS-induced lung injury model mice

2.2 肺組織形態(tài)及病理變化

B 組小鼠肺組織水腫程度明顯，表面有斑點(diǎn)形成，出現(xiàn)滲出、水腫或炎性浸潤；D 組小鼠腸道組織炎性浸潤損傷程度顯著降低；與B 組比較，C1組、C2組、C3組小鼠腸道組織炎性癥狀均有減輕，表明小兒柴桂退熱口服液能抑制LPS 誘導(dǎo)的肺損傷模型小鼠肺組織的急性損傷。詳見圖2。

圖2 小兒柴桂退熱口服液對脂多糖致肺損傷模型小鼠肺組織形態(tài)學(xué)的影響（n = 3）Fig.2 Effect of Xiaoer Chaigui Antipyretic Oral Liquid on the morphological changes of lung tissue of LPS-induced lung injury model mice（n=3）

2.3 血液生化指標(biāo)

與 A 組比較，B 組小鼠外周血 WBC，PLT，LYMPH水平均顯著降低，HCT 和NEUT 比例（NEUT%）水平均顯著升高（P<0.05）；與B 組比較，C2組、C3組小鼠外周血WBC，PLT，LYMPH 水平均顯著升高，HCT 和NEUT%均顯著降低（P<0.05），表明小兒柴桂退熱口服液能顯著增加LPS 誘導(dǎo)肺損傷模型小鼠的WBC，PLT，LYMPH數(shù)量，且呈量效正相關(guān)；C2組、C3組的作用強(qiáng)度均優(yōu)于D組。詳見表1。

表1 小兒柴桂退熱口服液對脂多糖致肺損傷模型小鼠血漿中血液生化指標(biāo)的影響（）Tab.1 Effect of Xiaoer Chaigui Antipyretic Oral Liquid on the blood biochemical indexes in plasma of LPS - induced lung injury model mice（）

表1 小兒柴桂退熱口服液對脂多糖致肺損傷模型小鼠血漿中血液生化指標(biāo)的影響（）Tab.1 Effect of Xiaoer Chaigui Antipyretic Oral Liquid on the blood biochemical indexes in plasma of LPS - induced lung injury model mice（）

指標(biāo)WBC（× 109/L）NEUT%MONO%BASO%NEUT（× 109/L）LYMPH（× 109/L）MONO（× 109/L）BASO（× 109/L）Hb（g/L）HCT（%）RDW-CV（%）RDW-SD（fL）PLT（× 109/L）A組4.41±1.19 5.47±3.87 3.88±7.14 8.52±3.13 0.22±0.18 3.53±1.14 0.19±0.39 0.37±0.17 179.75±35.07 50.75±8.99 23.13±2.70 30.43±2.04 209.38±98.24 B組1.16±0.82*20.21±13.33*6.11±3.59*11.20±7.06*0.28±0.39 0.71±0.45*0.06±0.03*0.11±0.07*191.75±10.33 71.98±49.39*24.98±1.99 30.71±11.37 124.75±23.81*C1組C2組C3組2.17±0.91 28.26±13.81 6.31±3.18 10.31±7.64 0.52±0.26 1.03±0.42#0.11±0.06 0.21±0.16 138.63±14.77 40.81±3.84#19.61±2.13 29.83±2.27 187.25±46.40#2.74±1.2#18.22±5.62#4.33±3.7#11.84±7.98 0.41±0.14 1.47±0.32#0.10±0.09 0.33±0.28#137.25±10.42 40.65±3.07#19.46±1.81 28.84±2.91 205.63±96.98#2.28±0.81#15.64±11.01#3.39±1.99#13.41±9.54 0.36±0.26 1.38±0.49#0.07±0.05 0.26±0.2 136.50±5.88 40.38±1.77#19.85±0.97 29.56±2.44 208.50±65.61#D組1.54±0.85#13.32±2.68#2.69±0.81#11.48±2.23 0.31±0.06 0.93±0.52#0.06±0.01 0.23±0.04 71.19±75.41 21.07±22.29 10.41±10.90 16.00±15.66 137.05±82.50

2.4 血漿中炎性因子水平

與 A 組比較，B 組小鼠血漿中炎性因子 IL - 1β 和TNF- α 表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）；與B 組比較，C1組、C2組、C3組小鼠血漿中IL-1β 和TNF- α 表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），表明小兒柴桂退熱口服液能顯著增加LPS誘導(dǎo)的肺損傷模型小鼠的炎性變化，且呈量效正相關(guān)；C2組的作用強(qiáng)度與D 組相當(dāng)，C3組的作用強(qiáng)度優(yōu)于D組。詳見圖3。

圖3 小兒柴桂退熱口服液對脂多糖致肺損傷模型小鼠血漿中炎性因子水平的影響Fig.3 Effect of Xiaoer Chaigui Antipyretic Oral Liquid on the inflammatory factor levels in plasma of LPS-induced lung injury model mice

2.5 肺組織中NF-κB/NLRP3 通路蛋白表達(dá)水平

與 A 組比較，B 組小鼠肺組織中 NLRP3，NF - κB，IL-1β 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）；與B 組比較，C2組、C3組、D 組小鼠肺組織中 NLRP3 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P< 0.05），C1組、C2組、C3組、D 組小鼠肺組織中NF-κB 和IL-1β 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P< 0.05），表明小兒柴桂退熱口服液可能通過抑制NF- κB 和 IL-1β 蛋白介導(dǎo)的 NLRP3 蛋白活化通路而改善LPS誘導(dǎo)的肺損傷模型小鼠的肺部損傷。詳見圖4。

圖4 小兒柴桂退熱口服液對脂多糖致肺損傷模型小鼠肺組織中NF-κB/NLRP3通路蛋白表達(dá)水平的影響Fig.4 Effect of Xiaoer Chaigui Antipyretic Oral Liquid on the expression level of NF-κB/NLRP3 pathway protein in lung tissue of LPS-induced lung injury model mice

3 討論

小兒柴桂退熱口服液是臨床常用中藥制劑，具有發(fā)汗解表、清里退熱作用。方中，柴胡、葛根藥性辛涼，可升陽解肌、退熱透疹；桂枝、白芍解肌發(fā)熱，益陰斂營，調(diào)和營衛(wèi)；黃芩清邪郁所化之熱；蟬蛻、浮萍退肺熱，清里退熱。諸藥合用，共奏清熱利濕、解毒透疹功效［8］。LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷動(dòng)物模型可最大限度地表征COVID - 19 感染引起的肺損傷，誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)與其濃度呈劑量依賴效應(yīng)［9］。在較低濃度下，LPS 濃度升高會促進(jìn)機(jī)體抗氧化能力上升，但細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御體系仍不能阻止LPS對蛋白質(zhì)的氧化損傷。參考文獻(xiàn)［10 - 13］，本研究中以小鼠尾靜脈注射5 mg/ kg LPS 建立肺炎模型，組內(nèi)差異小。本研究結(jié)果顯示，與A 組比較，B 組小鼠肺組織干/濕質(zhì)量比和WBC 均顯著降低；與B 組比較，C2組和C3組小鼠肺組織病理損傷改善顯著提高?？赡芘c柴胡具有抑菌殺菌、抗病毒作用，葛根具有增強(qiáng)人體免疫力等作用［14］，黃芩具有廣泛的抗菌作用有關(guān)。

NF-κB 在細(xì)胞的炎癥、免疫應(yīng)答等過程中均起關(guān)鍵性作用，若錯(cuò)誤調(diào)節(jié)會引發(fā)自身免疫性疾病、慢性炎癥及癌癥，同時(shí)與突觸的可塑性、記憶有關(guān)［15］。NF-κB家族蛋白包括同源性或異源性二聚體轉(zhuǎn)錄因子，能與免疫球蛋白κ 輕鏈基因增強(qiáng)子B 位點(diǎn)特異性結(jié)合，廣泛存在于各種細(xì)胞中，在細(xì)胞受到病毒或細(xì)菌感染、氧自由基、DNA 損傷、細(xì)胞因子、LPS、紫外線照射等因素刺激后可被活化，通過參與一系列免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)，調(diào)控細(xì)胞及凋亡的基因轉(zhuǎn)錄（如細(xì)胞因子、生長因子、趨化因子、黏附分子、免疫受體基因），影響體內(nèi)的細(xì)胞分化、炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)、腫瘤生長、細(xì)胞凋亡等［16］。作為炎癥的中央調(diào)節(jié)因子，NF - κB 控制趨化因子、細(xì)胞因子、促炎黏附分子和促炎轉(zhuǎn)錄因子的基因轉(zhuǎn)錄，激活的NF-κB 可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，并與促炎基因的啟動(dòng)子結(jié)合，導(dǎo)致基因表達(dá)增強(qiáng)和炎性反應(yīng)擴(kuò)增，最終導(dǎo)致組織炎性損傷［17］。因此，阻斷NF- κB 轉(zhuǎn)錄活性可能是治療炎性疾病的重要靶點(diǎn)。研究表明，NF - κB 活化水平的免疫調(diào)節(jié)、NF- κB 降解抑制劑、TNF- α 的抑制可能會導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴減少，并減輕COVID- 19 的嚴(yán)重程度，故抑制NF - κB 通路在緩解 COVID - 19 的嚴(yán)重程度方面具有潛在作用［18］。

NLR家族是一類位于胞質(zhì)內(nèi)的PRR，可與銜接蛋白和 Caspase - 1 結(jié)合形成炎性小體，如 NLRP1，NLRP3，NLRP7等。其中，NLRP3炎性小體活化需2個(gè)信號。信號1通過配體活化TLR，通過激活NF-κB 等方式介導(dǎo)胞內(nèi)NLRP3 和 IL-1β 前體表達(dá)上調(diào)；信號2 通過病原相關(guān)分子模式或損傷相關(guān)分子模式刺激經(jīng)信號1 刺激過的細(xì)胞，活化NLRP3。而活化的NLRP3炎性小體在各種病原體感染、腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用［19］。本研究結(jié)果顯示，B 組小鼠體內(nèi) NF - κB 和NLRP-3 蛋白水平均較 A 組顯著升高，C2組、C3組小鼠體內(nèi)的 NF- κB 和 NLRP- 3 蛋白水平均較 B 組顯著降低（P< 0.05）。此外，為全面考察小兒柴桂退熱口服液對LPS誘導(dǎo)肺損傷模型小鼠肺組織損傷的干預(yù)作用，考察了各組小鼠的血液生化指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)C2組、C3組小鼠的WBC，PLT，LYMPH，HCT，NEUT%水平均較B 組顯著改善（P< 0.05），且呈量效正相關(guān)。提示應(yīng)關(guān)注上述指標(biāo)在肺損傷患者臨床治療過程中的變化。

綜上所述，小兒柴桂退熱口服液可改善LPS誘導(dǎo)的肺損傷模型小鼠的肺組織損傷，其作用機(jī)制可能與調(diào)控NF-κB介導(dǎo)的NLRP3通路有關(guān)。