李鑫月， 曾夢秋， 劉 云， 張 斌， 張海華， 李紅強，2

[1.河北科技師范學(xué)院動物科技學(xué)院，河北昌黎 066600；2.河北省特色動物種質(zhì)資源挖掘與創(chuàng)新重點實驗室(籌)，河北昌黎 066600]

肥胖可誘發(fā)糖尿病等與脂代謝相關(guān)的疾病[1]，導(dǎo)致肥胖最常見的原因是高脂飲食，因此可通過間歇性禁食來干預(yù)肥胖[2]，合理的間歇性禁食在維持肥胖個體葡萄糖穩(wěn)態(tài)和減脂減重等方面起到重要作用[3]。研究表明，腸道微生物群在能量穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，其結(jié)構(gòu)失調(diào)可導(dǎo)致肥胖[4]，而間歇性禁食可通過調(diào)節(jié)動物腸道菌群的結(jié)構(gòu)來改善腸道微生物環(huán)境。腸道微生物有特定的生活節(jié)律，特定時間禁食可打破腸道微生物平衡[5]，為研究禁食對腸道微生物影響提供了方向。腸道微生物種類繁多[6]，包括糞腸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、鏈球菌等，其中糞腸球菌和乳酸桿菌作為乳酸菌的一類，在維持腸道正常生理狀況方面發(fā)揮著不同的作用。

糞腸球菌(Enterococcus)屬于腸球菌屬，為革蘭氏陽性(G+)球菌，普遍存在于大自然中，可作益生菌，也可視為有害菌。在畜牧生產(chǎn)中，腸球菌常被制成益生菌添加劑來調(diào)節(jié)動物腸道菌群，如Pajarillo等給豬喂養(yǎng)2周糞腸球菌，發(fā)現(xiàn)豬腸道細(xì)菌的多樣性和豐富度提高[7]；孔祎等研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加適量糞球桿菌可促進(jìn)烏鱧生長[8]，因此糞腸球菌作為腸道益生菌群的一部分，在動物飼養(yǎng)和保護(hù)腸道生態(tài)平衡中有重要作用[9-10]。此外，糞腸球菌可以作為抗生素的替代品來促進(jìn)動物生長，減少因過度使用抗生素導(dǎo)致動物的耐藥性和有效性損失[11]。同時，糞腸球菌還可引起感染性疾病，如加重上呼吸道感染等癥狀[12]?？梢?，糞腸球菌具有一定的耐藥性[13]。乳酸桿菌(Lactobacillaceae)屬于乳桿菌屬，為革蘭氏染色陽性厭氧菌，有時也需氧，不產(chǎn)生芽孢，在調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、促進(jìn)機(jī)體生長和增強機(jī)體免疫等方面具有重要的作用[14-15]。在畜牧生產(chǎn)中，乳酸桿菌常被制成益生菌添加劑來調(diào)節(jié)動物腸道菌群，如汪昭睿等研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌可降低仔豬的腹瀉率，促進(jìn)仔豬生長，并改善其腸道菌群穩(wěn)態(tài)[14]；鄧軍等給仔豬喂養(yǎng)含乳酸桿菌的飼料發(fā)現(xiàn)，豬腸道絨毛發(fā)育得到改善，仔豬的抗感染能力得到提高[15]。這說明了乳酸桿菌可作為益生菌調(diào)節(jié)機(jī)體腸道微生物穩(wěn)態(tài)，抑制外來細(xì)菌生長，并刺激腸道產(chǎn)生保護(hù)其自身的黏液物質(zhì)，形成良好的保護(hù)膜[16]。

在使用糞腸球菌和乳酸桿菌時，應(yīng)全面考慮其利弊并合理使用。若將糞腸球菌和乳酸桿菌添加進(jìn)飼料中或?qū)⑵渲瞥梢嫔砑觿枰訃?yán)格的安全檢測和評價機(jī)制。因此，本研究通過對高脂小鼠進(jìn)行0 ∶24 h、12 ∶12 h、16 ∶8 h等3種間歇性禁食方式處理，以禁食后的新鮮小鼠糞便為材料，分離糞腸球菌和乳酸桿菌，以探究不同禁食時間對小鼠腸道中糞腸球菌和乳酸桿菌生長代謝的影響，并通過耐酸試驗和藥敏試驗，從而篩選出耐酸性強和抗藥性強的菌株，為開發(fā)利用腸道益生菌提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及處理

試驗于2021年4月在河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院基礎(chǔ)實驗室完成。試驗所需的材料為河北科技師范學(xué)院鼠房養(yǎng)育的C57BL/6J肥胖小鼠新鮮糞便。在取材之前，對C57BL/6J小鼠進(jìn)行高脂喂食8周，形成肥胖模型，然后經(jīng)過0 ∶24 h(禁食不禁水0 h，喂食24 h)、12 ∶12 h(禁食不禁水12 h，喂食12 h，即06：00開始禁食，18：00喂食)、16 ∶8 h (禁食不禁水16 h，喂食8 h，即06：00開始禁食，22：00喂食)3種間歇性禁食模式處理2周，再采集糞便。除禁食期間外，其他時間正常喂食。在禁食前對小鼠進(jìn)行分組，記禁食0 h的小鼠為A組，禁食12 h為B組，禁食16 h為C組。

1.2 主要試劑

MRS(寒天)固體培養(yǎng)基、MRS液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、無水乙醇、硝酸鉀等均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 樣品處理

將收集的3組小鼠糞便標(biāo)號為A、B、C組后各稱取0.1 g，放入裝有9.9 mL無菌生理鹽水的離心管中，將離心管放入37 ℃搖床中培養(yǎng)15 min后，離心取上清進(jìn)行梯度稀釋，稀釋梯度為10-2～10-4。

1.4 細(xì)菌的分離鑒定與藥敏試驗

1.4.1 糞腸球菌

1.4.1.1 糞腸球菌的分離 吸取 100 μL 菌液用涂布棒均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基平皿中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，其間觀察菌落生長狀況。挑取有明顯溶鈣圈的單菌落于 MRS固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)，進(jìn)行多次分離純化，純化的菌株用30%甘油于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.1.2 糞腸球菌的鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定：分離純化后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，再依次涂片、風(fēng)干、火焰固定、結(jié)晶紫溶液染色1 min、蒸餾水水洗、碘液媒染1 min、水洗、95%乙醇脫色30 s、水洗、番紅染液復(fù)染1 min、水洗，光學(xué)顯微鏡下用油鏡觀察[11]。生化鑒定：參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》以及《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[17]，對分離純化出來的糞腸球菌菌群(SY-1)進(jìn)行生化鑒定。

1.4.1.3 糞腸球菌的耐酸性測定 從MRS固體培養(yǎng)基中挑取長勢良好的單菌落接種于裝有 MRS液體培養(yǎng)基的離心管中，將離心管放置于37 ℃搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h后取出，混勻，吸取適量菌懸液打入含有 MRS液體培養(yǎng)基的離心管中使其稀釋100倍，之后吸取已被稀釋的菌懸液加入到用濃鹽酸配制好的pH值為2、3、4的MRS液體培養(yǎng)基的離心管中[18]，將離心管放置于37 ℃搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后取出，吸取適量菌懸液涂布于 MRS固體培養(yǎng)基中，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后取出，進(jìn)行活菌計數(shù)，以正常pH值(7.5)處理的為空白對照，每個處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.4.1.4 糞腸球菌的藥敏鑒定 采用KB法[19]，選取5種常見抗敏藥物對菌株進(jìn)行藥敏試驗[20]。取100 μL菌懸液涂布于MRS固體培養(yǎng)基中，用無菌鑷子夾取氨芐西林、鏈霉素、青霉素、卡那霉素、四環(huán)素藥敏紙片對稱放置于培養(yǎng)基中，以不經(jīng)過藥水浸泡處理的紙片為對照，每種藥品設(shè)置3組重復(fù)。將培養(yǎng)皿放入 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，觀察抑菌圈，并用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，用作判定指標(biāo)，將結(jié)果分為敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)[21]。

1.4.2 乳酸桿菌

1.4.2.1 乳酸桿菌的分離 取100 μL菌液涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，每組3個重復(fù)，在37 ℃培養(yǎng) 2 d 后，挑選溶鈣圈較大且較為明顯的單菌落進(jìn)行平板劃線，純化培養(yǎng)2～3次。

1.4.2.2 乳酸桿菌的鑒定 形態(tài)鑒定：從MRS固體培養(yǎng)基中挑長勢良好的單菌落，革蘭氏染色后用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。生化鑒定：根據(jù)《常見細(xì)菌鑒定手冊》中的說明對菌落進(jìn)行生化鑒定。

1.4.2.3 乳酸桿菌的耐酸性測定 取適量活化菌液加入MRS液體培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃振蕩培養(yǎng)4 h，之后接種至pH值為正常(6.4)、3、4的培養(yǎng)基中，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)3 h，最后分別涂布至固體MRS平板，每組3個重復(fù)，在37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.4.2.4 乳酸桿菌的藥敏鑒定 選取5種常見的抗敏藥物對菌株進(jìn)行藥敏試驗(見“1.3.5”節(jié))。

1.5 細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增及測序

用細(xì)菌基因組提取試劑盒分別提取2組分離菌株的基因并作為模板，使用通用引物27F和1492R[22]進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系50μL：2×TaqMix 25μL，0.4 μmol/L正、反向引物各2 μL，DNA模板 4μL，ddH2O 17 μL。擴(kuò)增程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min；20 ℃ 5 min。產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測并用膠回收試劑盒回收PCR目的片段，送至北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)觀察和鏡檢結(jié)果分析

觀察圖1-A分離純化的培養(yǎng)基，可見圓形、光滑突起、濕潤、邊緣整齊的菌落，周圍有明顯的溶鈣圈。將分離純化得到的單菌落涂片，革蘭氏染色如圖1-C所示，可見呈短鏈排列或2個對生的藍(lán)紫色革蘭氏陽性球菌，可初步判斷其為糞腸球菌屬，命名為SY-1。由圖1-B可知，觀察到菌落形態(tài)呈現(xiàn)為無色半透明圓形凸起的菌落；革蘭氏染色結(jié)果見圖1-D，細(xì)胞染色為紫色，大多呈短桿狀，均無鞭毛，可初步判斷是乳酸桿菌屬，并命名為 SY-2。

2.2 16S測序結(jié)果及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

經(jīng)北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司測序得到的序列通過NCBI上Blast比對可以發(fā)現(xiàn)，分離出來的SY-1基因序列與GenBank中已經(jīng)注冊的糞腸球菌的序列相似性高達(dá)99.93%，說明分離的SY-1菌株為糞腸球菌；SY-2基因序列與GenBank中已經(jīng)注冊的乳酸桿菌相似度為99.86%，說明 SY-2 菌株為乳酸桿菌。進(jìn)一步選取10種菌株構(gòu)建16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹，由圖2-A可以得出SY-1與糞腸球菌ATCC 19433和糞腸球菌JCM 5803在同一進(jìn)化分支上，由圖2-B可以得出SY-2與乳酸桿菌NBRC 14221在同一進(jìn)化分支上。

2.3 細(xì)菌的生化鑒定結(jié)果分析

由表1可知，對3組禁食處理的糞腸球菌進(jìn)行生化鑒定結(jié)果一致，并判斷該菌接觸試驗、淀粉水解試驗、吲哚試驗為陰性，表明糞腸球菌不分解過氧化氫、淀粉和色氨酸，甲基紅試驗、VP 試驗、硝酸鹽還原試驗為陽性，表明糞腸球菌分解糖類和還原硝酸。由表2可知，A、B、C組結(jié)果相同，接觸試驗陰性表明乳桿菌不分解過氧化氫，甲基紅和VP試驗證明可以乳桿菌分解糖類，吲哚試驗陽性證明乳桿菌可以分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，硝酸還原試驗證明乳桿菌不還原硝酸。

表1 糞腸球菌生理生化鑒定

表2 乳酸桿菌生理生化鑒定

2.4 細(xì)菌的耐酸性測定結(jié)果分析

以各組正常pH值處理為對照，計算存活率[15]。根據(jù)表3可以看出，A 組在pH值≥4處理環(huán)境下糞腸球菌存活率受影響較?。欢?dāng)pH值≤3時，其存活率呈現(xiàn)出一定的下降趨勢，并隨著 pH值的下降而下降；B、C等2組在各pH梯度下的存活率均低于A組，但B組相對來說存活率更低。根據(jù)表4可知，分離出的乳酸桿菌在pH值為2的培養(yǎng)基上基本不能生長，pH值為3的培養(yǎng)基上只有C組有少量生長，說明對于過強的酸性環(huán)境，只有經(jīng)過禁食改善過的C組乳酸桿菌較為適應(yīng)；在pH值為4的培養(yǎng)基上A組的菌落存活率很低，不能正常生長，B組有少量生長，C組則可以良好適應(yīng)，能夠長出大量菌落；pH值正常的對照處理中各組都能良好生長。

表3 不同pH處理下各組禁食處理的糞腸球菌存活率

表4 不同pH處理下各組禁食處理的乳酸桿菌存活率

2.5 細(xì)菌的藥敏檢測

對2種細(xì)菌3組處理進(jìn)行藥敏試驗，分別測量各種藥敏紙片周圍所產(chǎn)生的抑菌圈大小，對2種細(xì)菌藥物敏感程度進(jìn)行判定。從表5可以看出， 糞腸球菌對氨芐西林、四環(huán)素敏感，對鏈霉素、青霉素、卡那霉素耐藥。從表6可以看出，乳酸桿菌對卡納霉素、青霉素和鏈霉素耐藥，沒有形成抑菌圈， 基本都可以正常生長；而對含有氨芐西林和四環(huán)素的藥敏紙片均敏感，且對比抑菌圈總體大小可以看出對于四環(huán)素敏感度高。

表5 糞腸球菌藥敏試驗結(jié)果

表6 乳酸桿菌藥敏試驗結(jié)果

3 討論

有研究表明，在使用益生菌時，如乳酸桿菌可提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化率，減少腸道中病原體的定殖，改善胃腸道微生物群平衡[23]。本試驗通過多次分離純化從禁食小鼠糞便中得到糞腸球菌(SY-1)和乳酸桿菌(SY-2)。由形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，分離得到的SY-1菌落呈圓形、邊緣整齊并且周圍有明顯的溶鈣圈，初步觀察其符合糞腸球菌的菌落特點；進(jìn)一步通過革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)，分離的SY-1呈短鏈或2個對生排列的藍(lán)紫色的革蘭氏陽性球菌的特點，同時結(jié)合生理生化分析，初步判斷該菌落為糞腸球菌，與慈洋等分離出來的糞腸球菌形態(tài)[24]一致。SY-2菌落形態(tài)呈無色、半透明、圓形凸起且邊緣不規(guī)則，進(jìn)一步通過革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)細(xì)菌為紫色，大多數(shù)呈短桿狀，之后進(jìn)行生理生化分析初步判斷該菌落為乳酸桿菌，該結(jié)果與梁東梅等鑒定的乳酸桿菌形態(tài)[25]基本一致。為進(jìn)一步鑒定2種菌株的類型，本研究采用16S rRNA測序并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，測序結(jié)果顯示分離株SY-1與糞腸球菌相似性高達(dá)99.93%，構(gòu)建進(jìn)化樹結(jié)果顯示其與糞腸球菌菌株在同一分支上，遺傳距離最近；分離株SY-2與乳酸桿菌相似度高達(dá)99.86%，進(jìn)化樹結(jié)果顯示其與乳酸桿菌菌株在同一分支上，可以確定分離的 SY-1 是糞腸球菌，SY-2是乳酸桿菌。繼續(xù)研究其生物學(xué)特性，本研究對3組不同禁食處理方式的2種分離菌進(jìn)行酸堿性測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糞腸球菌具有一定的耐酸能力，耐強酸能力較差，這與鮑延娥等研究的糞腸球菌具有耐酸性結(jié)果[26]一致，但不同禁食方式對糞腸球菌耐酸能力有一定的影響，12 h禁食處理的糞腸球菌表現(xiàn)出較其他2組禁食處理更差的耐酸性，由此可以得出將糞腸球菌作為益生菌添加劑時，不能與強酸性物質(zhì)混合使用，且12 h禁食處理可減少酸性條件下糞腸球菌的數(shù)量。乳酸桿菌在pH值為4時生長狀況良好，pH值為3時有少量生長，與植物乳酸桿菌可以在pH值為3時的酸性環(huán)境下生長結(jié)果[27]一致，但不同禁食時間處理下分離的乳酸桿菌耐酸性不同，0 h禁食處理的乳酸桿菌耐酸性差，16 h禁食處理的乳酸桿菌在pH值為3時耐酸能力較強，說明16 h禁食方式改變了小鼠腸道微生物平衡，該結(jié)果提示可以通過禁食方式篩選和訓(xùn)化對強酸性環(huán)境抗性強的菌株，同時對使用益生菌制劑改善腸道環(huán)境提供參考，以上結(jié)果說明不同時間禁食可以影響動物腸道微生物的生理活動。

抗生素的長期使用引起了全世界對抗生素抗性微生物的關(guān)注，這些微生物對人類健康和環(huán)境構(gòu)成威脅[28]，包括抗生素替代品益生菌在內(nèi)。為此本研究對糞腸球菌和乳酸桿菌進(jìn)行了藥敏試驗，選用5種常見抗生素藥物，結(jié)果顯示糞腸球菌對氨芐西林和四環(huán)素敏感，且禁食12 h組的敏感性較低，0 h禁食處理組的敏感性較高，對鏈霉素、青霉素、卡那霉素耐藥，這一結(jié)果與梁權(quán)輝等的試驗結(jié)果[29]一致。該結(jié)果提示糞腸球菌對不同抗生素的耐藥性不同，因此當(dāng)動物使用氨芐西林、四環(huán)素等抗生素治療時，應(yīng)避免與含糞腸球菌添加劑的飼料同時飼喂。同時對乳酸桿菌藥敏檢測發(fā)現(xiàn)，其對氨芐和四環(huán)素敏感，其中禁食0 h組的乳酸桿菌對其敏感度較高，產(chǎn)生的抑菌圈較大，對卡那霉素、青霉素、鏈霉素不敏感，這與馬祥兆等研究的乳酸桿菌對青霉素敏感[30]不同，可推測目前該菌種對青霉素已產(chǎn)生耐藥性?？梢?，不同禁食時間對不同菌株的耐藥性有一定的干預(yù)作用。綜上可知，從不同禁食方式處理的肥胖小鼠腸道糞便中篩選得到的糞腸球菌和乳酸桿菌對強酸性環(huán)境耐受能力不同，后續(xù)可繼續(xù)對2種菌株的產(chǎn)酸能力進(jìn)行測定，比較在不同禁食時間干預(yù)下2種菌的產(chǎn)酸能力是否提升。同時將已確定更有優(yōu)勢的C組(禁食16 h)糞腸球菌和乳酸桿菌繼續(xù)培養(yǎng)，制定完善的乳酸菌食品制劑方案，將制劑再喂食高脂處理小鼠，通過觀察小鼠體質(zhì)量變化，測定小鼠血液中葡萄糖、膽固醇和甘油三酯等生理指標(biāo)含量，來探究這2個菌株對小鼠體內(nèi)脂肪代謝的影響。

4 結(jié)論

本試驗成功地從經(jīng)過禁食處理的肥胖小鼠糞便中分離并通過對甲基紅、VP 試驗、硝酸鹽還原試驗、接觸試驗、 淀粉水解反應(yīng)和吲哚試驗等生理生化方法鑒定了糞腸球菌和乳酸桿菌，之后對其分別進(jìn)行藥物敏感性試驗，確定糞腸球菌和乳酸桿菌的敏感性藥物均為氨芐西林和四環(huán)素，為開發(fā)利用益生菌提供更加可靠的參考依據(jù)。