柯寄明，江素萍，劉艷，嚴(yán)佳智，黃山，汪杰，彭燦，2，3，4，張繼穩(wěn)，5

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230012；2.藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230012；3.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230012；4.安徽省中醫(yī)藥研究院，中藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)研究所，合肥 230012；5.中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所，上海 201203)

秋水仙堿(colchicine，COL)是一種生物堿，多年來(lái)一直用于治療急性痛風(fēng)[1]。但其首關(guān)代謝廣泛、治療指數(shù)較低[1-2]和口服生物利用度較差(25%～50%)[3]。此外，口服秋水仙堿會(huì)出現(xiàn)輕度至重度的胃腸道副作用，包括腹部絞痛和疼痛、惡心、嘔吐和腹瀉[4]。即使是在治療劑量下，80%患者通常會(huì)發(fā)生這些副作用[5]。因此，經(jīng)皮給藥可能為秋水仙堿的給藥方式提供一條新的途徑，以解決口服秋水仙堿的劑量依賴(lài)性副作用和生物利用度差的問(wèn)題。醇傳遞體(transethosomes，TEs)在經(jīng)皮給藥方面具備醇質(zhì)體和傳遞體兩種載體的優(yōu)點(diǎn)[6]，能夠包載親水性或者疏水性的藥物，許多研究已經(jīng)證明TEs能夠增強(qiáng)具有不同理化性質(zhì)的藥物的透皮給藥效果[7-10]。TEs在醇質(zhì)體的基礎(chǔ)上加入表面活性劑，可以增加磷脂分子間的距離，干擾磷脂酞基鏈的順序，從而增加醇傳遞體的流動(dòng)性[11-12]；TEs在傳遞體的基礎(chǔ)上加入乙醇，高濃度乙醇具有促滲作用[13]，乙醇也作為表面負(fù)電荷的供體，可以避免脂質(zhì)囊泡的聚集，使整個(gè)體系更加穩(wěn)定[14]。

Box-Behnken設(shè)計(jì)(BBD)是一種流行的配方和工藝優(yōu)化工具，它利用實(shí)驗(yàn)空間邊緣和中心中點(diǎn)的處理組合。與中心組合設(shè)計(jì)(CCD)，D-最優(yōu)設(shè)計(jì)和3水平因子設(shè)計(jì)相比，BBD可以用更少的時(shí)間和更少的實(shí)驗(yàn)次數(shù)來(lái)優(yōu)化處方，并且更具成本效益。此外，BBD沒(méi)有軸向點(diǎn)，能夠確保所有設(shè)計(jì)點(diǎn)都落在安全操作區(qū)域內(nèi)[15-16]。熵權(quán)法(entropy weight method，EWM)則是對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、計(jì)算和分析，從而得到各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)[17]。兩者配合能夠降低人為主觀因素產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差，從而使結(jié)果更加合理客觀。

當(dāng)采用BBD考察多個(gè)指標(biāo)的時(shí)候，通常對(duì)單獨(dú)指標(biāo)逐個(gè)進(jìn)行分析，或者人為主觀地給不同的指標(biāo)賦權(quán)，避免不了主觀因素的介入。因此為優(yōu)化COL-TEs的處方，采用BBD和EWM進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)優(yōu)化，旨在篩選出COL-TEs的最優(yōu)處方，為同類(lèi)型制劑的處方篩選提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 高效液相色譜儀(THERMO V3000型，賽默飛世爾科技公司)；高速離心機(jī) (BT-25S型，常州市萬(wàn)豐儀器制造有限公司)；十萬(wàn)分之一電子分析天平[AB135-S型，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 (DF-101S型，鞏義市予華儀器制造有限責(zé)任公司)；激光粒徑儀(3000HS型，英國(guó)Malvern公司)；透射電鏡(JEM-2100型，日本EILL公司)；超聲細(xì)胞破碎儀(SFX型，美國(guó)艾默生公司)。

1.2藥品與試劑 秋水仙堿 (COL，西安山川生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：101176-201001，含量：98%)；大豆卵磷脂 (上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：K1915226，含量>98%)；脫氧膽酸鈉 (上海麥克林生化科技股份有限公司，批號(hào)：C11584234，含量：98%)；乙醇 (色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；甲醇 (色譜純，F(xiàn)isher公司)；超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1秋水仙堿含量測(cè)定

2.1.1色譜條件 Unitaryl C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(60：40) ；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL[18]。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱(chēng)取COL對(duì)照品5 mg，置于10 mL量瓶?jī)?nèi)，用甲醇配制COL對(duì)照品儲(chǔ)備液(500 μg·mL-1)。依次加入甲醇稀釋到濃度為1.00，2.00，5.00，10.00，20.00，50.00，100.0，200.0，500.0 μg·mL-1的一系列COL對(duì)照品溶液。以濃度(X)對(duì)峰面積(Y)進(jìn)行線性回歸，線性方程為Y=0.601 6X-0.115 9(R2=0.999 7)。該結(jié)果表明在1～500 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)峰面積和濃度呈良好的線性關(guān)系。日內(nèi)精密度RSD為0.29%，日間精密度RSD為0.08%，平均回收率為(98.87±0.11)%，符合含量測(cè)定要求。

2.2COL-TEs的制備 精密稱(chēng)取適量大豆卵磷脂，脫氧膽酸鈉于4 mL乙醇中，混合置于錐形瓶當(dāng)中，加熱溶解。將10 mg的COL加入到水6 mL中形成水相，用注射器將含有COL的水相緩慢注入到錐形瓶中，保持50 ℃恒溫，1300 r·min-1攪拌30 min，探頭超聲(超聲5 s，停5 s，振幅25%，5 min)，過(guò)篩孔內(nèi)徑0.22 μm濾膜即得。

2.3包封率測(cè)定

2.3.1方法回收率 精密制備低、中、高濃度(0.1，0.5，1.0 mg·mL-1)的COL溶液，分別取適量于超濾管中離心(4000 r·min-1，30 min)，收集續(xù)濾液，將超濾前后藥物溶液進(jìn)樣分析，計(jì)算游離藥物回收率。COL的回收率>95%，符合要求，見(jiàn)表1。

表1 COL的回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.2加樣回收率 精密取COL適量加至空白醇傳遞體中，使COL的濃度分別為0.1，0.5，1.0 mg·mL-1，分別取適量于超濾管中離心(4000 r·min-1，30 min)，收集續(xù)濾液，將超濾前后藥物溶液進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。COL的加樣回收率>95%，符合醇傳遞體包封率測(cè)定方法的要求，見(jiàn)表2。

表2 加空白醇傳遞體后COL的回收率

2.3.3包封率測(cè)定方法 精密量取COL-TEs適量置于超濾離心管中，離心(4000 r·min-1，30 min)后取外管液體用甲醇定容至10 mL，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定秋水仙堿含量記為W1。取同體積COL-TEs甲醇定容至10 mL，超聲破乳，按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件測(cè)定秋水仙堿含量記為W2。計(jì)算包封率，包封率(%)=(W2-W1)/W2×100。

2.4粒徑、PDI和Zeta電位測(cè)定 移取適量COL-TEs到樣品池中，利用激光粒徑儀對(duì)其進(jìn)行粒徑、分散系數(shù)(PDI)和Zeta電位的檢測(cè)。

2.5工藝優(yōu)化

2.5.1因素水平表的確定 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定溫度為50 ℃，轉(zhuǎn)速為1300 r·min-1，攪拌時(shí)間為30 min。選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)影響較大的因素進(jìn)行BBD優(yōu)化。以卵磷脂用量(A)、脫氧膽酸鈉用量(B)、乙醇體積(C)為考察因素，以粒徑、PDI、Zeta電位和包封率為指標(biāo)，采用BBD對(duì)COL-TEs處方進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見(jiàn)表3。

表3 因素和水平設(shè)計(jì)

2.5.2信息熵法對(duì)數(shù)據(jù)的分析 信息論里，度量不確定性用熵表示。為了消除人為因素的影響，在確定評(píng)價(jià)指標(biāo)權(quán)重時(shí)采用了客觀熵權(quán)法。運(yùn)用熵權(quán)法，將每個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)視為一個(gè)隨機(jī)變量，計(jì)算該指標(biāo)的熵權(quán)系數(shù)，其取值變異程度越大，越無(wú)序，信息量提供的就越多，該指標(biāo)就越重要；反之亦然。因此，熵權(quán)法是更為客觀的一種賦權(quán)法[19-20]。用熵權(quán)法分配權(quán)重的計(jì)算步驟如下。

①指標(biāo)歸一化處理：設(shè)m個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)n個(gè)評(píng)價(jià)對(duì)象的原始數(shù)據(jù)矩陣為X=(aij)mn，對(duì)其歸一化后得到X'=(xij)mn，對(duì)正向指標(biāo)而言，用以下公式進(jìn)行歸一化。

X'ij=(aij-minj{aij{)/maxj{aij}-minj {aij})，X'ij表示第 i 次實(shí)驗(yàn)時(shí)第j個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的取值，i=1，2，3，…，m；j=1，2，3，…，n。

②將原始數(shù)據(jù)陣(aij)mn轉(zhuǎn)換為概率矩陣(Pij)mn；在信息熵公式中 Pi 為某個(gè)信息的概率，滿(mǎn)足0≤Pi≤1，因此必須先對(duì)矩陣(aij)mn做歸一化處理，經(jīng)處理后的矩陣可視為評(píng)價(jià)指標(biāo)的概率矩陣。其中Pij表示第j次實(shí)驗(yàn)在第i個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)下的概率。

③計(jì)算指標(biāo)的熵值，確定第i個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的信息熵(Hi)。

④計(jì)算指標(biāo)的熵權(quán)系數(shù)(Wj)。

經(jīng)過(guò)計(jì)算，得到各指標(biāo)熵值和權(quán)重系數(shù)，見(jiàn)表4。

表4 各指標(biāo)熵值及權(quán)重系數(shù)

2.5.3實(shí)驗(yàn)安排 根據(jù)因素水平表，選擇優(yōu)化方法，根據(jù)實(shí)驗(yàn)隨機(jī)安排進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用Design-Expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合分析，得到卵磷脂用量(A)、脫氧膽酸鈉用量(B)、乙醇體積(C)與綜合評(píng)分(Y)之間的模型方程。對(duì)綜合評(píng)分值模型進(jìn)行方差分析。

BBD的方案及綜合評(píng)分的結(jié)果見(jiàn)表5。利用軟件對(duì)表5中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合分析，得到A、B、C與Y之間的二次多元回歸模型方程：Y=0.041 610 6+0.010 574 1A+0.007 182 37B+0.010 803 1C-0.003 834 08AB+0.012 226 4AC+0.006 103 34A2+0.003 906 19B2+0.026 567 9C2，以綜合評(píng)分值模型進(jìn)行方差分析，方程決定系數(shù)，R2=0.780 1。

表5 BBD-響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與結(jié)果

方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。模型的P<0.05，可信度高，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型擬合度較好且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以對(duì)不同條件下的目標(biāo)指標(biāo)進(jìn)行預(yù)測(cè)，因此該模型可用于處方的篩選與預(yù)測(cè)。

表6 方差分析結(jié)果

2.5.4效應(yīng)面優(yōu)化 根據(jù)擬合的模型，采用Design-Expert軟件生成綜合評(píng)分值隨因素變化的三維曲面圖和等高線圖。等高線圖和三維圖能夠預(yù)測(cè)和檢驗(yàn)各因素與綜合評(píng)分之間的關(guān)系。由圖1可知，AB、AC的等高線呈橢圓形，說(shuō)明卵磷脂和脫氧膽酸鈉、卵磷脂和乙醇兩者之間的交互作用明顯，說(shuō)明AB、AC的交互作用對(duì)綜合評(píng)分影響較大。

圖1 不同因素對(duì)綜合評(píng)分值影響的等高線圖與響應(yīng)面圖

2.5.5COL-TEs最優(yōu)處方的驗(yàn)證 結(jié)合二次回歸方程，求解得到最佳處方為卵磷脂500 mg，脫氧膽酸鈉50 mg，乙醇4 mL(綜合評(píng)分預(yù)測(cè)值0.115)。在該工藝下平行實(shí)驗(yàn)3次，測(cè)定指標(biāo)包封率、電位、PDI和粒徑，見(jiàn)圖2和圖3。實(shí)測(cè)包封率分別是60.99%，60.6%，59.12%；粒徑分別是151，112.8，116.7 nm；Zeta電位分別是-14.5，-16，-16.9 mV；PDI分別是0.205，0.211，0.262。對(duì)應(yīng)的綜合評(píng)分分別是0.106 2，0.108 8和0.107 4，與預(yù)測(cè)值的RSD為3.39%，證明該工藝穩(wěn)定可靠。

圖2 COL-TEs的粒徑分布圖

圖3 COL-TEs的Zeta電位圖

2.5.6COL-TEs形態(tài)考察 吸取適量最優(yōu)處方樣品滴于銅網(wǎng)上，10 min后用濾紙沿邊緣吸干，然后用2%磷鎢酸進(jìn)行染色，放置6 min，待其風(fēng)干后，用透射電鏡觀察最優(yōu)處方下COL-TEs的形態(tài)，見(jiàn)圖4，可以看出，最優(yōu)處方下的COL-TEs呈類(lèi)球形，且互相沒(méi)有粘附，分布均勻，大小均一，說(shuō)明制得的最優(yōu)處方分散性良好。

圖4 COL-TEs的透射電鏡圖

3 討論

秋水仙堿既可以溶于水也可以溶于乙醇，所以測(cè)定包封率的時(shí)候用超濾離心管進(jìn)行測(cè)定，避免分離方法對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響[21]。由于秋水仙堿的溶解性，導(dǎo)致其在脂質(zhì)載體中的包封率不高[22]，所以本研究除了將COL-TEs的一些基礎(chǔ)的表征(粒徑、電位和PDI)作為考察指標(biāo)，同時(shí)也將包封率作為研究指標(biāo)。當(dāng)同時(shí)選取多個(gè)指標(biāo)的時(shí)候，需要單獨(dú)對(duì)每個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分析，無(wú)法避免人為主觀因素的介入[23]。有研究用主觀賦權(quán)的方法將2個(gè)指標(biāo)分配權(quán)重，得到一個(gè)綜合評(píng)分，從而進(jìn)行處方的篩選[24]。但當(dāng)考察因素超過(guò)2個(gè)時(shí)，這樣的賦權(quán)方式不客觀。本文為了避免人為因素的影響，利用客觀熵權(quán)法獲得評(píng)價(jià)指標(biāo)的權(quán)重。該法可以根據(jù)每個(gè)指標(biāo)的熵權(quán)系數(shù)的取值變異程度來(lái)判斷指標(biāo)的重要程度。經(jīng)過(guò)其處理，包封率的權(quán)重最大，電位次之，粒徑和PDI相差不大，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)得出包封率的結(jié)果變異程度高，是4個(gè)指標(biāo)中最重要的指標(biāo)，粒徑和PDI隨考察因素的改變而變化不大，所以分配的權(quán)重不高。利用個(gè)人經(jīng)驗(yàn)賦權(quán)常常會(huì)使實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)偏差，運(yùn)用熵權(quán)法計(jì)算各指標(biāo)的權(quán)重，結(jié)果更合理可靠。根據(jù)擬合方程優(yōu)選工藝條件，由此制備的COL-TEs測(cè)量值與預(yù)測(cè)值偏差較小，相關(guān)性好，BBD結(jié)合熵權(quán)法為篩選出最優(yōu)的處方提供了可靠的數(shù)據(jù)。優(yōu)化后所制得的COL-TEs大小均一，分布均勻，電位穩(wěn)定，包封率優(yōu)于主動(dòng)載藥的秋水仙堿脂質(zhì)體[25]和醇質(zhì)體[26]，滿(mǎn)足用于透皮給藥TEs的要求。目前，國(guó)內(nèi)使用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法結(jié)合熵權(quán)法多用于中藥提取工藝[27]和提取物干燥工藝優(yōu)化[28-29]?；诖?，BBD結(jié)合熵權(quán)法可以為同類(lèi)型的制劑處方篩選提供參考依據(jù)，適合需要考察多個(gè)指標(biāo)的制備工藝的選擇。