李凌燕， 肖 冰， 張旭冬， 陳子言， 王顥潛， 張秀杰， 陳 紅， 梁晉剛

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京 100176； 2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京 102442；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081)

根據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA)最新統(tǒng)計顯示，在2019年全世界范圍內(nèi)種植的轉(zhuǎn)基因玉米占地面積已經(jīng)達(dá)到了6 090萬hm2，約占全世界該植物種植總數(shù)的31%[1]，轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米MON87419由孟山都遠(yuǎn)東有限公司研發(fā)，將耐受麥草畏基因dmo和耐草銨膦基因pat的表達(dá)框共整合至玉米基因組中，通過多代篩選鑒定獲得的耐麥草畏和草銨膦轉(zhuǎn)基因玉米新品種。自2016年上市以來，該轉(zhuǎn)化體在美國、澳大利亞、新西蘭等11個國家和地區(qū)獲得安全證書批準(zhǔn)，并已向我國提出了進(jìn)口用作加工原料安全證書的申請。目前，尚未發(fā)布專門針對該轉(zhuǎn)基因玉米的檢測方法，為了進(jìn)行有效監(jiān)管，制定耐除草劑玉米MON87419的定性PCR檢測方法對開展轉(zhuǎn)基因檢測和評價非常必要。

目前基于核酸的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)除傳統(tǒng)PCR檢測以外，生物傳感器技術(shù)[2]、等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)[3]、數(shù)字PCR(digital PCR)[4-8]、RealtimePCR[9-10]、基因芯片技術(shù)(gene chip)[11]等新型檢測技術(shù)也在不斷的發(fā)展，相較于傳統(tǒng)PCR檢測新技術(shù)設(shè)備專業(yè)性更強(qiáng)、技術(shù)要求更高。定性PCR方法是一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的檢測技術(shù)，包括待測樣品DNA的提取純化、PCR體系配制、PCR擴(kuò)增、瓊脂糖電泳4個部分，因其設(shè)備普及率高、操作簡便、靈敏度高，是目前應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因檢測最廣泛的方法之一，也是許多國家用于市場篩查轉(zhuǎn)基因成分的首選方法[12]。本研究以轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米MON87419轉(zhuǎn)化體特異性序列為靶標(biāo)，以zSSIIb為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，在5′和3′端設(shè)計了一系列PCR定性檢測引物，分別進(jìn)行引物的篩選、PCR擴(kuò)增條件和反應(yīng)體系優(yōu)化、特異性分析、靈敏度測試、檢出限測試等試驗(yàn)，建立了轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米MON87419轉(zhuǎn)化體特異性定性PCR檢測方法。該方法的建立旨在為該轉(zhuǎn)化體品系及其衍生產(chǎn)品的鑒定檢測、安全評價和行政監(jiān)管提供重要的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米MON87419，由孟山都遠(yuǎn)東有限公司研發(fā)；非轉(zhuǎn)基因受體玉米LH244(陰性對照)由孟山都遠(yuǎn)東有限公司提供。

特異性測試樣品中，其他轉(zhuǎn)基因玉米混合樣、轉(zhuǎn)基因大豆混合樣、轉(zhuǎn)基因水稻混合樣、轉(zhuǎn)基因油菜混合樣、轉(zhuǎn)基因棉花混合樣(表1)，均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室收集保存。

表1 轉(zhuǎn)基因作物混合樣品

1.1.2 主要試劑 植物基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；GoTaq? Green master mix、DL1000 分子量Marker，均購自上海寶生物技術(shù)有限公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；其他生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器 臺式冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)、Q5000超微量紫外分光光度計(美國Quawell公司)、C1000 型梯度PCR儀(美國Bio-rad公司)、Bio-rad ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取 轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米MON87419及其受體種子單株育苗，隨機(jī)各選取10個單株，每個單株選取3張葉片，研磨混勻后，隨機(jī)取樣50～100 mg，用植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA；轉(zhuǎn)基因玉米混合樣、轉(zhuǎn)基因大豆混合樣、轉(zhuǎn)基因油菜混合樣、轉(zhuǎn)基因水稻混合樣、轉(zhuǎn)基因棉花混合樣，分別取100 mg粉末樣品，用植物基因組DNA提取試劑盒提取DNA。用Q5000超微量紫外分光光度計測定DNA的濃度和質(zhì)量，將DNA濃度統(tǒng)一稀釋至50 ng/μL，備用。

1.2.2 引物的設(shè)計與篩選 轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米MON87419的外源插入位點(diǎn)包含一個dmo基因的表達(dá)框和一個pat基因的表達(dá)框，不同外源基因片段之間以玉米基因組DNA片段相連接。本研究利用Primer Premier 5軟件，以外源插入T-DNA與基因組連接區(qū)域的5′端和3′端轉(zhuǎn)化體特異性序列為靶標(biāo)，分別設(shè)計轉(zhuǎn)化體特異性引物(圖1、表2)，進(jìn)行正交組合。根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告-4—2015[13]要求，從中挑選出擴(kuò)增片段大小在120～300 bp 的引物組合，同時將研發(fā)者提供的引物進(jìn)行試驗(yàn)(表3)。

表3 定性PCR檢測候選引物組合

以轉(zhuǎn)基因MON87419基因組DNA為目標(biāo)基因，配制濃度分別為10%和1%的樣品DNA。以這2個濃度的樣品DNA為模板，對設(shè)計引物的適配性進(jìn)行測試。玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因引物參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)部1861號公告-3-2012[14]，采用的反應(yīng)體系和程序與已發(fā)布的玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因一致。

1.2.3 特異性測試 利用“1.1”節(jié)中的基因組DNA為模板，對表3中引物組合的特異性進(jìn)行測試，同時擴(kuò)增樣品內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb進(jìn)行質(zhì)量和純度的質(zhì)控。

1.2.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化 設(shè)置6個引物濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L)和4個退火溫度(54、56、58、60 ℃)，進(jìn)行正交組合，以濃度為1%的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.5 靈敏度測試 配制轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米MON87419基因組DNA濃度分別為10.00%、1.00%、0.50%、0.10%、0.05%的5個樣品DNA作為模板，按照“1.2.4”節(jié)的方法對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，同時擴(kuò)增樣品內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb進(jìn)行質(zhì)量和純度的質(zhì)控。

1.2.6 檢出限測試 配制轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米MON87419基因組DNA濃度為0.1%的DNA樣品進(jìn)行60次PCR測試，每個擴(kuò)增體系模板用量均為50 ng，同時擴(kuò)增樣品內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb進(jìn)行質(zhì)量和純度的質(zhì)控。

1.2.7 再現(xiàn)性測試 配制轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米MON87419基因組DNA濃度分別為10.00%、1.00%、0.50%、0.10%、0.05%的樣品DNA，由2個不同操作人員，在2個不同時間段，利用2臺不同的PCR儀器進(jìn)行再現(xiàn)性測試，同時擴(kuò)增樣品內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因zSSIIb進(jìn)行質(zhì)量和純度的質(zhì)控。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性引物的篩選

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖2)表明，引物組合 5′-2、3′-5和3′-8擴(kuò)增條帶清晰、無非特異性擴(kuò)增，無引物二聚體，可作為候選引物進(jìn)行下一步測試。

2.2 特異性測試

特異性測試結(jié)果(圖3、圖4)表明，引物組合 3′-5 條帶清晰、無非特異性擴(kuò)增。將該引物組合PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果與研發(fā)者提供的序列比對完全一致，表明該引物特異性良好，將其命名為MON87419-F/MON87419-R。

2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化

由圖5可知，引物濃度為0.6、0.8 μmol/L的擴(kuò)增效率和條帶亮度基本一致，退火溫度為58 ℃和60 ℃時該引物的特異性更好、無非特異擴(kuò)增及引物二聚體。為了與內(nèi)標(biāo)的退火溫度保持一致， 并綜合考慮引物的特異性和擴(kuò)增效率，確定定性PCR方法的引物終濃度為0.6 μmol/L，退火溫度為58 ℃。

2.4 靈敏度測試

由圖6、圖7可知，在所有濃度模板DNA樣品中均獲得穩(wěn)定的擴(kuò)增片段，確定該方法的靈敏度為0.05%。

2.5 檢出限測試

由圖8、圖9可知，60個樣品均穩(wěn)定擴(kuò)增出預(yù)期大小一致的條帶，確定該方法的檢出限為0.1%。

2.6 再現(xiàn)性測試

由圖10、圖11可知，全部測試樣品在2次試驗(yàn)中均穩(wěn)定擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的條帶，說明本方法具有良好的再現(xiàn)性。

3 討論與結(jié)論

近年來文獻(xiàn)中報道了很多針對轉(zhuǎn)化體的檢測技術(shù)及方法，比如基因芯片法、傳感器法、恒溫擴(kuò)增法、數(shù)字PCR技術(shù)等，但PCR檢測方法因具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡單、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，應(yīng)用最為廣泛[15-16]。不僅是國內(nèi)轉(zhuǎn)化體檢測中最為常用和普遍的方法，也是國際上轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法中的金標(biāo)準(zhǔn)[17-19]。根據(jù)靶標(biāo)DNA片段的特異性差異，PCR檢測可分為通用元件的篩選PCR檢測、基因特異性PCR檢測、構(gòu)建特異性PCR檢測和品系特異性 PCR檢測4類。品系特異性PCR的檢測目標(biāo)是植物基因組與外源插入載體的連接區(qū)，連接區(qū)序列具有特異性，且是單拷貝的，所以品系特異性PCR檢測方法具有非常高的準(zhǔn)確性和特異性，是目前國內(nèi)、國際上轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法標(biāo)準(zhǔn)的首選[20]。

本研究以轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米MON87419轉(zhuǎn)化體特異性序列為靶標(biāo)，分析基因序列信息后設(shè)計引物，經(jīng)體系優(yōu)化、特異性測試、靈敏度測試、再現(xiàn)性測試，建立轉(zhuǎn)基因玉米MON87419的定性PCR檢測方法。結(jié)果表明，本方法能夠精準(zhǔn)檢測出轉(zhuǎn)基因玉米MON87419樣品，轉(zhuǎn)化體特異性片段大小是 216 bp，方法檢測靈敏度可達(dá)0.05%，檢出限達(dá)到0.1%，具有良好的品系特異性和靈敏度。本方法的主要技術(shù)參數(shù)全部符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部相關(guān)轉(zhuǎn)基因分子檢測標(biāo)準(zhǔn)的要求，可為該品系及其衍生品種的安全評價、有效監(jiān)管及知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供有效的技術(shù)支撐。

隨著轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展，定量檢測方法的建立也成為必然趨勢。龍麗坤等建立了轉(zhuǎn)基因玉米CM8101的實(shí)時熒光PCR檢測方法[21]，劉雙等建立了轉(zhuǎn)基因大豆ZH10-6的實(shí)時熒光PCR檢測方法[22]。楊晨等用微滴數(shù)字PCR技術(shù)和實(shí)時熒光PCR技術(shù)對大豆中轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測[23]?；谶@些檢測方法的不斷發(fā)展和完善，筆者所在研究團(tuán)隊將繼續(xù)研發(fā)基于實(shí)時熒光和數(shù)字PCR等新技術(shù)的定量檢測方法，以期為我國轉(zhuǎn)基因作物的檢測和科學(xué)監(jiān)管提供更有力的技術(shù)支撐。