馮蓓蓓， 鄧業(yè)成， 盧丹丹， 湯夏安， 鄧志勇， 駱海玉

(廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣西桂林 541006)

羅漢果(Siraitiagrosvenorii)是葫蘆科羅漢果屬植物的果實(shí)，很早就被發(fā)現(xiàn)是藥食兩用的植物[1-2]。羅漢果植株的主要土傳病害有根腐病[3-4]、白絹病[5]、青枯病[6]、根結(jié)線蟲病[7]、芽枯病[8]等。研究發(fā)現(xiàn)，齊整小核菌(SclerotiumrolfsiiSacc.)是羅漢果白絹病的致病菌，通過侵害羅漢果的莖基部和根部，使羅漢果莖葉萎蔫，最后枯萎而死[9]。羅漢果根腐病的致病菌是鐮刀菌根腐類病菌[10]，通過侵染羅漢果根部，使根腐爛，造成植株枯萎死亡。目前，化學(xué)防治是最廣泛應(yīng)用的防治方式，但人們越來越注重隨之而來的環(huán)境、食品等問題，所以研究出更加科學(xué)安全的防治方法迫在眉睫。隨著技術(shù)的發(fā)展和人們對殺菌劑要求的日益提高，農(nóng)業(yè)病害的防治提倡采用更加安全、低污染的生物防治，所以植物內(nèi)生真菌及其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)成為植物病害防治相關(guān)研究的熱門方向[11]。植物內(nèi)生菌是不危害植物宿主，存在于健康宿主細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)的一大類未完全開發(fā)的微生物[11-13]。

廣西地不容(Stephaniakwangsiensis)是中國特色千金藤屬植物[14]，有著廣泛的藥用價值，比如清熱解毒、消腫去瘀等[15]。目前對廣西地不容的殺蟲活性[16]和抑菌活性[17]等已有研究報道。地楓皮(Illiciumdifengpi)為木蘭科八角屬植物，具有豐富的藥用價值，常用于風(fēng)濕疼痛類疾病的治理，也是跌打損傷藥品的主要藥物原料[18]。

筆者所在課題組經(jīng)過多年研究得出，廣西地不容和地楓皮的內(nèi)生真菌對多種植物病原真菌有抗菌活性[19-22]?；诖?，進(jìn)一步研究2種植物內(nèi)生真菌對羅漢果3種土傳病原真菌的抗菌活性，旨在為其在殺菌劑領(lǐng)域的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試植物內(nèi)生真菌 廣西地不容內(nèi)生真菌：DBR-3、DBR-5、DBR-15；地楓皮內(nèi)生真菌：DFP-G-5、DFP-G-7、DFP-G-9、DFP-P-7.1。上述內(nèi)生真菌均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存并提供的菌種中篩選取得，見表1。

1.1.2 供試羅漢果病原真菌 3株羅漢果病原真菌為GFB-G10、GFB-G15和BJB。上述病原真菌均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存并提供的菌種中篩選取得，見表1。

表1 內(nèi)生真菌和病原真菌種類

1.1.3 供試培養(yǎng)基和發(fā)酵液 菌株活化、制作大量培養(yǎng)基。拮抗試驗(yàn)培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA，含馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂25 g、蒸餾水1 L)。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB，含馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物制備 所有試驗(yàn)在廣西師范大學(xué)雁山校區(qū)珍稀瀕危動植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開展，時間為2021年1—5月。在無菌超凈臺內(nèi)活化7種純化好的植物內(nèi)生真菌，在PDA 平板上培養(yǎng)3 d后使用。用 0.4 cm 打孔器在每種內(nèi)生真菌菌落邊緣打取菌餅。分別放入已準(zhǔn)備好的滅菌PDB培養(yǎng)基中，每瓶放15個菌餅。放置于(27±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中培30 d，每天振蕩3次。

采用液-液萃取法分離出內(nèi)生真菌發(fā)酵液中的粗提物，操作如下：首先，將內(nèi)生真菌發(fā)酵液與之等體積的乙酸乙酯連續(xù)萃取3次，將萃取液合并，得到乙酸乙酯層和萃余層。然后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，分別得到發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物以及發(fā)酵液萃余物的膏體。最后，將分離出的菌絲體烘干、碾碎后，用甲醇浸提[23]。反復(fù)多次浸提直至浸提液無色為止，每次浸提時間為2 d。通過抽濾把菌絲體與甲醇浸提液分開，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀處理甲醇浸提液得到膏體，即菌絲體甲醇粗提物。

1.2.2 抑菌活性測定

1.2.2.1 內(nèi)生真菌對羅漢果病原真菌的拮抗試驗(yàn) 在無菌超凈臺內(nèi)使用平板對峙法[24-25]完成拮抗試驗(yàn)。操作如下：分別活化7種植物內(nèi)生真菌和3種植物病原菌，培養(yǎng)3 d。在培養(yǎng)皿底面做記號，以培養(yǎng)皿直徑畫線，以圓心為對稱點(diǎn)，2點(diǎn)之間間距 3 cm 取點(diǎn)，做標(biāo)記。用直徑為0.4 cm的打孔器分別在內(nèi)生真菌和病原菌的菌落邊緣打取菌餅，依次接種于標(biāo)記的2點(diǎn)，并在培養(yǎng)皿底面寫好對應(yīng)的菌種名稱。對照組除不接內(nèi)生真菌外，其他與試驗(yàn)組相同，且處理組、對照組都做3個重復(fù)。于恒溫箱(27±1 ℃)中培養(yǎng)1～9 d，同時每天觀察菌絲生長速度、邊緣菌絲是否變形、抑菌帶是否產(chǎn)生等。測量每個菌落的半徑，按照下面公式計算得出抑制率：

抑制率=(對照組菌落半徑-處理組菌落短半徑)/對照組菌落半徑×100%。

1.2.2.2 發(fā)酵產(chǎn)物對羅漢果病原真菌菌絲生長的抑制活性測定 在無菌工作臺中操作，使用菌絲生長速率法[26]完成活性的測定。首先將7株內(nèi)生真菌的發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物膏體、發(fā)酵液萃余物膏體及菌絲體粗提物膏體配制成質(zhì)量濃度分別為20、100、100 g/L的藥液，溶劑為丙酮，然后活化內(nèi)生真菌和植物病原菌3 d。在9 cm直徑的培養(yǎng)皿中同時加入1 mL藥液(對照組藥液用丙酮代替，其他與處理組相同) 與9 mL熱熔的PDA培養(yǎng)基，輕微晃動使其混合均勻，制成帶藥培養(yǎng)基(質(zhì)量濃度分別為：2、10、10 g/L)。用直徑為0.4 cm的打孔器分別在3種羅漢果病原真菌的菌落邊緣打取菌餅。菌餅貼于之前做好的已凝固帶藥培養(yǎng)基上，且菌餅成“品”字排列[白絹病菌病原菌(BJB)的對照組除外，由于BJB生長速度過快，因此BJB的對照組每皿只接1個菌餅]，在恒溫培養(yǎng)箱(27±1 ℃)中培養(yǎng)3 d。BJB的對照組重復(fù)3次。使用十字交叉法[27]測量每個菌落的直徑，按照下面公式計算得出抑制率：

抑制率=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑-0.4)×100%。

配制一系列質(zhì)量濃度的帶藥培養(yǎng)基，計算得出各個質(zhì)量濃度的抑菌率。用最小二乘法求出毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r) 、有效中濃度(EC50)及EC50的95%置信限。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物內(nèi)生真菌對羅漢果病原菌的拮抗活性

由表2可知，7種植物內(nèi)生真菌對3種羅漢果病原真菌有不同程度的抑制效果。其中DBR-15對GFB-G10和GFB-G15的拮抗作用最大，抑制率達(dá)到60.00%～70.77% 。DFP-G-9對GFB-G10的拮抗作用最小，抑制率只有2.86% 。

表2 7株內(nèi)生真菌對3種羅漢果病原真菌的拮抗活性

2.2 植物內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對羅漢果病原真菌的抑制活性

2.2.1 2 g/L植物內(nèi)生真菌發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對羅漢果病原真菌的抑制活性 如表3所示，6種植物內(nèi)生真菌DBR-3、DBR-5、DBR-15、DFP-G-7、DFP-G-9、DFP-P-7.1的發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對3種病原菌抑菌活性好(除DBR-15對GFB-G10的抑菌活性一般)，抑制率均大于50%。DFP-G-5發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物抑菌活性差，抑制率均小50%。根據(jù)此結(jié)果，接下來研究2種羅漢果內(nèi)生真菌(DBR-3、DBR-5)、3種地楓皮內(nèi)生真菌(DFP-G-7、DFP-G-9、DFP-P-7.1)的發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對3種羅漢果病原真菌的毒力和DBR-15的發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對 GFB-G15、BJB的毒力。

表3 7株內(nèi)生真菌發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對3種羅漢果病原真菌菌絲的抑制活性

2.2.2 10 g/L植物內(nèi)生真菌發(fā)酵液萃余物對羅漢果病原真菌的抑制活性 如表4所示，4種植物內(nèi)生真菌DBR-5、DFP-G-5、DFP-G-7、DFP-P-7.1的發(fā)酵液萃余物對BJB的抑菌活性好，抑制率均大于50%。其他植物內(nèi)生真菌的發(fā)酵液萃余物對羅漢果病原真菌抑菌活性差，抑制率均小于50%。得出結(jié)論，這7種植物內(nèi)生真菌的發(fā)酵液萃余物對3種羅漢果病原真菌幾乎沒有抑制活性?？梢源_定，抑菌物質(zhì)主要存在于這7種植物內(nèi)生真菌的發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物中。根據(jù)此結(jié)果，接下來研究4種內(nèi)生真菌DBR-5、DFP-G-5、DFP-G-7、DFP-P-7.1的發(fā)酵液萃余物對BJB的毒力。

表4 7株內(nèi)生真菌發(fā)酵液萃余物對3種羅漢果病原真菌菌絲的抑制活性

2.2.3 10 g/L植物內(nèi)生真菌菌絲體甲醇提取物對羅漢果病原真菌的抑制活性 如表5所示，DBR-5的菌絲體甲醇粗提物對3種病原菌的抑菌活性較好，抑菌率均大于70%。DBR-15、DFP-G-9的菌絲體甲醇粗提物對GFB-G10、BJB的抑菌活性好，抑菌率均大于50%。DFP-P-7.1的菌絲體甲醇粗提物對GFB-G15、BJB菌絲的抑菌活性好，抑菌率均大于50%。DBR-3的菌絲體甲醇粗提物對GFB-G15的抑菌活性好。DFP-G-7的菌絲體甲醇粗提物對BJB的抑菌活性好。DFP-G-5菌絲體甲醇提取物抑菌活性差，抑菌率均小于50%。根據(jù)此結(jié)果，接下來研究DBR-5的菌絲體甲醇提取物對3種羅漢果病原真菌的毒力，DBR-15、DFP-G-9的菌絲體甲醇粗提物對 GFB-G10、BJB的毒力，DFP-P-7.1的菌絲體甲醇粗提物對GFB-G15、BJB的毒力，DBR-3的菌絲體甲醇粗提物對GFB-G15的毒力，DFP-G-7的菌絲體甲醇粗提物對BJB的毒力。

2.3 廣西地不容內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對羅漢果病原真菌的毒力

為進(jìn)一步確定廣西地不容內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的抑菌效果，根據(jù)上文抑菌活性測定結(jié)果，選取3株地不容內(nèi)生真菌DBR-3、DBR-5、DBR-15的發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物、發(fā)酵液萃余物、菌絲體甲醇提取物對羅漢果原真菌抑菌率達(dá)到50%以上的相應(yīng)病原菌作為供試菌株，進(jìn)一步測定其對供試菌株菌絲的毒力，結(jié)果見表6。3種病原菌中，DBR-3的發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對GFB-G10的毒力最高，EC50為 0.334 0 g/L；對BJB的毒力最低，EC50為1.064 5 g/L。DBR-5的發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對BJB的毒力最高，EC50為0.120 8 g/L；對GFB-G10的毒力最低，EC50為0.379 9 g/L。DBR-15發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對BJB的毒力比對GFB-G15的毒力高。DBR-5的菌絲體甲醇提取物對GFB-G15的毒力最高，EC50為0.270 8 g/L；對GFB-G10的毒力最低，EC50為0.957 8 g/L。DBR-15的菌絲體甲醇提取物對BJB的毒力比對GFB-G10的毒力高。

表5 7株內(nèi)生真菌菌絲體甲醇提取物對3種植物病原真菌菌絲的抑制活性

2.4 地楓皮內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對羅漢果病原真菌的毒力

為進(jìn)一步確定地楓皮內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對3種羅漢果病原真菌菌絲生長的抑制活性， 根據(jù)上文抑菌活性測定結(jié)果，選取4株地不容內(nèi)生真菌DFP-G-5、DFP-G-7、DFP-G-9、DFP-P-7.1的發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物、發(fā)酵液萃余物、菌絲體甲醇提取物對羅漢果原真菌抑菌率達(dá)到 50%以上的相應(yīng)病原菌作為供試菌株，進(jìn)一步測定其對供試菌株菌絲的毒力，結(jié)果見表7。3種病原菌中，DFP-G-7、DFP-P-7.1的發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對BJB的毒力最高，EC50分別為0.172 4、0.186 1 g/L；對GFB-G15的毒力最低，EC50分別為2.911 7、0.878 9 g/L。DFP-G-9的發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對BJB的毒力最高，EC50為0.426 9 g/L；對 GFB-G10 的毒力最低，EC50為1.545 4 g/L。DFP-G-9 菌絲體甲醇提取物對BJB的毒力比對GFB-G10的毒力高。DFP-P-7.1菌絲體甲醇提取物對BJB的毒力比對GFB-G15的毒力高。

表6 廣西地不容內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對3種羅漢果病原真菌的毒力

表7 地楓皮內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對3種羅漢果病原真菌的毒力

3 討論與結(jié)論

目前對地楓皮內(nèi)生真菌的研究較少，已知地楓皮的根、莖、葉中具有大量的內(nèi)生真菌[28]，其中一些內(nèi)生真菌對植物病原菌和動物病原菌有較為廣泛的抑菌性，所以研究廣西特色植物地楓皮的有利于抗菌植株的培養(yǎng)和生物抗菌劑的研發(fā)。

目前對廣西地不容內(nèi)生真菌的研究已初具規(guī)模，研究發(fā)現(xiàn)其塊莖中有多種內(nèi)生真菌具有很強(qiáng)的抗菌性且有較強(qiáng)的普適性[29]?，F(xiàn)已有以廣西地不容為原料的生物殺菌劑研發(fā)。

隨著羅漢果種植的加大，如何防治羅漢果土傳病害成為當(dāng)務(wù)之急。目前大多用化學(xué)防治，但是隨后帶來的環(huán)境污染不可忽略。所以對羅漢果土傳病害的生物殺菌劑的研發(fā)迫在眉睫。

在拮抗試驗(yàn)中供試廣西地不容和地楓皮內(nèi)生真菌對3種羅漢果病原真菌有抑制活性普遍偏低。為了節(jié)省時間，減少不必要的步驟， 先要初步判斷7種植物內(nèi)生真菌對3種病原真菌是否有抑菌活性，所以采用了平板對峙法。但拮抗試驗(yàn)中抑制效果不好的菌株并不能說明其沒有抑菌活性，可能是本試驗(yàn)方法的局限性造成的，比如由于培養(yǎng)時間太短，抑菌物質(zhì)尚未產(chǎn)生等。所以應(yīng)該進(jìn)一步測定內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物對病原真菌的抑制活性，從而篩選優(yōu)良的抑菌菌株。

有大量的研究證明，植物內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯萃取物有廣泛的抑菌活性[27-29]。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示，6種植物內(nèi)生真菌DBR-3、DBR-5、DBR-15、DFP-G-7、DFP-G-9、DFP-P-7.1的發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物具有很好的抑菌活性，在質(zhì)量濃度為2 g/L時，其對3種羅漢果病原真菌BJB、GFB-G10、GFB-G15的抑制率均在50% 以上(除DBR-15發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對GFB-G10的抑菌活性一般)，其中DBR-5的發(fā)酵液乙酸乙酯萃取物對BJB的毒力最高，EC50為0.120 8 g/L。

這6種植物內(nèi)生真菌的菌絲體甲醇提取物對病原菌的抑制活性一般，質(zhì)量濃度為10 g/L時，對3種羅漢果病原真菌其中的一種或多種的抑制率均在50%以上，其中DBR-5的菌絲體甲醇提取物對GFB-G15的毒力最高；EC50為0.270 8 g/L。

4種植物內(nèi)生DBR-5、DFP-G-5、DFP-G-7、DFP-P-7.1的發(fā)酵液萃余物對病原菌的抑制活性一般，質(zhì)量濃度為10 g/L時，對BJB的抑菌率在50%以上，其中DBR-5的發(fā)酵液萃余物對BJB的毒力最高，EC50為1.488 1 g/L。

6種植物內(nèi)生真菌DBR-3、DBR-5、DBR-15、DFP-G-7、DFP-G-9、DFP-P-7.1的發(fā)酵產(chǎn)物乙酸乙酯萃取物有較好的抗菌活性，有很大的研究價值與潛在價值，可以推進(jìn)研究這6種植物內(nèi)生真菌，探究其活性物質(zhì)的組成。